第二节　血液一般检验

实验二　红细胞计数

【实验目的】掌握红细胞计数（red blood cell count，RBC）显微镜法的原理及操作方法。

【实验原理】用等渗稀释液将血液以一定倍数稀释并充入计数池，在显微镜下计数一定区域内的红细胞数量，经换算得出每升血液中的红细胞数量。

【实验材料】

1.器材　显微镜、改良牛鲍计数板、盖玻片、绸布；试管架、试管、刻度吸管、微量吸管、玻璃棒；一次性消毒采血针、消毒棉球、干脱脂棉。

2.试剂　生理盐水、红细胞稀释液（氯化钠1.0g，结晶硫酸钠5.0g或无水硫酸钠2.5g，氯化汞0.5g，蒸馏水加至200mL，溶解后加20g/L伊红溶液1滴，过滤后使用）。

3.标本　EDTA-K2抗凝静脉血或末梢血。

【实验操作】

1.加稀释液　取试管1支，加红细胞稀释液2mL。

2.采血与加血　用清洁、干燥微量吸管采集毛细血管血或新鲜全血10µL，擦净试管外余血，轻轻加至红细胞稀释液底部，再轻吸上清液漱洗吸管2～3次，以洗净管腔内残留血液，立即混匀，制成红细胞悬液。

3.充池　采用推式法，在改良牛鲍计数板上加盖玻片，充分混匀后用微量吸管或玻璃棒将红细胞悬液充入计数池，室温下平放3～5分钟，待细胞下沉后于显微镜下计数。

4.计数　在显微镜下用高倍镜依次计数中央大方格内4角和正中5个中方格内的红细胞数。

5.计算

注：N表示5个中方格内红细胞数；表示将5个中方格内红细胞换算成1个大方格红细胞数；×10表示将1个大方格红细胞数换算成1µL血液内红细胞数；×200表示血液的稀释倍数；×106表示由1µL换算成1L。

【参考区间】成年男性：（4.3～5.8）×1012/L；成年女性：（3.8～5.1）×1012/L；新生儿：（6.0～7.0）×1012/L。

【临床意义】

1.RBC增多　生理性增多主要见于缺氧；病理性增多主要见于血液浓缩（相对增多）及真性红细胞增多症（绝对增多）等。

2.RBC减少

（1）生理性减少　常见于三类人群，如生长发育过快的婴幼儿、血容量增加的妊娠中后期孕妇、造血功能减退的老年人等。

（2）病理性减少　常见于各种贫血。①红细胞生成减少：骨髓造血功能障碍，如再生障碍性贫血、骨髓纤维化等；造血物质缺乏或利用障碍，如缺铁性贫血、铁粒幼细胞贫血、巨幼细胞贫血等；慢性病，如慢性肾病等。②红细胞丢失过多：见于各种急慢性失血，如手术或创伤性失血、消化性溃疡、寄生虫病等。③红细胞破坏过多：如溶血性贫血、遗传性球形细胞增多症、阵发性睡眠性血红蛋白尿等。此外，某些药物可引起贫血。

【注意事项】

1.采血　成人以左手无名指指腹内侧，如采血部位不当（局部水肿、炎症、发绀、冻疮等）均可影响检测结果；采血不能过度挤压，针刺深度必须适当，速度不应过慢，否则容易造成血内有凝块，导致细胞分布不均，计数减少。

2.稀释　稀释液要过滤，以免杂质、微粒混入被误认为是细胞；稀释液或血液加样量不准确及吸血时吸管内有气泡，未擦去吸管外余血，血液加入稀释液后，吸管儿带出部分稀释血液或稀释液放置时间过长，蒸发浓缩等均可造成稀释倍数不准确。

3.充池　充池前应将细胞悬液充分混匀，要防止剧烈震荡而破坏红细胞，并要一次性将细胞悬液充入计数池，防止产生气泡、充液过多或过少等。如红细胞悬液未混匀、充液过多或过少、断续充液、计数池内有气泡、充液后盖玻片移动、操作平台不平等，均可造成红细胞分布不均。充入的细胞悬液量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜。

4.计数　大小方格内压线细胞的计算遵循数上不数下、数左不数右的原则，避免漏数或重复计数；红细胞在计数池中，若分布不均或2次红细胞计数相差超过变异百分数的5%，要重新充池计数。

5.器材　所用器材均需清洁干燥；改良牛鲍计数板、盖玻片、刻度吸管、微量吸管均应符合质量要求，并经严格校准方可使用。

6.稀释液　红细胞稀释液应等渗、新鲜、无杂质。

【思考题】

1.简述红细胞计数的影响因素。

2.如何排除红细胞计数的误差？

（周艳丽）

实验三　血红蛋白测定

【实验目的】掌握氰化高铁血红蛋白（hemoglobin cyanide，HiCN）法检测血红蛋白（hemoglobin，Hb）的原理及操作方法。

【实验原理】在HiCN转化液中，红细胞被溶血剂破坏，各种血红蛋白（SHb除外）中的Fe2+被高铁氰化钾氧化成Fe3+，形成的高铁血红蛋白（Hi）与氰化钾提供的氰根离子（CN-）结合成稳定的复合物HiCN。棕红色的HiCN在波长540nm处有吸收峰。用分光光度计测定该处的吸光度，再换算成每升血液中的血红蛋白浓度，或用HiCN参考液进行比色法测定，制作标准曲线供查阅。

【实验材料】

1.器材　采血用具、微量吸管、乳胶吸头、干脱脂棉、试管架、试管、5mL吸管、吸耳球、分光光度计。

2.试剂　HiCN转化液（文齐液）：氰化钾（KCN）0.050g，高铁氰化钾［K3Fe（CN）6］0.200g，无水磷酸二氢钾（KH2PO4）0.140g，TritonX-100 1.0mL，蒸馏水加至1000mL，纠正pH值至7.0～7.4；标准HiCN参考液（200g/L商品试剂）。

3.标本　EDTA-K2抗凝静脉血或末梢血。

【实验操作】

1.直接定量测定法

（1）加转换液　将5mL HiCN转化液加入试管内。

（2）采血与转化　取全血20µL，加到盛有转化液的试管底部。用上清液反复清洗吸管3次，充分混匀血液与转化液，静置5分钟。

（3）测定吸光度　用符合WHO标准的分光光度计（常规测定时带宽应＜6nm），在波长540nm处，光径（比色杯内径）为1.000cm时，以HiCN转化液或蒸馏水调零，测定标本的吸光度（A）。

（4）计算

注：式中A为540nm处测定的标本吸光度；64458为血红蛋白平均分子量；44000为血红蛋白毫摩尔消光系数；251为稀释倍数。

2.参考液比色法测定　采用直接定量测定法的先决条件是分光必须符合标准，在没有符合WHO标准的分光光度计的情况下，可用HiCN参考液绘制标准曲线间接查出Hb，或求出换算常数（K）值，间接计算出Hb。

（1）按“直接定量测定法”测定标本的吸光度（A）。

（2）测定HiCN参考液的吸光度，将参考液倍比稀释为50g/L、100g/L、150g/L、200g/L四种血红蛋白浓度，在所用的分光光度计540nm处，分别测定各稀释液的吸光度。举例，吸光度测定值分别为0.13、0.27、0.41、0.54。

（3）绘制标准曲线及查出待测标本的血红蛋白浓度：以参考液Hb（g/L）为横坐标，吸光度测定值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，通过标准曲线查出待测标本的血红蛋白浓度Hb（g/L）。

（4）也可以先求出换算常数K值，再计算血红蛋白浓度。

【参考区间】成年男性：130～175g/L；成年女性：115～150g/L；新生儿：180～190g/L。

【临床意义】血红蛋白测定的临床意义与红细胞计数相似，但贫血程度的判断优于红细胞计数。在某些贫血中，红细胞和血红蛋白减少程度可不一致，故同时测定红细胞和血红蛋白对诊断更有意义。

【注意事项】

1.分光光度计校正　若用分光光度计做精密度定量测定，分光光度计的波长和吸光度需要校正，带宽应＜1nm，比色杯光径1.000cm，允许误差为0.5%（即0.995～1.005cm），测定温度为20～25℃。

2.HiCN转化液

（1）配制　以蒸馏水配制，pH值稳定在7.0～7.4，滤纸过滤后应为淡黄色透明溶液。用蒸馏水调零，比色杯光径1cm，波长540nm处的吸光度应＜0.001。试剂应储存于棕色有塞玻璃瓶中，不能储存在塑料瓶中，因CN-会丢失，导致测定结果偏低。试剂在4℃冰箱内可保存数月，如变绿或浑浊则不能使用。不能在0℃以下保存，因为结冰可引起高铁氰化钾还原，使转化液褪色失效。

（2）浑浊　HiCN转化液是一种低离子强度而pH接近中性的溶液。遇到白细胞过多或异常球蛋白增高的血液标本时转换液会出现浑浊。若因白细胞过多引起浑浊，可离心后取上清液比色；若因球蛋白异常增高引起浑浊，可在转换液中加入少许固体氯化钠0.25g或碳酸钾0.1g，混匀后可使溶液澄清。

（3）氰化钾　HiCN转化液中氰化钾是剧毒品，要按剧毒品管理程序操作。配制好的HiCN转化液中因氰化钾含量低，又有高铁氰化钾存在，毒性不大，但仍应妥善保管。废液不能与酸性溶液混合，防治氰化钾遇酸产生剧毒的氰氢酸气体。废液要集中于广口瓶中，按每升HiCN废液加次氯酸钠溶液40mL，充分混匀，敞开容器至室温3小时以上，待CN-氧化成CO2和N2挥发后再排入下水道。

（4）HbCO　HbCO转换为HiCN的速度缓慢，有时可达数小时，故可延长转换时间或加大试剂中K3Fe（CN）6的用量。

3.HiCN参考液　若采用HiCN参考液比色法测定，参考液应做以下纯度检查。

（1）波长：450～750nm的吸收光谱曲线形态应符合文献所述，即波峰在540nm，波谷在504nm；540nm/504nm的吸光度比应为1.59～1.63。

（2）用HiCN试剂作空白，波长710～800nm处，比色杯光径1.000cm时，吸光度应＜0.002。

4.其他

（1）引起测定值增高的常见误差：转换液的稀释倍数不准确；红细胞溶解不当；血浆中脂质或蛋白量增加；白细胞计数＞20×109/L；血小板计数＞700×109/L。

（2）应定期检查标准曲线和换算常数K值，并与所用的分光光度计相配。理论上，吸光度与血红蛋白浓度呈线性关系，故标准曲线应为从坐标原点出发的一条直线。

（3）加量液须准确，标准微量吸管必须经过水银称重法校正。

【思考题】

1.影响血红蛋白测定的因素有哪些？如何进行质量控制？

2.HiCN转化液在使用过程中应注意的问题有哪些？

（周艳丽）

实验四　白细胞计数

【实验目的】掌握白细胞计数（white blood cell count，WBC）显微镜法的原理及操作方法。

【实验原理】用白细胞稀释液将血液稀释一定的倍数，同时破坏溶解红细胞，将稀释的血液充入改良牛鲍血细胞计数板的计数室，在显微镜下计数一定区域内的白细胞数量，经换算求出每升血液中的白细胞数量。

【实验材料】

1.器材　显微镜、改良牛鲍计数板、盖玻片、绸布；试管架、试管、刻度吸管、微量吸管、玻璃棒；一次性消毒采血针、消毒棉球、干脱脂棉。

2.试剂　白细胞稀释液：2%冰乙酸溶液中加入10g/L结晶紫（或亚甲蓝）3滴，混匀过滤后备用。

3.标本　EDTA-K2抗凝静脉血或末梢血。

【实验操作】

1.加稀释液　用吸管吸取白细胞稀释液0.38mL于小试管中。

2.采血与加血　用微量吸管吸取抗凝全血或末梢血20µL，擦去管尖外部余血。将吸管插入小试管中白细胞稀释液的底部，轻轻放出血液，并吸取上层清液漱洗吸管2～3次。将试管中的血液与稀释液混匀，待细胞悬液完全变为棕褐色备用。

3.充池　采用推式法，在改良牛鲍计数板上加盖玻片。再次将小试管中的细胞悬液混匀，用微量吸管取细胞悬液，充入改良牛鲍血细胞计数板的计数室中，室温下静置2～3分钟，待白细胞完全下沉后进行计数。

4.计数　在显微镜下用低倍镜计数四角4个大方格内的白细胞总数。

5.计算

注：N表示4个大方格内白细胞数；÷4表示每个大方格内白细胞数；×10表示将1个大方格白细胞数换算成1µL血液内白细胞数；×20表示血液的稀释倍数；×106表示由1µL换算成1L。

【参考区间】成年男性：（3.5～9.5）×109/L；新生儿：（15～20）×109/L；儿童：（5～12）×109/L。

【临床意义】

1.生理性变化　不同时间和不同状态可出现生理性变化，如下午较上午高，餐后较餐前高，剧烈运动、情绪激动时较安静状态下高，月经期、妊娠期、分娩、哺乳期亦可增高，新生儿及婴儿明显高于成人，吸烟亦可引起白细胞增高。

2.病理性增多　①感染：多数细菌感染，特别是革兰阳性球菌感染；少数病毒感染，如乙型脑炎病毒等。②组织损伤：如严重外伤、大手术、大面积烧伤、急性心肌梗死等。③急性大出血、溶血：如肝、脾破裂，宫外孕破裂等。④中毒：如铅、汞等金属中毒；糖尿病酮症酸中毒等代谢性中毒。⑤恶性肿瘤：白血病、各种癌症等。

3.病理性减少　①某些感染：如多数病毒、少数细菌、某些原虫感染。②某些血液病：如再生障碍性贫血、急性粒细胞缺乏症等。③某些自身免疫性疾病：如系统性红斑狼疮等。④某些药物理化因素：如肿瘤化疗，电离辐射，氯霉素、磺胺类等药物反应。⑤脾功能亢进等。

【注意事项】

1.采血　采血不能过度挤压，以免组织液混入。针刺深度必须适当，一般在2～3mm；速度要快，否则容易造成血内有凝块。新鲜全血或末梢血，血液标本与抗凝剂应充分混匀，避免产生溶血或小凝块。

2.稀释　稀释液要过滤，以免杂质、微粒混入，取血量和稀释倍数要准确。

3.充池　标本采集到检测的时间间隔应不超过4小时，在18～22℃直接检测。充池前应适当用力快速振荡白细胞悬液30秒，将白细胞悬液充分混匀，但要防止产生气泡。如白细胞悬液未混匀、充液过多或过少、断续充液、计数室内有气泡儿、充液后盖玻片移动、操作平台不平等，均可造成细胞分布不均，细胞计数不准确。

4.计数　大小方格内压线细胞的计算遵循数上不数下、数左不数右的原则，避免漏数或重复计数；白细胞总数在正常范围内时，各大方格间的细胞数相差不得超过8个以上，2次重复计数差不超过10%，否则应重新充池计数。

5.器材　所用器材均需清洁干燥；改良牛鲍计数板、盖玻片、刻度吸管、微量吸管均应符合质量要求，并经严格校准方可使用。

6.稀释液　必须采用合格检测试剂。

【思考题】有核红细胞对白细胞计数有何影响？

（周艳丽）

实验五　白细胞分类计数

【实验目的】掌握外周血白细胞分类计数（differential count，DC）显微镜法的原理与操作方法及各种白细胞的正常形态。

【实验原理】将血液制成细胞分布均匀的血涂片，用Wright染液染色。根据各类细胞的形态特点和颜色差异，区分各类白细胞并进行计数。通常分类100个白细胞，计算得出各种白细胞所占的百分率。

【实验材料】

1.器材　显微镜、分类计数器、香柏油、拭镜纸。

2.试剂　Wright染液、磷酸盐缓冲液（pH值6.4～6.8）、清洁液（乙醚与无水乙醇比例为3∶7）。

3.标本　制备良好的血涂片。

【实验操作】

1.染色　将血涂片用Wright染液染色，冲洗干净，自然干燥后待用。

2.低倍镜观察　低倍镜下观察全片，包括白细胞的分布和染色情况。

3.油镜观察　选择血涂片体、尾交界处细胞分布均匀，着色良好的区域滴加香柏油1滴，按一定的方向顺序对所见到的每一个白细胞进行分类，并用白细胞分类计数器做好记录，共计数100个白细胞。

4.计算　求出各类细胞所占的百分率，用各类白细胞所占百分率乘以白细胞总数，即可得出每升血液中各类白细胞数量的绝对值。

【参考区间】正常成人外周血DC参考区间，见表1-1。

【临床意义】

1.中性粒细胞　因中性粒细胞在白细胞中所占百分比最高，中性粒细胞与白细胞总数变化的临床意义通常基本一致。

2.嗜酸性粒细胞　病理性增多主要见于超敏反应性疾病、寄生虫病和某些皮肤病，也可见于某些恶性肿瘤等。病理性减少多见于伤寒、副伤寒、大手术后及长期应用肾上腺皮质激素等。

3.嗜碱性粒细胞　增多可见于超敏反应性疾病、慢性粒细胞白血病等。减少多无临床意义。

4.淋巴细胞　生理性增多见于婴幼儿。病理性增多见于病毒感染性疾病、结核病及淋巴细胞性血液病等。减少多见于某些免疫缺陷病及自身免疫性疾病等。

5.单核细胞　生理性增多见于儿童。病理性增多见于某些感染性疾病和某些血液病。单核细胞减少意义不大。

【注意事项】

1.血涂片　制备普遍采用传统的楔形法制备血涂片，即合格的血涂片为3cm×2cm的楔形，表面光滑，两边留有小于0.3cm的空隙，中间有1.0～1.5cm的阅片区。染色后的细胞色彩鲜明，能显示出各种细胞特有的色彩，细胞核结构和细胞质颗粒清楚。

2.计数　采用低倍镜观察血涂片的染色质量及细胞分布情况，注意血涂片边缘及尾部有无巨大的异常细胞及寄生虫等。区域：由于各种白细胞体积大小不等，体积较小的淋巴细胞在血涂片的头、体部分比较多，而尾部和两侧以中性粒细胞和单核细胞较多，因此分类最佳区域为体、尾交接处或片头至片尾的3/4区域。分类规律：分类时要按一定方向、有规律地移动视野，以“城垛式”连续进行，避免重复、遗漏，不能主观选择视野，因为血涂片边缘的大细胞偏多，无代表性，故应避免分类血涂片边缘的细胞。

3.分类计数　DC的精确性与分类计数的细胞数量有关，被计数的白细胞占总计数白细胞的比例越大，误差就越小，为兼顾临床的工作效率，分类计数白细胞数量可根据白细胞总数而定。白细胞总数为（3.0～15）×109/L时，分类计数100个白细胞；总数＞15×109/L时，应计数200个白细胞；总数低于3.0×109/L时，则应选择两张血涂片计数50～100个白细胞。

4.影响因素　分类计数中发现幼稚白细胞应分类计数并报告，记录在白细胞比值和百分比中；见到幼稚红细胞，应逐个计数，但不计入100个白细胞内，而以分类100个白细胞时，见到幼稚红细胞数量来报告（X∶100），并注明其所属阶段；若发现异型淋巴细胞，应计算和报告；破坏细胞，如仍能清晰辨认，如嗜酸性粒细胞也应计入，无法辨认的破坏细胞，如涂抹细胞或蓝细胞，则作为其他报告；应注意成熟红细胞和血小板的形态、染色及分布情况，注意有无寄生虫及其他异常情况。

【思考题】显微镜法白细胞分类计数对血涂片的要求有哪些？

（周艳丽）

实验六　血小板计数

【实验目的】掌握血小板计数（platelet count，PLT/PC）显微镜法的原理及操作方法。

【实验原理】血液经血小板稀释液按一定比例稀释和破坏红细胞后，充入改良牛鲍血细胞计数板的计数室内，在显微镜下计数一定区域内的血小板数量，经过换算后求出每升血液中血小板的数量。

【实验材料】

1.器材　显微镜、牛鲍血细胞计数板、盖玻片、绸布、试管架、试管、刻度吸管、微量吸管、玻璃棒、采血针、消毒棉球、干脱脂棉。

2.试剂　10g/L草酸铵稀释液：草酸铵10g，EDTA-Na2 0.12g溶于1000mL蒸馏水中，充分混匀。

3.标本　EDTA-K2抗凝静脉血或末梢血。

【实验操作】

1.加稀释液　吸取草酸铵稀释液0.38mL置于清洁小试管中。

2.采血与稀释　常规消毒无名指，穿刺后让血液自然流出，准确采血20µL（或EDTA-K2抗凝静脉血），置于含有草酸铵的稀释液中，立即充分混匀，待完全溶血后再混匀1分钟。

3.充液与静置　采用推式法，在改良牛鲍计数板上加盖玻片。轻轻摇动血小板悬液2分钟或200次以上使其充分混匀，取混匀的血小板悬液1滴充入计数室内，室温静置10～15分钟，使血小板充分下沉。

4.计数　用高倍镜计数中央大方格的四角和中央共5个中方格内血小板数量。

5.计算

PLT（/L）=N×5×10×20×106=N×109

注：式中N表示5个中方格内血小板数；×5表示5个中方格内血小板数换算成1个大方格血小板数；×10表示将1个大方格血小板数换算成1µL血液内血小板数；×20表示血液的稀释倍数；×106表示由1µL换算成1L。

【参考区间】（125～350）×109/L。

【临床意义】

1.生理性变化　正常人的血小板数量随时间和生理状态而波动，一般午后高于早晨，冬季高于春季，高原地区高于平原地区，月经后高于月经前，妊娠中晚期增高，运动及餐后增高。小儿出血时血小板略低，两周后显著增加，半年内可达到成人水平。

2.病理性减少　①血小板生成障碍：如再生障碍性贫血、急性白血病、急性放射病等；②血小板破坏增多：如原发性血小板减少性紫癜、脾功能亢进等；③血小板消耗过多：如弥漫性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜等；④血小板分布异常。

3.病理性增多　原发性增多主要见于原发性血小板增多症、慢性粒细胞性白血病、真性红细胞增多症等；反应性增多主要见于急性化脓性感染、急性大失血、急性溶血、肿瘤、外科手术等。

【注意事项】

1.器材　所用器材必须干燥、清洁且经过校准。

2.患者　检查前应避免服用阿司匹林及其他抗血小板药物。

3.稀释液　草酸铵必须是分析纯（AR）或优级纯（GR）试剂，如用化学试剂溶血效果差；应定期检查稀释液质量，草酸铵稀释液要清洁、无菌、无杂质污染，检测前应先做稀释液空白计数，计数值为零方可使用，如存放时间较长应过滤后再使用。

4.采血　皮肤采血时，针刺深度为3mm，保证血流通畅，拭去第一滴血后立即采血，以防止血小板聚集和破坏。如果同时做白细胞和血小板计数，应先做血小板计数。

5.血小板悬液制备　血液加入血小板稀释液内要充分混匀，但不可过度振荡，以免引起血小板破坏、聚集或产生气泡，影响计数。

6.充池　血小板悬液充入计数室要静置10～15分钟，使血小板完全下沉后再计数；注意保湿，如空气干燥，应将血细胞计数板置于湿盒内，以免水分蒸发影响计数结果；血小板如成簇分布，应重新采血复查；溶血欠佳时应更换稀释液或用200倍稀释法计算中间大方格内的全部血小板数，最后计算出每升血液中的血小板数量。

7.计数　计数时光线不可太强，注意微有折光性的血小板与尘埃的鉴别。注意附着在血细胞旁的血小板，不要漏数。如果血小板悬液充入计数室时间较长，血小板会失去光泽而不容易辨认，因此应在1小时内计数完毕，否则结果偏低。每份标本最好计数2次，若计数之差在10%以内，取其平均值报告；若计数值差＞10%，则应做第3次计数，取两次相近结果的均值报告。

8.结果分析　血小板聚集或凝集、异常蛋白血症、巨大血小板、卫星现象、高脂血症等可导致血小板假性减少；含HbH包涵体的红细胞碎片、慢性淋巴细胞白血病患者的淋巴细胞核、细胞质碎片、小红细胞等被误认为血小板，导致血小板假性增多。

【思考题】

1.哪些因素可致血小板假性增多或减少？

2.计数过程中应怎样保证结果准确？

（周艳丽）

实验七　网织红细胞计数

（一）试管法

【实验目的】掌握网织红细胞计数（reticulocyte count，Ret）试管法的原理和操作方法。

【实验原理】网织红细胞胞质内残存少量核蛋白体和核糖核酸（RNA）等嗜碱性物质，经煌焦油蓝或新亚甲蓝等染液活体染色后呈蓝色网织状或点粒状，可与完全成熟的红细胞区别，在显微镜下计数一定数量红细胞中的网织红细胞。

【实验材料】

1.器材　显微镜、香柏油、拭镜纸、清洁液；试管、试管架、玻片、Miller窥盘（厚度1mm、直径19mm的圆形玻片，玻片上刻有大小两个正方形格子，大方格B面积为小方格A的9倍）。

2.试剂　10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液：煌焦油蓝1.0g，枸橼酸三钠0.4g，氯化钠0.85g，溶于双蒸水100mL中，混匀过滤后储存于棕色试剂瓶中备用；新亚甲蓝N溶液：新亚甲蓝0.5g，草酸钾1.4g，氯化钠0.8g，蒸馏水加至100mL，过滤后储存于棕色试剂瓶中备用。

3.标本　新鲜EDTA-K2抗凝全血。

【实验操作】

1.加染液　在小试管中加入染液2滴。

2.加血染色　在加入染液试管内加入新鲜全血2滴，立即混匀，室温下放置15～20分钟。

3.制备涂片　取混匀染色血1小滴于载玻片上推制成薄血涂片，自然干燥。

4.观察　选择红细胞分布均匀、着色好的部位，在低倍镜下观察红细胞的分布和染色情况。

5.计数　常规法：在油镜下对所选部位计数至少1000个红细胞中的网织红细胞；Miller窥盘计数法：为了提高网织红细胞计数的精度和速度，国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐使用Miller窥盘，将Miller窥盘放置于接目镜内，于Miller窥盘的小方格内计数所有成熟红细胞，在大方格及小格内计数网织红细胞数。

6.计算

（1）常规法

（2）Miller窥盘计数法

（3）Ret绝对值

Ret（/L）=RBC（/L）×Ret（%）

【参考区间】成人、儿童：0.5%～1.5%；新生儿：2.0%～6.0%。成人绝对值：（24～84）×109/L。

【临床意义】

1.网织红细胞增高　表示骨髓红细胞系增生旺盛。溶血性贫血、急性失血性贫血时显著增多；缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血时轻度增加。

2.网织红细胞降低　常与骨髓造血功能降低有关，如再生障碍性贫血、白血病、骨髓纤维化等。

【注意事项】

1.染液　染液质量直接影响红细胞计数的准确性。煌焦油蓝染液溶解度低，易形成沉渣吸附于红细胞表面；新亚甲蓝是WHO推荐使用的染液，对网织红细胞染色力强且稳定，试剂应定期配置，以免变质沉淀；Wright染液复染可使网织红细胞数值偏低。

2.染色　染色时间不能过短，室温低时可放置37℃温箱或适当延长染色时间，染液与血液的比例以1∶1为宜。

3.标本　网织红细胞在体外仍可继续成熟，故其数量随着保存时间的延长而递减，所以标本采集后应及时处理，标本染色后也应及时测定，因染料吸附可人为增高网织红细胞数值。

4.观察　选择红细胞分布均匀、网织红细胞着色好的部位计数，凡含有2个以上网织颗粒的红细胞均应记为网织红细胞。由于网织红细胞体积较大，故应兼顾血涂片边缘和尾部。应注意网织红细胞与血红蛋白H包涵体的鉴别，前者为蓝绿色网织状或点粒状结构，分布不均；后者为蓝绿色圆形小体，均匀散在整个细胞内，一般在温育10～60分钟后出现。

（二）玻片法

【实验目的】掌握Ret玻片法的原理和操作方法。

【实验原理】同试管法。

【实验材料】

1.器材　显微镜、香柏油、拭镜纸、清洁液；载玻片、推片、Miller窥盘。

2.试剂　煌焦油蓝乙醇溶液：煌焦油蓝1.0g（置于乳钵中研磨），溶于95%乙醇100mL，过滤后储存于棕色试剂瓶中备用。

【实验操作】

1.加染液　在载玻片的一端加入10g/L煌焦油蓝乙醇溶液1滴，待其自然干燥后备用。

2.加血染色　取新鲜全血1滴，滴在干燥的染料上，用推片角轻轻将血滴与染料混匀，然后用另一载玻片盖在此载玻片上，使两玻片黏合，以免血液和染料干燥。

3.制备涂片　室温下放置15～20分钟，移开上层载玻片，取混匀染色血1小滴推制成血涂片。

4.观察　同试管法。

5.计数　同试管法。

6.计算　同试管法。

【参考区间】同试管法。

【注意事项】因玻片法染色时，血液中的水分容易蒸发，造成染色时间偏短，结果偏低，因此，染色过程应特别注意防止水分蒸发。

【思考题】

1.影响网织红细胞计数的因素有哪些？如何进行质量控制？

2.分组设计试管法和玻片法，并对比进行方法学评价。

（周艳丽）

实验八　红细胞沉降率测定

【实验目的】掌握魏氏法测定红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）的原理及操作方法。

【实验原理】将一定量的枸橼酸钠抗凝全血置于特定血沉管中，直立于血沉架上；由于红细胞比重大于血浆，故在离体抗凝血中能够克服血浆阻力而下沉；1小时后读取上层血浆高度的毫米数值，即为ESR。

正常情况下，红细胞因带有负电荷而相互排斥，彼此分散悬浮下沉缓慢。但在某些病理情况下，血浆中出现带正电荷较多的物质，如急性时相反应蛋白和免疫球蛋白，将中和负电荷而使红细胞聚集，形成缗钱状红细胞，表面积减少，摩擦力减小，下沉加快。此外，红细胞减少时ESR加快；球形红细胞增多时ESR减慢。

【实验材料】

1.器材　Westergren血沉管（长度300mm±1.5mm，两端相通，表面有规范刻度，无色、平头、圆柱形玻璃或塑料管，管内径2.55mm，管内均匀，误差＜5%，横轴与竖轴差＜0.1mm，外径5.5mm±0.5mm，管壁刻度200mm，误差±0.35mm，最小分度值1mm，误差＜0.2mm）；血沉架、0.5mL吸管、吸耳球、试管、试管架。

2.试剂　109mmol/L枸橼酸钠溶液：枸橼酸钠（Na3C6H5O·2H2O）32g溶于1000mL蒸馏水中。

3.标本　新鲜全血。

【实验操作】

1.采血　使用枸橼酸钠抗凝的真空采血管采集全血；在装有109mmol/L枸橼酸钠溶液0.4mL的试管中加入1.6mL静脉血，混匀。

2.吸血　将混匀全血吸入血沉管内至刻度“0”处，拭去管外余血。

3.立血沉管　将血沉管直立于血沉架上。

4.读数　1小时末准确读取红细胞下沉后露出的血浆段高度，即为红细胞沉降率。

【参考区间】男性：0～15mm/h；女性：0～20mm/h。

【临床意义】

1.生理性增快　血沉受年龄、生理时期等因素影响，12岁以下的儿童、60岁以上的高龄及妇女月经期、妊娠3个月以上可加快。

2.病理性增快　①炎症性疾病：急性炎症、慢性炎症。②组织损伤和坏死：较大组织损伤、手术创伤。③恶性肿瘤：用于鉴别良恶性肿瘤，良性肿瘤多正常，恶性肿瘤多增快。④高球蛋白血症：如多发性骨髓瘤、肝硬化、巨球蛋白血症、系统性红斑狼疮、慢性肾炎等。

【注意事项】

1.器材　魏氏血沉管应符合ICSH规定规格，血沉管、试管均应清洁干燥，以免溶血。

2.抗凝剂　使用分析纯（AR）枸橼酸钠抗凝剂，配制浓度应准确，配成后液体清晰不浑浊，无沉淀，4℃保存可用一周。如抗凝剂多，血沉加快；反之，血沉减慢。故应准确控制采血量，抗凝剂与血液比例为1∶4。

3.标本　采血应在30秒内完成，不得混入消毒剂，不能有溶血、气泡，避免形成凝块。要求在采血后3小时内完成检测，置于4℃冷藏条件下可延长检测至6小时，但测定时应将血液标本温度恢复到18～25℃。

4.影响血沉因素　有血浆因素和红细胞因素等。血浆因素包括血浆蛋白的成分与比例，血浆中脂类成分与比例；红细胞因素，包括红细胞数量、大小、厚度和形态等。

5.立血沉管　血沉架应放置平稳，不移动、不摇动、不振动，且避免阳光直射。血沉管应严格垂直放置，确保直立90°，防止血液外漏或形成气溶胶影响测定结果。如果血沉管倾斜，红细胞将沿一侧管壁下沉，血浆则沿另一侧管壁上升，因此红细胞下沉时受到的阻力减小，沉降速度可大大加快。血沉管倾斜3°时，沉降率可增加30%。

6.读数　测定室温度要求在18～25℃，且稳定在±1℃。室温过高时血沉加快，应查血沉温度校正表，进行温度校正后报告检查结果。测定时间严格控制在1小时，因红细胞沉降率在1小时内沉降过程中并不是均衡等速度地沉降，因此不能观察30分钟沉降率，将结果乘以2作为1小时血沉结果。

【思考题】

1.影响红细胞沉降率快慢的因素有哪些？

2.分析遗传性红细胞增多症、心肌梗死及心绞痛患者的红细胞沉降率有何不同。

（周艳丽）

实验九　血液分析仪的使用及结果分析

血液分析仪是临床检测应用最广泛的仪器之一，按白细胞分类功能的特点，主要有三分类与五分类两种仪器，但目前三分类血液分析仪已经逐渐被淘汰，临床上广泛应用的是五分类血液分析仪。

【实验目的】掌握五分类血液分析仪的原理、操作方法及结果分析等。

【实验原理】

1.细胞计数及体积测定（电阻抗原理）　相对于等渗的电解质溶液（稀释液），血细胞为不良导体。当血细胞通过检测器微孔时，可导致微孔两侧电极间的电阻突然增大，引起瞬间电压变化而形成脉冲信号。当细胞连续通过微孔时，就可形成一连串的脉冲信号，其多少反映细胞数量，强弱反映细胞体积。这些脉冲信号经过放大、阈值调节、甄别、整形、计数及自动控制保护系统，完成对血细胞的计数和体积测定。

2.血红蛋白测定（分光光度法）　在比色池中，被稀释的血液加入溶血剂后，红细胞溶解释放出血红蛋白，后者与溶血剂中的有关成分（大多数仪器采用十二烷基硫酸钠）结合后形成血红蛋白衍生物，在特定波长下比色，其吸光度值与血红蛋白含量成正比，经计算得出血红蛋白浓度。

3.白细胞分类计数　不同品牌和型号的血液分析仪所采用的原理各不相同，大致可分为激光散射与细胞化学法、体积电导激光散射法（VCS）、电阻抗与射频法、多角度偏振光散射法等。

4.网织红细胞计数　荧光染料能与网织红细胞内RNA结合，通过检测通道时能被特定波长的激光束激发出荧光，据此可测定网织红细胞占成熟红细胞的百分率。根据荧光强度还可将网织红细胞分为低荧光强度网织红细胞（LFR）、中荧光强度网织红细胞（MFR）和高荧光强度网织红细胞（HFR），据此可判断网织红细胞的成熟度。

【实验材料】

1.器材　全自动五分类血液分析仪。

2.试剂　仪器配套的稀释液、溶血剂、清洗液等；全血质控品。

3.标本　末梢血或EDTA-K2抗凝静脉血。

【实验操作】

1.开机　开机前检查稀释液、溶血剂和废液管的连接和通讯接口，然后开启电源，仪器开始自检和空白本底测试，通过后即可进行下一步操作。

2.质控品测定　将质控品从冰箱中取出平衡至室温后，轻轻颠倒混匀后上机检测，按照各自实验室所设定的质控规则，质控结果在控后才能进行标本的检测，否则，应查找失控原因并解决，直至质控通过。

3.样本检测　在仪器的控制界面可设置待测样本的进样模式、编号以及检测项目等，手动进样模式适合单个样本的检测，上机前需手动将标本充分混匀；自动进样模式适合批量标本的检测，仪器可自动对标本进行颠倒混匀。仪器吸样后自动完成各项测试，屏幕显示出各项参数、图形及报警信息等，若与实验室信息系统（laboratory information system，LIS）连接后还可将结果传输至LIS系统。

4.结果显示　各项检测参数和报警信息通常以列表的形式显示。图形显示根据仪器型号的不同常有差别，但常见的图形显示基本包括红细胞直方图、血小板直方图及白细胞分类计数散点图等。此外，还可有嗜碱性粒细胞散点图（WBC/BASO）、网织红细胞散点图、血小板光学法散点图（PLT-O）等。

【注意事项】

1.主要图形

（1）白细胞分类散点图　不同型号血液分析仪由于所用原理不同，形成的散点图也不完全相同。白细胞散点图可直观地显示出各类白细胞的位置和比例，正常情况下各团细胞位置适当、分界清楚，若出现异常图形通常提示可能存在异常细胞，需进一步进行涂片显微镜检查。

（2）红细胞直方图　横坐标代表红细胞体积，纵坐标代表各对应体积的红细胞出现频率。正常红细胞主要分布在50～200fL范围内，可见两个细胞群体，在50～125fL区域内有一个较狭窄的两侧基本对称的主峰，其右侧125～250fL区域为一较平坦扁阔的峰，该区域内主要为大红细胞和网织红细胞。在分析红细胞直方图时，应注意观察主峰位置、峰底宽度、有无双峰出现等，这些信息通常可提示红细胞体积大小的分布，有助于判断贫血类型及治疗效果等。

（3）血小板直方图　仪器在2～30fL内分析血小板，正常图形主要集中在2～15fL内，呈左偏态分布，应注意观察峰顶位置是否右移，峰尾是否抬高，曲线低平或不够流畅等，提示可能存在大血小板、小红细胞、PLT聚集等情况，可进一步涂片镜检。

2.复检规则　血液分析仪的检测结果只能是一种筛查手段，在实际工作中，要结合仪器检测参数、图形、报警信息、患者临床信息等情况进行综合判断，必要时涂片镜检。各实验室应参照2005年国际实验室血液学学会（ISLH）提出的41条复检规则，结合实际情况，建立各自的血常规复检规则，最大限度地减少不必要的复检数量。

3.环境条件　血液分析仪属于高精度设备，应保持合适的温度、湿度，远离电磁干扰等环境。周围留有合适的空间保证主机散热，电压应符合要求。

4.抗凝剂　推荐的血常规标本抗凝剂为EDTA-K2，但若遇到EDTA依赖性PLT聚集导致PLT假性减低的患者，可更换为枸橼酸钠抗凝剂（1∶9）检测PLT值，最终所报告的PLT值应根据抗凝剂的比例进行换算。

5.标本　应于4小时内测试完毕，置于室温，不宜于冰箱保存，低温可能使血小板计数减低。

6.质控　实验室每天应至少进行一次室内质控，并定期参加室间质评或实验室间能力比对试验。

【思考题】如何运用红细胞直方图进行贫血的类型鉴别和疗效观察分析？

（任伟宏）