第一节　血液标本采集和血涂片制备

实验一　临床检验基本技术训练

（一）血液标本采集

毛细血管采血法

【实验目的】掌握毛细血管采血（又称皮肤采血、末梢采血）法的基本操作。

【实验原理】成人手指、婴幼儿脚跟处毛细血管丰富，采血针刺破皮肤后血液流出，用微量吸管吸取所需要血量。

【实验材料】

1.器材　一次性消毒采血针、一次性微量吸管、消毒干棉球、试管、试管架、2mL吸管、吸耳球、乳胶吸头。

2.试剂　碘伏、红细胞稀释液（或生理盐水）。

【实验操作】

1.加红细胞稀释液　取试管1支，加入红细胞稀释液2mL。

2.按摩采血部位　选择采血部位后，轻轻按摩待检者待采部位，使局部组织充血。

3.消毒　皮肤用碘伏棉球消毒采血部位，待干。

4.针刺采血　操作者用左手拇指和食指固定采血部位绷紧皮肤及皮下组织，右手持一次性采血针迅速准确地刺入采血部位，立即退出采血针。

5.吸血　先用消毒干棉球拭去混有组织液的第一滴血，再待血液自然流出后，用一次性微量吸管吸血至10μL刻度，后用无菌干棉球压住伤口止血。

6.释放血液　以干棉球擦净微量吸管外部多余血液，后将微量吸管插入盛有红细胞稀释液的试管底部，慢慢排除吸管内的血液，并用上清液冲洗吸管内余血3次后排尽液体，立即混匀试管内液体。

【注意事项】

1.采血部位　成年人以左手无名指为宜，1岁以下婴幼儿通常用足拇趾或足跟内外侧采血。所选择的采血部位应皮肤完整。

2.皮肤消毒　消毒一定要待碘伏挥发干燥后采血，否则血液会四处扩散，影响采集。

3.穿刺　进出针迅速，针深一般以2～3mm为宜。

4.血流不畅　如针刺后血流不畅，可以自近心端向指尖稍微加压，促进血液流出。切勿用力挤压，以免造成组织液混入，影响结果的准确性。

5.释放血液　血液排入试管内的速度不宜过快，避免产生气泡。

6.采集血液标本的顺序　进行多个检验项目时，血液样本应依次为血小板计数、红细胞计数、血红蛋白测定、白细胞计数及制作血涂片等。

7.无菌操作　严格按无菌技术操作，防止采血部位感染；做到一人一针一管，避免交叉感染。

8.检测　标本采集后应及时测定，最好在2小时内完成，不宜冷藏。

静脉采血法

【实验目的】掌握静脉采血法的基本操作。

【实验原理】使用注射器或负压采血器刺入浅静脉后，利用负压吸取一定量的静脉血。

【实验材料】

1.器材　一次性消毒注射器或负压采血器、压脉带、消毒棉签、枕垫、试管。

2.试剂　75%乙醇和碘伏。

【实验操作】

1.准备试管　认真阅读受检者申请单，决定方法、采血量及所需试管及抗凝剂，并按顺序排列。

2.标记试管　在试管上贴上标签，注明患者姓名、项目名称、采集日期、门诊或住院号。

3.消毒双手　采血前，操作人员穿戴工作衣帽，应用肥皂或消毒液按规范洗手，戴口罩和无菌手套。

4.选择静脉　采血前，要求受检者坐在实验台前。将前臂放在实验台上，掌心向上，并在肘下放一枕垫，使上臂与前臂呈直线。卧床受检者要求前臂伸展，暴露穿刺部位。常用采血位置是肘前静脉，因其粗大、容易辨认。

5.检查注射器　打开一次性注射器包装，左手持针头下座，右手持针筒，将针头和针筒紧密连接，并使针头斜面对准针筒刻度，抽拉针栓检查有无阻塞和漏气。最后排尽注射器中的空气，将针帽盖回备用。使用前，保持针头无菌状态。

6.扎压脉带　在采血部位上端约6cm处，将压脉带绕手臂一圈打一活结，压脉带末端向上。要求患者紧握和放松拳头几次，使静脉隆起。压脉带应能减缓远端静脉血液回流，但又不能紧到压迫动脉血流。

7.选择进针部位　用左手食指选择合适进针点。

8.穿刺皮肤　先使用棉签蘸取碘伏，以入针点为中心顺时针旋转，由内向外消毒患者皮肤，范围直径5cm；再使用棉签蘸取75%乙醇同样擦拭患者皮肤，待干燥后穿刺，取下针头无菌帽，以左手拇指固定静脉穿刺部位下端，右手持注射器，食指固定针头下座；保持针头斜面和针筒刻度向上，沿静脉走向使针头与皮肤成30°角斜行快速刺入皮肤，然后成5°角向前穿破静脉壁进入静脉腔；确认穿刺入静脉中心位置，并沿着静脉走向将针头推入10～15mm。

9.抽取血液　用左手稍稍向后拉注射器针栓，见少量回血后，松开压脉带，然后向后拉针栓到达采血量刻度。若使用一次性真空采血装置，当针头进入血管后会见少量回血，松开压脉带，将真空采血管插入试管托内采血针中，因试管内负压作用，血液自动流入试管，到达采血量刻度后拔出试管混匀，多管采血重复插入真空管即可。

10.止血　嘱被检者松开拳头，用消毒棉签轻压住穿刺点，迅速拔出针头，嘱被检者继续用消毒棉签按压穿刺点5分钟。

11.放血　将血液沿试管壁缓缓注入，到达标记处。如含抗凝剂试管，需迅速轻轻混匀几次后再次核对被检者姓名和号码。

【注意事项】

1.采血前准备　采血前应向被检者耐心解释，消除不必要的疑虑和恐惧。如个别患者进针或采血后发生眩晕，应让其平卧休息。

2.准备试管　不同检查项目可根据试验需要选择不同的抗凝剂及与血液的稀释比例。

3.检查注射器　静脉采血前要仔细检查针头是否安装牢固，针筒内是否有空气和水分。抽血时针栓只能向外抽，不能向静脉内推，以免形成空气栓塞，造成严重后果。

4.选择静脉　如果肥胖患者的静脉暴露不明显，可以左手示指经碘伏消毒后，在采血部位触摸，发现静脉走向后凭手感方向与深度试探性穿刺。

5.消毒　本实验具有创伤性，必须严格无菌操作，避免感染。一人一针，皮肤消毒后不要再碰触消毒区域，每采集一位患者前，应使用碘伏消毒双手等。

6.扎压脉带　为了避免瘀血和血液浓缩，采静脉血时止血带压迫时间不能过长、绑扎不能过紧，最好不超过1分钟，否则会影响某些试验结果，如造成血红蛋白和血细胞比容增高。

7.穿刺皮肤　不能从静脉侧面进针。针头进入静脉的感觉是：皮肤有一定阻力，而静脉壁阻力较小，更富有弹性，进入血管腔有突破感，看到针头回血即穿刺成功。

8.抽血　见到回血时，针头沿静脉走向推入少许，但不可用力深刺，以免针头刺入其他组织，造成血肿。血液加入抗凝试管中应与抗凝剂充分混匀以达到抗凝目的。要防止血液标本溶血，因为溶血后标本不仅红细胞和血细胞比容减低，还会使血清（浆）化学成分发生变化。

9.止血　不能弯曲手臂，以免形成血肿。

10.放血　若含有抗凝剂，需迅速将试管轻轻颠倒6～8次，切勿震荡试管。

11.标本保存与检测　血液标本采集后应立即送检，实验室接到标本后应尽快地检查。抗凝静脉血可稳定8～12小时，如不能及时测定，应将其置于较稳定的环境中，如4℃冰箱。

【思考题】

1.造成溶血的原因有哪些？

2.静脉采血时，有哪些操作会影响采血结果？

（二）改良牛鲍计数板的使用

【实验目的】掌握改良牛鲍计数板的结构和使用方法。

【实验原理】混匀稀释的血液或体液，滴入具有固定体积和精密划分刻度的改良牛鲍计数板中，显微镜观察并计数所选择区域中的细胞数，再乘以稀释倍数，即可换算成单位体积内的细胞数。

【实验材料】

1.器材　改良牛鲍计数板、专用盖玻片、显微镜、绸布、微量吸管、带孔乳胶吸头、刻度吸管、试管、洗耳球、消毒脱脂棉。

2.试剂　红细胞稀释液、白细胞稀释液。

3.标本　毛细血管血或EDTA抗凝新鲜全血。

附：改良牛鲍计数板由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成，每块计数板由“H”形凹槽分成两个相同的计数室。计数室两侧各有一条支持柱，比计数室平面高0.10mm，将特制的专用盖玻片覆盖上，形成高0.1mm的计数室，每个计数室上面刻有一个方格网，每个方格网共分9个大方格，每格长、宽各1.0mm，面积为1.0mm2，容积为0.1mm3。其中大方格用双线划分为25个中方格，位于四角的4个大方格用单线划分为16个中方格。

红细胞和血小板的计数区域为中央大方格中的四角及中央5个中方格。白细胞的计数区域为四角4个大方格。嗜酸性粒细胞、体腔液细胞、精子的计数区域为两侧计数室四角及中央5个大方格共10个大方格。见图1-1。

【实验操作】

1.准备计数板　取洁净的改良牛鲍计数板平置于操作台上，采用“推式法”从计数板下缘向前平推盖玻片，将其盖在计数室上。

2.稀释血液　取试管2支，标明A、B，分别加白细胞稀释液0.38mL、红细胞稀释液1.99mL，再分别加血液20µL、10µL，混匀成细胞悬液。

3.充池　用微量吸管吸取或用玻璃棒蘸取已充分混匀的细胞悬液A液1滴，沿盖玻片与计数板之间的缝隙充入计数池。充液量以恰好充满一侧计数池为宜，不可过多、过少或有气泡，否则需重新操作。

4.计数　先用低倍镜观察，降低聚光器、缩小光圈使入射光线减弱，以便观察整个计数板结构及特征，同时观察血细胞分布是否均匀，在低倍镜下分别计数四角4个大方格的白细胞数并记录；在高倍镜下分别计数中央大方格四角及中央5个中方格的红细胞数并记录。

5.计数原则　按照一定顺序计数，对压线细胞遵循数上不数下、数左不数右的原则，以免重复或漏数。

【注意事项】

1.改良牛鲍计数板　在启用后每隔1年都要鉴定1次，以防不合格或磨损影响计数结果的准确性。

2.保证计数板和盖玻片清洁　操作中手指切勿接触计数板和盖玻片表面，以防污染。如使用血液充液，计数板和盖玻片使用后依次用95%乙醇、蒸馏水棉球擦拭，最后用清洁医用纱布拭净。

3.静置计数板　红细胞和白细胞计数时，一般需静置2～3分钟，血小板需静置10～15分钟，注意保湿。放置时间过长会造成稀释液挥发。

4.计数　血液稀释后应在1小时内完成计数，若细胞分布不均，应重新充液计数。计数红细胞、血小板用高倍镜，计数白细胞用低倍镜。

【思考题】如何保证计数结果的准确性？

（三）血涂片的制备和染色

【实验目的】掌握血涂片的制备和染色方法。

【实验原理】取一滴血于载玻片上，推成均匀的薄血膜，进行染色。用瑞氏染液（Wright染液）进行染色。细胞中的碱性物质，如RBC中的血红蛋白及嗜酸性粒细胞中的嗜酸性颗粒与酸性染料伊红结合染成红色；细胞中的酸性物质，如淋巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞质中的嗜碱性颗粒等与碱性染料亚甲蓝结合染成蓝色；中性粒细胞中的中性颗粒呈等电状态，与伊红和亚甲蓝均可结合，染成淡紫红色。

【实验材料】

1.器材　载玻片、推片（选择边缘光滑的玻片，在两角分别做斜线标记，然后用玻璃刀切去两角，制成约15mm宽度的推片）、洗耳球、显微镜、一次性采血针或注射器、记号笔、蜡笔、染色架。

2.试剂

（1）Wright染液　是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。Wright染液1.0g、甲醇600mL、甘油15mL配置待用；磷酸盐缓冲液。

（2）Giemsa染液　包含Giemsa染料1.0g、甲醇66mL、甘油66mL，配好后室温静置7天以上。此染液放置越久，染色效果越好。

（3）Wright-Giemsa复合染液　Wright-Giemsa复合染液、磷酸盐缓冲液。

3.标本　毛细血管血或EDTA抗凝新鲜全血。

【实验操作】

1.采血　采集毛细血管血或EDTA抗凝新鲜全血1滴，滴加载玻片近一侧短端约3/4处或1cm处。

2.推片　左手持载玻片，右手持玻片，将推片光滑一侧边缘接近血滴处，并与载玻片短边平行，然后轻轻接触血滴并压在血滴上，使血液沿推片边缘展开；将推片与载玻片近侧短边方向形成30°～45°，用均匀的速度将血向载玻片的另一端推动。红细胞压积发生变化时，应适当地调整推片与载玻片的角度以及推动血液的速度。标准的血涂片应做到头、体、尾分明，两边和两端留有空隙。见图1-2。

3.干燥　将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。

4.标记　在载玻片的一端用记号笔标记受检者信息。

5.染色

（1）Wright染色　将干透的血涂片血涂面向上，两端用蜡笔划线，以防染色时染液外溢。将血涂片平放在染色架上，加染液数滴，使染液覆盖整个血膜，继续加入等量或稍多缓冲液，用吸耳球轻吹液面，使染液与缓冲液充分混匀。静置5～10分钟后，将载玻片拿起，轻轻晃动，使染料不再附着于血膜上。把水流调至最小，平持载玻片，与水流方向呈90°，在血膜头部冲入，向血膜的尾端调整玻片的角度，直至染料冲干净，冲洗干净后的血涂片，放置在血片架上将水自然控干，或倾斜玻片等待自然干燥。

（2）Giemsa染色　将干透的血涂片放置在被磷酸盐缓冲液稀释10～20倍的Giemsa染液中，等待10～30分钟，取出后用流水冲洗，待干燥。

（3）Wright-Giemsa复合染色法　操作步骤同Wright染色法，但用Wright-Giemsa复合染液和缓冲液分别代替Wright染液和相应的缓冲液。

6.观察结果　将染色后的血涂片放置显微镜下观察。良好的染色结果为血膜外观为淡紫红色；低倍镜下观察体、尾交界处的血细胞，细胞分布均匀；成熟红细胞呈粉红色，少见染色颗粒；血小板呈紫色；白细胞胞质能显示各类细胞的特有色彩；中性粒细胞胞质呈粉红色，含紫红色颗粒；嗜酸性粒细胞含大的橘黄色颗粒；嗜碱性粒细胞胞质含有大量深紫蓝色颗粒；单核细胞胞质染成灰蓝色；淋巴细胞呈淡蓝色。

【注意事项】

1.Wright染液　新鲜配制的染液偏碱性，染色效果较差，经室温下贮存一定时间，美蓝逐渐转变为天青B后方可使用。放置时间越久，染色效果越好，但要注意盖严瓶口，以免甲醇挥发或氧化。染液中也可加入中性甘油3mL，防止甲醇挥发，使细胞染色更清晰。

2.制作涂片　所有血液必须在推片到达末端前用完。许多因素可影响血涂片的质量，对血细胞比容高、血黏度高的患者应采用小血滴、小角度、慢推；而贫血患者则应采用大血滴、大角度、快推。

3.干燥　血涂片干透后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色过程中容易脱落。

4.冲洗　应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以免染料沉渣沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久，以免脱色。冲洗水流不能过大，以免损伤血涂片。

5.观察结果　良好的血涂片应有由厚到薄的过度，头尾及两侧距离玻片边缘有一定空隙。如染色偏深，可用流水继续冲洗，或用甲醇脱色；如染色偏淡，需复染。复染前应先加缓冲液，然后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不可先加染液。

【思考题】

1.简述三种染色方法的优缺点。

2.如何纠正染色效果不佳？

（王　晶）