第七节　综合性实验

实验二十三　白细胞计数及误差因素探讨

【实验目的】掌握白细胞计算方法及分类计数；认识周围血液中正常白细胞形态；熟悉白细胞计数常见的误差因素。

【实验原理】全血经乙酸定量稀释并破坏成熟红细胞，在血细胞计数池内计数规定区域的白细胞总数，换算成每升血液中白细胞数。

【实验背景】白细胞包括中性粒细胞：圆形，胞浆淡红色，胞浆内有多量紫红色细小颗粒，核为蓝紫色；嗜酸性粒细胞：大小形态与中性粒细胞大体相似，胞浆内含有粗大的鲜红色颗粒，核多数为两叶；嗜碱性粒细胞：大小形态与中性粒细胞大体相似，胞浆内含有粗大的深蓝色颗粒，核分叶不明显；淋巴细胞：分大小两种，小淋巴细胞圆形，核染成深紫色，胞浆很少成蓝色，大淋巴细胞核圆形或肾形，胞浆相对较多成天蓝色，在胞浆与核之间有淡染带，有时内含少数紫红色大颗粒；单核细胞：核染成紫色，其染色质疏松，核形不规则，胞浆较多，染成浅灰蓝色。

改良牛鲍血细胞计数板由优质厚玻璃制成。由“H”形凹槽分为2个同样的计数池，在各池的平面玻璃上精密刻有9mm2面积的刻度，配以特制、专用盖玻片覆盖其上，形成刻度区域内的标准体积。每个计数池平均划分为9个大方格，每个大方格容积为0.1µL。

误差是指一个量在测量、计算或观察过程中由于某些错误或不可控制因素影响而造成的测量值与真值之差异。血细胞计数板的应用过程中，误差来源主要有三个方面，即仪器（或器材）误差、技术误差和分布误差（或计数域误差）。仪器误差可因器材配置不够完善、未经很好校准或质量不合要求等原因而产生，如计数池刻度不准、深度不足及盖玻片平整度、厚度影响等。技术误差来自操作者的操作规范程度、熟练程度及反应速度、分辨能力、固有习惯等，具体体现在吸样、稀释、混匀、充池、计数等实验过程中。分布误差因充池后血细胞在计数池内呈随机分布且分布不均匀所造成。血细胞在计数池内的分布符合Poisson分布，因此，可以根据统计学中Poisson分布的公式来计算所需的计数范围和计数量，以保证尽量将样品重复测定的误差降到最低，将变异系数控制在允许的最高限5%以内。

Poisson分布是一种统计与概率学里常见的离散概率分布，常用于描述单位时间内随机事件发生的次数。根据其“总数的分布”特性，以血细胞计数板一定区域为一观察单元，总计数值为m，则可认为m为平均数附近的一个观察值，近似于均数x；其均数分布与正态分布极为接近，那么方差s2=m，标准差，计数误差：

【实验材料】

1.试剂　白细胞稀释液：冰乙酸、10g/L亚甲蓝、蒸馏水。

2.器材　改良牛鲍血计数板及专用盖片、微量吸管、带孔吸头、移液管、小试管、纱布、玻璃棒、干棉球、光学显微镜、统计功能计算器、目镜测微器、微米千分尺、游标卡尺。

3.标本　抗凝静脉血。

【实验设计】

1.证实是否存在仪器误差影响实验结果，如何减少影响？如仪器是否校准、计数板或盖玻片是否合格、计数池刻度是否存在不精准等。

2.证实是否存在技术误差影响实验结果，如何减少此类影响？如吸样量准确与否、稀释度、混匀充分与否、充池规范程度等。应通过熟练操作减少或避免。

3.证实是否存在分布误差，由于计数池内每次血细胞分布不可能完全相同而产生误差，与计数细胞量成反比。

4.证实是否存在核红细胞对实验结果影响，如何减少此类影响？

【实验提纲】

1.白细胞计数实验过程中哪些操作会产生误差？

2.要将误差控制在合理范围内，应该如何操作？

3.如何进行白细胞计数准确性和精密度的评价？

4.白细胞的增加或减少具有什么临床意义？

【实验报告要求】实验要求4～6名同学为一组，在老师指导下，根据设计提示，通过自行查阅资料，设计出具体方案，并组织和实施实验，最后进行实验结果分析和实验报告撰写。每组提供一份格式正确、内容完整的实验报告，包括实验题目、作者、设计方案、材料与方法、实验流程、原始记录、实验结果、结果分析与讨论、参考文献等。

（王　晶）

实验二十四　尿液白细胞检验的方法学评价

尿液白细胞检验是尿液分析的重要内容之一，常用方法有干化学法和显微镜法，两者实验原理不同，故其灵敏度、准确度、特异性和影响因素等均不相同。严格的方法学评价是保证实验室质量管理的重要内容之一，学习和掌握方法学评价实验的设计原理和基本方法是保证实验室质量、合理解释实验室数据并将其运用于较高层次临床诊断分析的基础。

【实验目的】掌握尿白细胞检查的2种常用方法的原理和操作技术；熟悉2种方法常见的影响因素，能在指定影响因素条件下，设计实验方案对2种方法进行灵敏度、准确性和特异性等方面的实验研究和对比评价；掌握尿白细胞检查的实验原理和基本方法，能从方法学角度合理解释不同影响因素条件下尿标本白细胞检查结果的变化，能根据不同的检验对象，在充分考虑其影响因素的基础上选择合适的检查方法。

【实验背景】

1.尿液白细胞检验的基本原理和影响因素　正常情况下由于肾小球的滤过作用，尿液中几乎无白细胞；当泌尿系统感染及肾小球病变时，肾小球滤过膜通透性增加或受损，尿液中白细胞数量增加。尿液白细胞检查常用方法有干化学法和显微镜法。

干化学法是尿白细胞常用的筛查方法，操作简单，检测速度快。干化学法利用中性粒细胞和巨噬细胞胞质中的酯酶能水解吲哚酚酯生成吲哚酚和有机酸，吲哚酚与重氮盐反应，生成紫红色缩合物，颜色深浅与粒细胞和巨噬细胞数量成正比。试验主要针对中性粒细胞酯酶进行定性检查。干化学法常见定性因素有阴道分泌物、甲醛、大剂量头孢氨苄、庆大霉素、呋喃妥因等。

显微镜法是尿白细胞检验的参考方法，结果准确，干扰因素少。显微镜下直接观察白细胞有无。显微镜法常见影响因素有标本久置。

2.实验方法学评价的常用评价指标　定性诊断性实验方法评价的常用评价项目有灵敏度、准确度、精密度、特异度等。

（1）灵敏度　又称敏感度、真阳性率。灵敏度越高，则假阴性的病例（漏诊率）越少，有助于排除相应疾病。

（2）准确度　反映实验结果和患病情况的一致性程度。

（3）精密度　又称重复性、可能性，指诊断性试验方法在完全相同的条件下进行重复试验得到相同结果的稳定程度。

（4）特异度　又称为特异性、真阴性率。特异度越高，则假阳性的病例（误诊率）越少，有助于确定诊断。

【实验材料】

1.器材　小试管、试管架、吸管、显微镜、干化学分析仪及试纸等。

2.标本　采集各种不同影响因素的临床新鲜尿标本。

【实验设计】

1.选择无影响因素的尿标本，证实尿白细胞检验的2种方法的灵敏度和特异性。

2.证实不同标本因素对尿白细胞检验2种方法的影响。

3.证实药物因素对尿白细胞检验2种方法的影响。

4.证实操作因素如标本久置对2种方法的影响。

【实验报告要求】每4～5名同学为一组，根据设计题设选择其中一个问题，通过查阅资料设计出具体实施方案，组织完成实验，最后进行实验结果分析和实验报告撰写。

每组完成一份内容完整的实验报告，包括实验题目、设计方案、材料方法、实验步骤、原始记录、结果分析、实验讨论。

（徐红俊）