任务四 乳及乳制品质量与安全问题的快速检测
任务引入案例
我国生鲜乳三聚氰胺已连续8年零检出国产奶安全性已优于进口奶
据中国之声《全国新闻联播》报道，原农业部、中国奶业协会2017年7月19日发布《中国奶业质量报告（2017）》。我国生鲜乳三聚氰胺已连续8年零检出，当前，国产奶安全性已优于进口奶。
原农业部、中国奶业协会通报，2016年，我国奶类产量3712万吨，仅次于印度和美国，居世界第三位。原农业部连续9年实施全国生鲜乳质量安全监测计划，监测范围覆盖全国所有生鲜乳收购站和运输车。监测显示，国产生鲜乳主要质量卫生指标达到发达国家水平，乳品质量持续提升。中国奶业协会代理秘书长刘亚清介绍，2016年生鲜乳抽检合格率99.8%，三聚氰胺等违禁添加物抽检合格率连续8年保持100%；乳制品抽检合格率99.5%，在食品中保持领先。
尽管民族奶业发展势头良好，原农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心主任王加启坦言，进口奶制品仍然是很多消费者的选择。事实上，当前，国产奶安全性已优于进口奶。在2016年，共有来自19个国家10类154批次进口奶产品不符合我国现行国家标准，被退货或销毁。进口液态奶有三个特点，第一，保质期长，第二，热加工的副产物糠氨酸含量显著高于国产液态奶，第三，β-乳球蛋白等活性蛋白含量显著低于国产液态奶，表明进口液态奶的活性物质受到了热伤害，按照国际指标衡量，不属于优质奶的范畴。消费者要消费优质奶，还是要依靠本土奶。
任务介绍
改革开放以来，我国乳业进入了飞速发展的黄金时期。然而“三聚氰胺”事件的出现，对中国奶业造成了致命的打击，生鲜乳及乳制品的掺假问题也日益受到社会各界的重视，乳制品安全问题成为公众最为关心的食品安全问题。如何快速准确地检测和判定生鲜乳及乳制品是否掺假、掺杂，保证乳品的安全，树立消费者对国产品牌的信心，已成为中国奶业发展的关键。
纵观近几年的乳品质量安全事件，可以发现影响乳品质量安全的因素主要有乳制品新鲜度、掺假问题和化学污染。
一、牛乳新鲜度
牛乳是日常生活中一种常见的营养来源，成分丰富且易被吸收，是一种天然食品。鲜牛乳有“万食之王”美称，其营养丰富、富含多种生物活性物质。人们常说喝牛乳可以提高人体的免疫力，这便是牛乳中活性物质在起作用，因此鲜牛乳也被美誉为“命脉素”。鲜牛乳在天然饮品中基本是最完美的食品，有“白色液体”之称，为人体提供丰富的营养物质。通常鲜牛乳是由一些较为重要的化合物质组成，这些化合物的含量分别是：水分：87.5%；脂肪：3.5%；蛋白质：3.4%；乳糖：4.6%；无机盐：0.7%。全蛋白是指人体摄入的食物中的蛋白质含有全部的必需氨基酸，由于鲜牛乳中含有9种必需氨基酸，因此鲜牛乳中的蛋白是全价的蛋白质，它的吸收率高达98%，而豆类所含的蛋白质吸收率仅有80%。如今，人们越来越注重食品的安全问题与自身的养生，对牛乳的消费更重视其营养成分与安全状况。在选购和饮用牛乳时，对牛乳是否新鲜的知情需求日益突出。
然而，正是因为牛乳中含有丰富的蛋白质和水分，这些物质为细菌的生长、繁殖提供了环境。若是牛乳没有密封，空气中的灰尘落在其中，在适宜的温度下，细菌迅速繁衍，加速牛乳的变质。喝了变质的牛乳会对肠道有一定的刺激，危及人体健康，轻的会腹泻、呕吐、消化不良，严重的情况可能导致中毒。
二、牛乳掺假
生鲜牛乳是指从正常饲养的、无传染病和乳房炎的健康母牛乳房内挤出的常乳。我国生鲜牛乳质量管理规范规定鲜牛乳中禁止掺水、掺杂、掺入有害物质及其他物质。但记者调查发现，某地的一些乳品站在收购生鲜牛乳时存在着掺假行为。这些乳品站大部分都是机器化挤乳，每天乳农按时将乳牛赶到乳品站，用挤乳器将牛乳挤出，通过管道直接灌装到乳罐。乳品站的任务就是收购生鲜牛乳，储存到乳罐，通过专用车辆送到乳品加工生产企业。在拉乳的车来之前，一些乳品站为了增加分量多卖钱，都会先往乳罐里注水。之后，为了达到乳品企业收乳的标准，乳品站还要将蛋白、脂肪等掺入已经注过水的牛乳中。人们可以轻易地买到乳品站掺假时使用的脂肪油、蛋白粉、脂肪粉、麦芽糊精、维生素C 钠等添加剂。掺假所获得的利润十分惊人，500多元的原料就能用水凭空兑出2000多元的“牛乳”掺到真牛乳中。
如果原料乳在源头上就已经掺假，那么乳品企业就不可能生产出合格的乳制品。由于国内各大乳品企业对于各地的乳源争夺，乳农出于自身经济利益的考虑，常常会在鲜乳中掺假，这势必会影响乳品加工企业产品的内在质量和经济效益，同时也势必会对消费者的身体健康造成损害。目前乳及乳制品中常见的食品安全问题有：
（1）因生物性污染而造成产品腐败变质以及毒素存在。
（2）有毒金属物的污染。
（3）农药残留、兽药残留或有毒有机物的混入。
（4）人为掺伪。
而目前鲜乳中常见的掺伪手段有掺入水、碱性物质、葡萄糖类物质、尿素、豆浆、淀粉、糊精、甲醛、氯化物、硫酸盐等。这些物质在鲜牛乳中的非法掺入，一方面影响牛乳品质，营养成分下降，会导致乳制品企业无法生产出合格的产品，从而造成企业的经济损失；另一方面对消费者健康将造成严重威胁。因此，为了保障企业的利益和消费者的健康，维护市场和社会秩序，开发和使用快速、简便、灵敏的检测方法作为检测鲜牛乳掺伪的有效手段，具有重要意义。牛乳掺假的具体内容见模块二。
三、牛乳及其制品中三聚氰胺问题
三聚氰胺（英文名Melamine），是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。分子式C3N6H6、化学式C3N3（NH2）3，相对分子质量126.12。
三聚氰胺性状为纯白色单斜棱晶体，无味。目前三聚氰胺被认为毒性轻微，大鼠口服的半数致死量大于3g/kg体重。据科学家做过的实验发现：将大剂量的三聚氰胺饲喂给大鼠、兔和狗后没有观察到明显的中毒现象。动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。1994年国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》第三卷和国际化学品安全卡片也只说明：长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。
四、牛乳及其制品中四环素问题
在治疗奶牛疾病时，往往会通过各种方式使用抗生素，一种方法是采用肌肉注射或静脉注射，抗生素通过这种途径进入到奶牛体内后，由于血液的循环，抗生素会辗转进入到乳房中，并最终残留到所取牛乳中；另外一种方法是局部用药，也就是把抗生素直接注射到患病奶牛的乳房或其他病灶部位，这些方法显然都会使得所取牛乳含有抗生素。
四环素广泛用作抗菌药，四环素类抗生素主要包括土霉素、四环素（TC）和金霉素（CTC），目前常用于预防和治疗动物疾病。如果不合理地使用该类药物，如剂量过大，用药时间过长，滥用药物以及不遵守休药期提前屠宰等都会使该类药物残留于动物组织及牛乳中，被人们食用后带来极大危害，可造成致畸、致癌。为了有效预防四环素类药物的滥用，我国明确规定四环素类药物在牛乳中的最大残留限量。
任务实操
实操一 牛乳新鲜度的快速检测
1. 方法原理
正常情况下，新鲜挤出的牛乳呈弱酸性，若果酸度偏高，说明牛乳受微生物影响程度高。所以酸度是一个代表牛乳新鲜度的理化指标，可以用吉尔涅尔度来表示牛乳酸度。
吉尔涅尔度的表示符号为°T。测定时取100mL 牛乳，用蒸馏水稀释两倍，用酚酞作指示剂，然后用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定，按所消耗的氢氧化钠的毫升数表示。消耗1mL为1°T，健康牛乳的酸度为15～18°T。采用液态奶新鲜度快速检测试剂盒，新鲜牛乳及巴氏杀菌、灭菌乳的正常酸度值在16～18°T。酸度高于18°T或低于16°T时为不新鲜的乳。
2. 适用范围
液态牛乳。
3. 样品处理
无。
4. 检测步骤
（1）吸取10.0mL牛乳于100mL三角瓶中，加入20mL煮沸后放凉的水或纯净水，加4滴指示剂，混匀，用测定液滴定至初现粉红色，并在30s 内不褪色为止。记录所消耗试液的滴数（D）；
（2）同时用10mL纯净水代替牛乳做一份空白对照实验并记录所消耗试液的滴数（B）；
（3）将数据代入公式计算牛乳酸度：°T=（D-B）×0.6
5. 结果判定
滴定液消耗26～31滴以内者为合格新鲜牛乳，即酸度为16～18°T，否则为不新鲜的乳。
6. 注意事项
（1）滴定时注意滴瓶的直立性以减少误差。
（2）滴一滴摇一下。
（3）当消耗滴定液的滴数与规定值相差1滴时，应考虑到现场操作误差的存在，可送实验室精确定量。
（4）试剂常温保存，有效期为1年。
实操二 鲜牛乳中掺水的快速检测
1. 方法原理
牛乳的密度和相对密度均可用乳稠计（20℃/4℃，密度计）测定。在同温下密度和相对密度的绝对值差异很小。由于测定的温度不同，牛乳的密度较比重小0.002，在乳品加工中常用此数来进行换算。如牛乳密度为1.030g/cm3时，相对密度即为1.032。正常牛乳密度为1.028～1.032g/cm3，平均为1.030g/cm3，牛乳的密度会由于加水而降低。
2. 适用范围
液体牛乳。
3. 样品处理
无须特殊处理，直接测试。
4. 检测步骤
将牛乳充分搅拌均匀，抽取150～200mL 牛乳，徐徐沿筒壁倒入200～250mL量筒内，避免产生气泡。然后将乳稠计轻轻插入量筒内牛乳的中心，使其缓缓下沉。切勿使其与筒壁相撞。待静止后读数，以牛乳液面月牙形上部尖端部分为准。同时测定牛乳的温度。如果牛乳的温度不是乳稠计的标准温度（20℃），需根据温度校正表进行校正。
5. 结果判定
（1）测定牛乳温度，最后算出相对密度值，相对密度低于1.028的牛乳即可视为异常奶。
（2）当温度在20℃时，将乳稠计的读数/1000+1即得出牛乳密度；在非20℃时，根据样品的温度和乳稠计读数查表换算成20℃时的读数，换算出的读数/1000 +1最后得到牛乳实际密度。
6. 注意事项
（1）牛乳的密度受多种因素影响，如奶牛的品种、产奶量、季节、气温、挤奶间隔时间、饲料以及个体差异等，因此，如果测定密度低于1.028g/cm3，仍不能确定掺水，要综合考虑各种因素，并通过到挤奶现场测定比较，才能做出较正确的判断。
（2）对于密度低于1.026g/cm3的牛乳可视为掺水拒收。
（3）牛乳密度的降低与加入的水量成正比，每加入10%的水可使密度降低0.0029g/cm3。牛乳加水百分率可以用公式计算出来。
实操三 牛乳及其制品中三聚氰胺的快速检测——试剂盒法
1. 方法原理
显色剂与三聚氰胺反应，生成白色浑浊物，通过目视比浊法或在410nm 处测量浊度/吸光度，从而实现三聚氰胺含量的定性判断或定量检测。
2. 适用范围
液体牛乳。
3. 样品处理
（1）纯牛乳、酸乳等液体样品，直接称取混合均匀的样品2.0g；酸乳、果乳等较稠的样品，称取混合均匀的样品2.0g，加水5mL，颠倒混匀；奶粉等固体样品，称取充分混匀的样品2.0g，加水10mL，颠倒混匀。
（2）向制备好的样品中加入15mL 乙腈，以沉淀蛋白质，振荡提取5min，加蒸馏水至25mL，4000r/min离心5min（或静置5min），上清液过0.45μm滤膜，作为提取液待用。
4. 检测步骤
（1）目视比浊法（定性判断）
①样品测量：取一支10mL干净的透明玻璃管，加入显色剂A 1mL，显色剂B 2mL，最后加入3mL待测提取液，颠倒混匀3min 后观察是否有明显白色浑浊物出现。如果有明显的白色浑浊物出现，说明待测液中的三聚氰胺的含量大于5mg/kg，沉淀量越多，含量越高；如果没有明显的白色浑浊物出现，则说明待测样中的三聚氰胺的含量小于5mg/kg；
②建议样品测定最好和空白进行比对，将有助于结果的判断。（空白比对：另取一支干净的10mL的透明玻璃管，加入显色剂A 1mL，显色剂B 2mL，最后加入3mL蒸馏水，颠倒混匀后作为空白比对样。）
（2）分光光度仪比色法（定量检测）
①打开仪器的电源开关。待自检完成后，选择测量波长至410nm，将蒸馏水加入到10mm比色皿中，进行校零；
②空白样的测量：取一支干净的10mL透明玻璃管，加入显色剂A 1mL，再加入显色剂B 2mL，最后加入3mL蒸馏水，颠倒摇匀后，立即将溶液转入10mm比色皿中，于410nm处测定试剂空白的吸光度值；
③样品的测量：取一支干净的10mL 透明玻璃管，加入显色剂A 1mL，再加入显色剂 B 2mL，最后加入3mL 待测提取液，颠倒摇匀后，立即将溶液转入10mm 比色皿中，于410nm 处读取（在加入待测液后3min 之内读取）样品吸光度值。将扣除试剂空白吸光度值后的差值代入标准曲线计算待测样品的浓度mg/kg（mg/L）。
④标准曲线的绘制：用三聚氰胺标准品配制标准溶液进行标准曲线的绘制。注意检测范围5.0～50.0mg/L。
5. 结果判定
依据标准曲线计算结果，进行判定。
6. 注意事项
（1）加入待测提取液后颠倒摇匀后请立即测量，混匀后3min 之内测量结果有效。
（2）必须对样品进行预处理，否则结果不可靠。
（3）试剂盒需阴凉、密封保存。
实操四 牛乳及其制品中四环素的快速检测
（参见《动物性食品中四环素类药物残留检测 酶联免疫吸附法》，原农业部1025号公告-20-2008）
1. 方法原理
试样中残留的四环素类药物经提取，与结合在酶标板上的抗原共同竞争抗四环素类药物抗体上有限的结合位点，再通过与酶标羊抗兔抗体反应，酶标记物将底物转化为有色产物，有色产物的吸光度值与试样中四环素、金霉素、土霉素及多西环素浓度成反比。
2. 适用范围
本方法适用于牛乳中四环素、金霉素、土霉素及多西环素残留量快速筛选检测。
3. 样品处理
（1）取适量新鲜或冷冻的空白或供试牛乳。
（2）取供试样品作为供试材料；取空白样品作为空白材料；取空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。
（3）取适量牛乳，用稀释液经10倍或10倍以上稀释后作为试样溶液供酶联免疫法测定。
4. 检测步骤
（1）四环素类药物检测试剂盒回温至18～30℃后使用，以下所有操作应在18～30℃下进行。
（2）洗液按1份洗液浓缩液+9份水进行稀释。四环素标准溶液、抗四环素类药物抗体溶液、酶结合物、底物溶液等均按1份试剂+9份缓冲液进行稀释和制备，稀释液均现用现配。
（3）依次向微孔中加标准溶液或试样溶液50μL，稀释的抗体50μL，至微型振荡器上振荡30s，用封口膜封好，孵育1h。弃去孔内液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体。每孔加入洗液250μL，弃去孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，重复洗板3次。每孔加入稀释的酶结合物100μL，在450nm波长处测定吸光值。
5. 结果判定
（1）
相对吸光度值=B/B0×100%
式中 B——标准品或样品的平均吸光度值。
B 0——空白（浓度为0的标准液）的吸光度值。
（2）以标准溶液中四环素浓度（μg/L）的常用对数为X轴，相对吸光度值为Y轴，绘制标准曲线。根据试样溶液测得的相对吸光度值从标准曲线上得到相应的四环素类药物浓度，或用相应的软件计算，结果分别按下式计算牛乳中四环素类药物残留量：
式中 X——试样中四环素类药物残留量，μg/kg或μg/L；
c——从标准曲线中得到试样中四环素类药物含量，μg/kg或μg/L；
f——试样稀释倍数；
n——交叉率。
表2-12 不同药物的交叉反应率
（3）临界值按交叉反应率最低的药物（土霉素）计算，在空白牛乳、肌肉和肝脏组织中分别添加土霉素至100μg/L、100μg/kg和300μg/kg，各做20个平行样品测定，重复3次，计算含量平均值和标准差。临界值按下式计算：
式中 L——临界值；
——空白添加样品中土霉素含量平均值；
S——空白添加样品中土霉素含量的标准差。如被测样品中四环素类药物残留量小于临界值，判断为阴性；当检测结果大于等于临界值时，则结果可疑，应用确证法进行确证。
6. 注意事项
（1）灵敏度 本方法在牛乳中的检测限均低于10μg/L。
（2）准确度 本方法在牛乳中100μg/L添加浓度的回收率为40%～120%。
（3）精密度 本方法的批内变异系数CV≤20%，批间变异系数CV≤25%。
任务拓展
拓展一 掺假牛乳检测技术取得进展。
拓展二 GB/T 22400—2008《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》（节选）。
拓展一
拓展二
复习思考题
1. 牛乳新鲜度快速检测的原理是什么？
2. 鲜牛乳中掺水快速检测结果判定需要考虑哪些因素？
3. 乳制品中三聚氰胺快速检测技术有哪些？
4. 现有乳制品中四环素类药物快速检测技术缺点，有哪些方面需要改进？