生物进化在本质上是一种遗传学行为。就肿瘤进化而言，种族、民族、部落、家系对于某些环境致瘤因素的易感性和在相应肿瘤发生率上所表现出的差异，乃至个体罹患肿瘤的病理特征随时间发展而变化的现象，都应归结为单一个体生殖细胞或体细胞内肿瘤相关基因持续进化的结果。个体中的肿瘤（易感性）进化行为通过体细胞层面的突变影响其自身患病风险和预后，或通过生殖细胞突变传递给后代，影响种群整体的肿瘤发病率。

客观上，进化现象是生物个体与环境交互作用的产物。因携带优势等位基因，少数个体在环境选择压力下得以存活和繁殖，将其所携带的优势遗传物质传递给后代（对肿瘤细胞而言，指其分裂增殖产生的子代细胞），这个被动选择过程构成了遗传进化的主线。次线进化机制是在中性选择压力下，生物个体将独有的遗传物质随机传递给后代，随时间推移，某些等位基因纯粹出于巧合，占据了种群中的优势比例。这种与环境选择无明显相关性的进化模式又被称为“遗传漂变”。

肿瘤进化方面，无论是群体肿瘤易感性的获得或失去，还是个体所罹患肿瘤表型在一个生命周期中历经的种种变化，其动力源泉都是细胞内遗传物质的自发突变。以基因组DNA为观测对象，人类生殖细胞的基因组突变频率大约为1×10 ^-8～2×10 ^-8／（碱基·代）（指生育代次） ^［1］，癌细胞的基因组突变频率在2×10 ^-10～3×10 ^-9／（碱基·代）（指细胞分裂代次）之间 ^［2］。不同地球历史年代里，蓬勃涌现的新生突变（指生殖细胞突变）构成了当今人类遗传背景多样性的物质基础；相似地，在个体生命周期当中，肿瘤组织中持续发生的基因组变异构成了肿瘤异质性的遗传基础。起初仅占种群亿万分之一（比如通过生殖细胞传给子代的突变）或百万分之一（比如1mm ³瘤体中的单个碱基突变）的新生突变，通过中性或适应性进化，先在局部获得一定比例优势，然后，从局部优势扩展为种群优势，继而进化为整个种群的特征性遗传标志，抑或由于某些特发因素，从种群中完全消失，这些现象是肿瘤进化学科的核心观察、分析和利用对象。掌握肿瘤遗传进化规律有助于评估种族、家系肿瘤患病风险，有助于临床预测肿瘤治疗效果、推断耐药倾向。

临床上，有关肿瘤遗传易感性的最小观察单位是家系。医学遗传工作者依靠单个家系表现的肿瘤易感特征，追溯查找携带此易感特征的其他亲缘家系，通过染色体遗传位点连锁分析找到他们的共同祖先基因，明确该基因突变的致病机制；其后，利用针对致病突变的精确诊断工具（比如，限制性片段长度多态性分析、位点特异性PCR、基因测序等），对目标人群进行筛查，挑选出高危者（即：共同祖先基因的携带者）给予重点防治。在积累了足够数量的患者人群和诊疗经验基础上，可以归纳出一些突变携带者与众不同的病理转归特征，总结成一套行之有效的诊疗方案。这是利用进化遗传原理，服务于临床预防、提高疗效、改善预后的典型工作模式。

广为知晓的乳腺癌-卵巢癌易感基因 BRCA1和 BRCA2最初是在若干早发性乳腺癌家族中通过遗传位点连锁分析方法定位到17号染色体长臂q21区带（ BRCA1）和13号染色体长臂q13区带（ BRCA2）上的 ^［3-4］。根据连锁分析提示的基因座位信息，含24个外显子长100kb的 BRCA1基因和含27个外显子长70kb的 BRCA2基因被先后克隆出来，并测序证实大多数17号染色体连锁或13号染色体连锁乳腺癌家族成员中携带有 BRCA1或 BRCA2基因突变中的一种 ^［5-6］。然而，不同家族检测到的 BRCA1或 BRCA2突变类型是各不相同的。这个事实说明，早期研究所纳入的乳腺癌-卵巢癌家族来自不同生物学祖先。迄今为止，胚系突变等位基因循证网站 （Evidence-based Network for the Interpretation of Germline Mutant Alleles，ENIGMA）上，已收集到的有关生殖细胞的 BRCA1/BRCA2突变种类高达分别1 500和1 600个以上 ^［7-8］。可以设想的是，这些独特突变的正常祖先们原本居住于一个狭小地域内，在历史上某个时期中，他们的生殖细胞产生了一个新生的 BRCA1/BRCA2突变。此后，新生突变被生生不息地传递到后代中，并伴随后代迁徙散布到世界各地，以至于今天，我们能够在全球居民中筛选到如此众多 BRCA1/BRCA2独特突变。

临床对于 BRCA1/ BRCA2突变类型的多样性，如果从进化遗传学角度加以审视将变得更为清晰，并富于预见性。我们不妨将全球人类视为远古某个动物单一克隆后代。无疑，在种系发生（进化）过程中，地位越古老的 BRCA1/BRCA2突变将拥有越多的当代继承者（即：突变携带者）。进化遗传学中，奠基者突变（funder mutation）是指伴随某个进化分支生成以来就一直存在着的独特突变类型 ^［9］。理论上，奠基者突变会在1／2后代身上稳定遗传下去。但须知道的是， BRCA1和 BRCA2突变多为纯合致死基因 ^［10］。因此，即便位于种系发生树最顶层的奠基者突变，它们在向后代传播过程中，频率也会持续降低。事实上，出于纯合突变克隆性消除的缘故， BRCA1/BRCA2突变遗传行为并不遵守哈迪-温伯格（Hardy-Weinberg）平衡定律，而呈逐步下降趋势，直至为新生突变所取代。

有关 BRCA1/BRCA2奠基者突变方面的群体遗传研究，开展最为深入的是对阿什肯纳基（Ashkenazi）犹太人的 BRCA1/BRCA2三个奠基者突变： BRCA1 185delA、 BRCA1 5382insC和 BRCA2 6174delT的人口学和流行病学调查工作 ^［11-15］。这三个突变在阿什肯纳基犹太人中的累积检出率为1．69%～2．94% ^［9］。长期的流行病学观察资料显示，欧洲迁入北美洲的阿什肯纳基犹太人中，遗传性乳腺癌／卵巢癌的发病率显著高于非阿什肯纳基犹太人和非犹太人；此外，胰腺癌、胃癌和非霍奇金淋巴瘤在阿什肯纳基犹太人中的发病率也高于当地人口平均水平 ^［16-17］。因此，分子流行病学者认为，阿什肯纳基犹太人高发癌种与 BRCA1/BRCA2基因三个独特突变的奠基者效应有关 ^［11-12］。同时，流行病研究还表明，越是在高龄犹太妇女中，奠基者突变检出率越低（<40岁为2．7%；40～49岁为2．1%；≥50岁为1．2%） ^［13］。这提示， BRCA1/BRCA2突变给携带者带来的是生存负选择效应，携带者难以获得较长寿命。目前，尚不知奠基者突变的负选择效应是否影响携带者的生育能力。但若育龄期阿什肯纳基犹太妇女经常罹患乳腺癌或卵巢癌，显然不利于突变向后代的传递，因此突变在种群中的频率将会衰减。再考虑到当前女性生育年龄普遍推迟和种族间通婚现象频繁的事实，未来，在阿什肯纳基犹太人中，这三种奠基者突变携带率预计还会持续降低。甚至，到某个时刻， BRCA1/BRCA2突变将不再是阿什肯纳基犹太人的特征性遗传标志。由此，动态监测致病（致瘤）基因突变的类型和频率变迁趋势是保障肿瘤遗传咨询工作有效性的一个重要措施。

肿瘤异质性（heterogeneity）现象是指肿瘤组织不同区域细胞群体在生长速度、侵袭能力、药物敏感性、免疫原性、局部微环境特征等各个方面表现出来的差异性 ^［14-15］。在这些表型差异现象背后蕴含着肿瘤细胞功能特化和适应生存的进化主线。

肿瘤发生是多阶段基因突变的结果。以结直肠癌为例，在经典“肠上皮增生—腺瘤—癌”演化模式中，伴随病理进展的是细胞中染色体结构的序贯变化，依次为：增生上皮细胞5q突变或缺失、早期腺瘤中的12p突变、中期腺瘤中的18q缺失以及晚期腺瘤和癌细胞中的17p缺失。已查明，这些染色体变异涉及的关键致病基因（又称“驱动基因”）有： APC（位于5q）、 KRAS（位于12p）、 DCC（位于18q）和 TP53（位于17p） ^［16］。对病变组织进行测序，可明确各驱动突变（driver mutation）在时间和空间上的发生顺序，它们在一定程度上反映了肿瘤进化的大致规律 ^［17］。早期研究依靠对瘤组织中的单个基因对象测序分析（尤其一代测序技术），可获得病灶中优势细胞群体基因组变异情况的大体信息，但无法揭示肿瘤细胞基因组改变的区域异质性特征。近年来，在二代测序基础上发展起来的多区域活检和测序方法为我们掌握肿瘤基因组变异的精细时空图提供了必要条件。在人类癌症中，从突变频率（指基因组中每百万碱基中突变事件数）仅0．01～0．1／Mb的毛细胞星型胶质瘤，到突变频率高达10～100／Mb的黑色素瘤，遗传异质性现象随处可见 ^［18］。即便是两个相邻的肿瘤细胞，也可以在突变类型和数量上表现出极大差异。测序结果显示，驱动突变并不存在于所有细胞中，伴随突变（passenger mutation）更是参差不齐，其分布范围和比例极不一致。瘤组织中数以百万计、千万计的癌细胞构成了巨大的异质性群落，其中适应性进化、中性进化（即：遗传漂变）、趋同进化（convergent evolution）等多种进化模式并存，赋予瘤组织从最初简单增生到良性肿瘤（癌前病变），再到恶性肿瘤的梯次进化能力 ^［19］。

肿瘤中，随病理进展而产生的驱动基因梯次突变现象可直观地解释为癌细胞与环境中的不利因素抗争，以实现适应性进化的过程。从病变细胞进入克隆性增殖的那一刻起，即便此时病理状态仍是可逆的（尚不属于肿瘤范畴），病变细胞之间已显示出遗传物质的异质性。在与周围细胞竞争生长空间和养分过程中，携带优势驱动突变的子代克隆会逐渐胜出，并占据种群优势。相反，经过若干代次增殖，种群中如无一个子代克隆能取得优势突变和进一步生长潜能，以致全体病变细胞陷入生长停滞状态，则增殖病灶就会自动消退。但是，只要克隆增殖过程中，不断有子代克隆取得优势基因表达，获得更具竞争力的生长潜能，继而成为种群中的新生主导力量，病理增生灶就能在时间上得到延续，空间上得到扩张。这种子代克隆通过竞争、取代前代克隆成为增殖病灶中优势群落，前后接力式的病理演变过程称为“克隆选择”进化模型 ^［20］。系统地来看，在任何一个病理性增生病灶中，如将全体细胞视作为一个金字塔结构，则居于塔尖的总是携带有新生优势突变、能够在未来占据种群优势比例的引导性克隆。处于塔身到塔顶之间的，则是数量上占绝大多数的当前优势克隆。居于塔底的则是原始以及在进化过程中被边缘化的非优势克隆构成的群落。金字塔任何一个层面的肿瘤细胞群落中，除“驱动突变”一致外，主要是充斥着大量的异质性克隆。每个克隆可由2～8个细胞构成，但都携带不同类型的“伴随突变”以示区别。塔尖少量细胞携带的是代表进化方向的新生驱动突变；进化过程中，它们将起着重塑细胞金字塔的外形作用。举例而言，如果将依经典进化模式产生的极早期肠癌组织（如“原位癌”）按驱动基因数目和类型构建起细胞金字塔，则居底层的就是仅含 APC突变／缺失的肿瘤细胞，而居中下层的则是含 APC和 KRAS突变／缺失的肿瘤细胞，居于中上层的是含有 APC、 KRAS和 DCC多种驱动突变的癌前细胞，居顶层的是含 APC、 KRAS、 DCC和 TP53更多驱动突变的癌初始细胞，其数量最少。随肿瘤进展，金字塔结构发生更替，携带四种驱动突变的细胞克隆层级将逐步下移。由“癌前细胞”（即：仅携带1～3种驱动基因的细胞）构成的塔基会逐步缩窄，甚至被排除出金字塔，从肿瘤群落中消除（因凋亡、缺少养分坏死等因素）。原先的塔身和塔尖部分则为携带更多新生优势驱动突变的细胞克隆所取代。肿瘤细胞金字塔的动态演进过程与细胞总数有关，随细胞数增加而加速；其加速度正比于突变细胞总数。在突变频率不变情况下，癌细胞种群越大，则突变总数越多。突变越多就意味着新型驱动突变出现的机会越大。可见，癌症持续恶化的基础是当前群落中拥有数量足够的细胞成员，它们是孕育肿瘤进化的温床。临床上，肿瘤减灭术就是在最大程度上消灭进化温床，阻断在统计学意义上的肿瘤进化和表型恶化机会。然而，这并不能确保新型驱动突变在小概率情况下诞生。因此，只要剩一个癌细胞，肿瘤就有克隆进化和表型恶化的可能。肿瘤减灭术功效正是体现在延缓进化进程和推迟表型恶化上。

运用先进测序工具和显微切割技术，我们可以详尽地勾画肿瘤病灶从形态上近乎正常的癌周组织，到癌灶边缘的癌前病变组织，直至癌灶前沿向正常组织内部伸入侵润生长的峰面细胞群体里驱动突变从初现、积聚到爆发式增长的动态进化过程。通过精细的基因组分析工具可以还原出肿瘤发生和进展中的各种环境致突变因素，归纳形成不同肿瘤进化模式。相应地，针对肿瘤异质性进化特征的分析结论也有助于临床更为有效地预防和治疗癌症 ^［21］。

有关环境致癌因素的推测，目前主要是通过统计癌细胞基因组中突变标记（mutational signature）的类型和频率来实现 ^［18］。按T、C、G、A四个碱基的六种替换关系（两种转换、四种颠换）以及被替换碱基所在位置前后各一个碱基（即：5′和3′相邻碱基）的排列差异，理论上可以得到96种突变模式（比如：TpC>TpN）。若干突变模式的组合，构成一种突变标记。根据30种病理类型共7 042例原发癌的测序资料分析结果，人类癌基因组中实际存在21种突变标记。每种标记含有一个或多个特征性突变模式，构成独特的指纹图。以富含C>T转换的1A和1B型突变标记（NpC>TpG）为例，成因可能与5-甲基胞嘧啶自发脱氨基事件有关。这类突变发生频率仅与患者年龄有关，与肿瘤类型和人种无关。癌症患者越年长，1A／1B型突变标记越常见。72．4%的癌症病例中都可以看到突变标记1A、1B存在，说明随年龄累积起来的DNA自发损伤是导致癌症发生的普遍因素。突变标记1A、1B也见于正常组织中，其发生频率同样与组织年龄有关；其余19种突变标记与年龄缺乏显著关联性，它们可能是患者暴露于某些特殊致癌环境所致，或与癌症形成后基因组的继发改变有关。2型和13型突变标记的特征是富含C>T、C>G替换（TpC>TpN、TpC>GpN），两者见于16．6%癌症病例中。 AID/APOBEC 胞苷脱氨酶家族基因过度活化与这类突变机制有关。胞苷脱氨酶家族基因通常在病毒（尤其是反转录病毒）入侵时激活，其对基因组造成的损伤因此可视为细胞针对反转录RNA元件和外源性病毒做天然免疫应答时产生的附加伤害。突变标记3、6、15通常与DNA损伤修复机制缺陷有关。其中，3型突变标记主要见于 BRCA1/BRCA2突变携带者的乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中，特征是广泛和等频的多形式碱基替换事件。由于 BRCA1/BRCA2是同源重组DNA双链修复机制中的一员，所以该突变标记反映的是同源重组修复过程中引入新生突变的偏好性。6型突变标记体现了DNA错配修复机制方面的缺陷，多见于结直肠癌、子宫癌、肝癌、肾癌、食管癌和胰腺癌中，其特征是NpC>TpG（虽与突变标记1A、1B特征相似，但标记6主要出现于微卫星不稳定组织中，比如Lynch综合征）。15型突变标记在肺癌和胃癌中常见，特征是GpC>TpN，但标记成因尚未知晓。3型、6型和15型突变标记的共同特点是它们所在基因组中都存在着大量的碱基插入缺失（indel）事件，此特征为基因组微卫星不稳定的典型表现。由此，突变标记3、6、15反映了细胞基因组DNA损伤修复能力的丢失和DNA处于高度不稳定状态的事实，这导致基因组在短时间内积累起大量碱基变异；故而，相对于突变标记1A、1B，突变标记3、6、15为前者时间浓缩版。与内在致突变因素诱导下形成的3、6、15型突变标记不同，突变标记4、5、7、11主要与外源性致突变因素紧密联系在一起。具体来说，4型突变标记与吸烟史密切相关，是头颈癌和肺癌的主要突变特征。该型突变标记富含C>A颠换，且多聚集在作为转录模板的反义DNA链上。此现象可能与吸烟者体内细胞基因组DNA表面吸附（共价联结）了大量多环芳烃有关。生成机制上，环烃化碱基在转录偶联核苷酸外切修复过程中被修复酶类错误替换，由此形成该标记模式。此外，以C>T和T>C转换为特征的5型突变标记也多见于肺腺癌中，和吸烟史密切相关，但生成机制尚不清楚。7型突变标记则与紫外线暴露关系密切，多见于头颈部鳞癌和黑色素瘤；该突变标记主要特征是C>T转换，其优势突变模式是C／TpC>TpN（区别于突变标记1A、1B）。7型突变标记主要见于非转录的正义DNA链上，与转录偶联核苷酸外切修复机制有关，是紫外线诱导嘧啶二聚体生成后，DNA修复错误导致的结果。11型突变标记与替莫唑胺等烷化剂有关，多见于接受该类药物治疗后的黑色素瘤和胶质细胞瘤患者中；该标记的特征性突变模式为NpC>TpC／T。有两种DNA多聚酶参与了DNA修复过程，即：多聚酶η和ε，两者在DNA修复过程中都可以引起超量突变。慢性淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤中，以9型标记多见，其特征为A／TpT>GpN，这和多聚酶η针对 AID/APOBEC诱导胞苷脱氨位点的修复过程有关。结直肠癌和子宫癌中，以10型标记多见，特征为TpC>ApT和TpC>TpG，与多聚酶ε所介导错配修复机制有关，多见于微卫星不稳定肿瘤中 ^［18］。考察不同肿瘤细胞群落内突变标记丰度的变化规律可以反映各病理时期促肿瘤进化因素的变迁情况。举例来说，显微切割黑色素瘤组织中从正常到恶变区域并加以测序分析，我们可以看到在病理各阶段（良性病变、间变、原位癌、浸润癌）紫外线损伤都是推动肿瘤进展的主导因素（标记7丰度比例始终占80%以上） ^［22］。但在转移灶中，这种致突变因素的参与比例则有下调，提示转移能力是肿瘤形成后基因组继发改变的结果。相应地，黑色素瘤从最初良性病变到最后浸润性病变，基因组突变频率从0～10／Mb成倍升高至10～20／Mb ^［22］。可见，在内、外环境致突变因素共同推动下，瘤组织持续进化和异质化是病理表型不断恶化的根本原因；故而，通过考察突变标记的变迁情况，掌握不同环境突变源对肿瘤进化的贡献程度，势必能为有的放矢、有针对性地切断恶化进程提供一个有效的信息分析基础。

肿瘤进化遗传还体现在异质性现象的“分”与“合”上。如前述结直肠癌中细胞转化最初的驱动突变常常见于 APC基因 ^［16］，这是不同个体在肿瘤发生过程中不约而同地采用了大概率通用进化路线的结果。隐藏在这个现象背后的问题是，为何结直肠癌前体细胞必须采用 APC基因突变路线才能获得竞争优势？当然，我们不能简单地用癌症发生程序化调控机制来解释这种现象，毕竟在其他肿瘤类型中， APC基因并不是常见首选突变对象。但若从肿瘤异质性竞争角度考虑问题，则会与实际情况更接近一些。 APC基因突变携带者之所以在最初竞争中胜出，可能是其表达产物更具备诱导细胞增殖和打破上皮间接触抑制作用的直接功效，相比以 KRAS、 TP53或其他原癌／抑癌基因为首发突变的肠病变细胞， APC突变细胞的增殖能力必定更强些，这一事实或许代表结直肠癌早期病理改变中的一些肿瘤进化共性基础。相似的组织专一性肿瘤进化路线还见于黑色素瘤中 ^［22］。黑色素瘤病理发生的一般过程是：良性色素痣—中间损伤（intermediate lesion）—原位癌—浸润癌；其中，良性色素痣和中间损伤都可以作为黑色素瘤的病理起点。对黑色素瘤进行组织显微切割和二代测序结果显示，从色素痣起源的黑色素瘤几乎都是以 BRAF V600E作为起始驱动突变，继之以 TERT启动子突变、 CDKN2A突变／缺失、 ARID家族基因等突变实现肿瘤基因组的梯次进化，推动肿瘤向恶性、浸润性方向不断进展。与之不同的是，从中间损伤起源的黑色素瘤多见于60岁以上老年人，其特点是常以 NRAS、 BRAF V600K或K601E作为突变起点，这一类病变中往往还伴有 TERT启动子或 CDKN2A突变／缺失情况的存在；该类黑色素瘤进入侵袭阶段后，更易频繁出现 PTEN、 PI3K和 ARID等PI3K-Akt信号通路相关基因的多重、高频继发突变 ^［22］。与我们之前在结直肠癌中对初始突变成因分析的方法一样，在对专一作用于黑色素瘤的过程的分析中，同样应该坚持从肿瘤组织学背景、环境致突变因素、细胞分裂周期调控等角度客观考虑BRAF和NRAS突变细胞在初始竞争阶段被选为优势克隆的合理性。进而，从更广义的视角来考察结直肠癌和黑色素瘤分别以 APC和 BRAF／ NRAS作为初始驱动突变，在自然竞争中消灭非优势突变取得主导地位的事实则可认识到肿瘤异质性现象在同一病理类型肿瘤中的“合”，及在不同病理类型肿瘤中的“分”，这是肿瘤个案带给我们的宏观认知体验。然而，肿瘤异质性现象真正的“分合”机制主要体现在同一肿瘤生长、转移恶化过程中的“趋同进化”上。以肾细胞癌为例，原发肿瘤灶中各个局部群落（包括转移灶）共有的驱动突变只占突变总数不到40%，但属于不同区域子克隆专有的驱动突变则达10%以上 ^［19］。对于同一患者，根据其体内不同肿瘤区域中共有突变和专有突变绘制进化树，往往可以看到几个不同肿瘤区域（或转移灶）进化分支上都出现了涉及同一基因的突变事件。多区域测序结果显示，肾癌原发灶内的多个区域和转移灶中都可存在 SETD2基因（编码一种H3K36三甲基化酶）突变，但突变形式各不相同。原发灶中最接近于转移灶特征的进化分支上， SETD2表现为剪接位点突变；转移分支主干上（即：所有转移灶中）， SETD2测序为错义突变；而在原发灶其他区域中（另一分支主干上）， SETD2基因表现为移码突变。显然，不同病灶区域内的肿瘤克隆（肿瘤主体、转移供体、转移灶）在独立进化过程中发生了 SETD2趋同突变，虽实现方式各不同，但都导致H3K36三甲基化酶完全失活。这种趋同进化现象说明 SETD2基因尽管不是肾癌发生必要条件，但对于肾癌病理进展是至关重要的，别无其他等效基因可以替代（至少本患者如此）。肾癌中的趋同进化现象还见于 KDM5C（编码一种H3K4二甲基化酶）和 PTEN基因的突变事件中。与 SETD2不同，后两者不见于所有进化分支上，说明两者对于肿瘤生存进展影响不大，但突变事件本身仍有利于克隆繁殖，因此进化过程中它们为多个子克隆共用 ^［19］。不仅肾癌，内膜癌中也可见相似的趋同进化现象 ^［23］。一组针对内膜癌原发灶和转移灶活检标本的测序研究表明，当同一患者同时存在有原发灶和转移灶的15q和18q缺失事件时，其原发和转移灶中肿瘤细胞染色体其他区段拷贝数变异行为并不一致，提示两者趋同进化的可能性 ^［23］。随着不同癌症测序数据的积累，趋同进化现象还会在更多病例中检出。趋同进化是肿瘤异质性竞争在“分”基础上的“合”，是肿瘤群落在进化过程中，面向内、外环境和遗传背景制约因素，集约使用有限驱动基因资源，实现自身生存和繁殖目标的一种高度适应性行为。

在“克隆选择”模式中，肿瘤内发生的各种驱动突变都被认为是环境选择压力下梯次生成的，但同一病灶中的驱动突变在进化时间上孰先孰后却无法依靠简单测序来加以确定。依前所述的增殖细胞金字塔中，遍及各个群落层面的驱动突变必然是最早生成、有奠基作用的起始者；而为一个群落层面或一个肿瘤区域中细胞独有的，特别是塔尖部分的突变，必然是出现较晚，作用比较次要者（除非具有十分显著的竞争优势）。将特定突变在全体肿瘤细胞中所占比例与其生成时间关联起来的进化分析方式称作“克隆分析”法 ^［24］。克隆分析过程中，使用近似贝叶斯计算（approximate Bayesian computation，ABC）或马尔科夫链蒙特卡罗（Markov chain Monte Carlo，MCMC）算法，可以求得肿瘤细胞群体中各个驱动突变的生成时间，即：突变携带细胞的“最近共同祖先时间（the time to the most recent common ancestor，TMRCA）” ^［17］。通过分析，发现肿瘤发生早期（此时肿瘤体积<1mm ³，肿瘤细胞数量<1×10 ⁶）大量生成的驱动突变通过逐代相传方式可延续到当前肿瘤病灶的各个细胞群落（即：金字塔的塔身和塔基部分）中，这个现象称为早发突变的“穿透（pervasive）”效应 ^［25］。有意思的是，居于塔尖，代表新生子克隆群落（当细胞总数达到1×10 ⁹后）所携带的晚期驱动突变数量仅为早发穿透性突变的60%～70%（根据4例肠腺瘤和11例结直肠癌的数据统计）。据此可以得到的结论是，早发性驱动突变是肿瘤群体遗传背景中的主导者。由此认为：经历了充分自然竞争的晚期肿瘤细胞群落里，突变是否能够获得足够“穿透性（pervasiveness）”取决于其生成时间，并不取决于其带来的生长优势 ^［26］。事实上，仅靠晚期强势驱动基因来压制肿瘤病灶其他区域既有肿瘤细胞的生存，取代整个种群中已有细胞成分，成为肿瘤病灶优势细胞群体的机会是微乎其微的。除非出现了巨大的环境变化，比如在化疗条件下，肿瘤细胞大量死亡，此时携带晚期优势突变的子克隆才能脱颖而出。临床上，确实可以在不少患者中观察到化疗后肿瘤复发和转移加速的现象。从进化角度出发，这种现象背后的机制是不难理解的。有些学者把自然生长条件下所观察到的这种癌症遗传背景中早期突变占据优势地位的现象归纳为肿瘤进化的大爆炸模型（big bang model），借喻肿瘤发生过程如同宇宙大爆炸，一次爆发式突变增长决定了肿瘤整个进化结局 ^［25］。以小种群进化速率高而大种群进化趋于停滞这一基本遗传进化规律来看，此模型是不无道理的。

肿瘤耐药复发和不受控生长转移几乎是所有终末期患者的共同死因。预测肿瘤耐药需要解决两个问题，一是肿瘤对哪些化疗药物敏感，二是导致肿瘤耐药的关键基因或表达产物是哪些？前者是药物选择上的临床需求，后者是逆转耐药行为的分子标靶。这两个问题如果能得到稳妥处理，可以大大降低肿瘤耐药机会，延缓患者生命，提高生存质量。过去在病理学上预测肿瘤耐药方法工作主要是通过对肿瘤组织中已知的耐药相关蛋白进行免疫组化染色来展开，比如：多药耐药蛋白1（MDR1）具有药泵作用 ^［27］，胞膜／质染色阳性说明肿瘤对阿霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春碱、长春新碱、紫杉醇和多西紫杉醇耐药性强 ^［28］；谷胱甘肽S转移酶（GSTπ）具有解毒作用，胞质表达量越高，说明瘤体对阿霉素类、铂类、氮芥类和环磷酰胺等耐药能力越强 ^［29］。另外，也可以通过对化疗药物或内分泌激素受体染色来预测相应抗肿瘤／内分泌药物的有效性。比如：拓扑异构酶Ⅰ（TOPO Ⅰ）核内表达量高，肿瘤对拓扑替康反应性较好 ^［30］；拓扑异构酶Ⅱ（TOPO Ⅱ）核表达量高，肿瘤对依托泊苷（VP16）、阿霉素、表阿霉素、新霉素等反应性较好 ^［31］；孕激素受体为阳性，肿瘤对高剂量孕激素类药物有反应 ^［32］；雌激素受体阳性，则三苯氧胺、雷诺昔芬、氟维司群、阿那曲唑等雌激素拮抗类药物有效 ^［33］。近年来，小分子靶向药物的出现使临床对肿瘤基因组检测结果日益重视，比如：表皮生长激素受体1（ EGFR）变异是吉非替尼的适用对象 ^［34］；人表皮生长激素受体2（ HER2）拷贝数增加是曲妥珠单抗的适用对象 ^［35］； ALK（间变淋巴瘤激酶）基因融合突变是克唑替尼、阿来替尼、劳拉替尼、洛普替尼等ALK一、二、三、四代抑制剂的适用对象 ^［36］； BCR- ABL基因融合（费城染色体）是伊马替尼、尼洛替尼等药物的适用对象 ^［37］。固然针对耐药蛋白和药靶蛋白的逐一检测可以协助临床选择更适合肿瘤固有特性的化疗方案，但肿瘤细胞在化疗选择压力下实现加速进化使患者面对着化疗短期内无效的风险。评估肿瘤的进化特性（速率、倾向性）因此而成为临床必需。

在发生机制上，肿瘤耐药性的产生是化疗筛选的结果。然而，究其根本成因，则在于瘤组织内部的克隆异质性。具有耐药能力的细胞个体往往伴随着以大量独立、无序突变为特征的肿瘤进化过程而产生。一般而言，单个耐药细胞多不具备特殊生长优势，只在化疗来临、细胞大量死亡情况下，它们才能获得生存空间实现种群更替。很少情况下，耐药特性与肿瘤增殖能力通过某些驱动基因关联在一起，此时的肿瘤病灶是原发耐药的，首轮化疗期间瘤体就继续增大，称为顽固性（refractory）耐药癌 ^［38］。所以，进化速率决定了肿瘤耐药机会。细胞数量一定（即：肿瘤体积相同）的情况下，肿瘤基因组突变速率越高，则瘤组织中积累耐药突变数量就越多，耐药机会就越大，发病时间也就越早。临床实施的肿瘤减灭术可提高化疗缓解率，并减少耐药复发病灶的形成，其机制在于消灭了耐药突变中的绝大多数。计算肿瘤进化速率有助于预测耐药事件的发生概率；识别并对肿瘤群体中的耐药克隆进行测序，则有利于找到维持耐药特征的驱动突变（群）。肿瘤进化速率（微观上表现为突变速率）的计算分为两个层面，一是计算肿瘤组织中一定区域内所有细胞的DNA突变总数；二是计算生成这些突变所需要的时间（代次），即邻近肿瘤细胞之间的TMRCA ^{［17，38］}。上升到整个病灶层面，则计算方法就是先计数瘤组织内突变总数，再以增殖代次为分母相除，即得肿瘤基因组突变速率。然而，这种计算是理想化的，很难实现的原因在于，一方面，分析者不可能收集到病灶内所有肿瘤细胞；另一方面，也无法准确估算出肿瘤生长至今的倍增次数。所以，以ABC或MCMC方法在切片上推算邻近肿瘤细胞之间的TMRCA是最便捷的计算途径。过去研究者凭此方法计算得到ER ⁺PR ⁺HER ^-乳腺癌（Luminal A型）基因组突变速率（mutation rate，MR）为0．6核苷酸／（基因组·代），而三阴性乳腺癌的MR为8核苷酸／（基因组·代） ^［38］。因此，分化程度低、恶性程度高、易复发、转移和耐药的三阴性乳腺癌拥有更高进化速率。另一种较便捷的基因组突变速率评估方法是利用微卫星序列（短串联重复序列）的稳定性特征对进化速率进行间接推测。基序长度1～6个碱基的微卫星序列贯穿于人类整个基因组中，占据1．6×10 ⁶个位点 ^［39］。家族性微卫星序列突变和30多种孟德尔遗传疾病相关。由于DNA错配修复机制缺陷，肿瘤微卫星序列可以经常变异，称为“微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）”现象 ^［39］。微卫星不稳定意味着基因组稳定性差，突变速率高。根据微卫星稳定程度，肿瘤可以分为微卫星稳定（MSS）、低度不稳定（MSI-L）和高度不稳定（MSI-H）三种类型 ^［40］。比较三者预后，最差者为MSI-L型，其次为MSS型，最后是MSI-H型 ^［40］。这里，可以看到，MSI-H型肿瘤虽然异质性最强、基因组突变率最高，预后却最好，这提示过度突变对肿瘤是不利的，无助于获得竞争优势，反而易于激发机体免疫反应，使突变负荷过重的细胞被识别和清除 ^［41］。克隆分析中，代表肿瘤整体进化方向的优势克隆在遗传背景中往往呈现异军突起的高频突变峰（在突变数量-等位基因频率二维空间上），这是携带大量晚发突变位点的耐药癌细胞在化疗选择中胜出的表现。但化疗之前，这种耐药进化现象并不存在。因此克隆分析法无法用于预测耐药趋势，只用于事后分析。但是，以来自患者癌细胞所构建的裸鼠（或其他免疫缺陷小鼠）原代肿瘤移植物模型——PDX模型（patient-derived xenograft model），尤其是事先以体外标签技术所构建的原代肿瘤移植到小鼠体内所得的PDX模型，则可清晰揭示出肿瘤细胞的耐药进化规律 ^［42］。体外连续传代条件下，仅有不足10%原代细胞可以获得长期生存机会。但在这个具有癌干细胞特征的稳定（stabilized）细胞群落中，蕴含了几乎所有耐药突变克隆。在PDX模型中平行检测所有稳定克隆的药理学表现，虽发现存在少量交叉耐药克隆，占主体地位的则是各种对不同药物呈差异性反应的独立耐药克隆。这些耐药克隆的基因组大多呈现为中性进化特征，为晚期突变产物 ^［42］。可见，耐药能力并不是肿瘤群落与生俱来的，而是病灶增殖过程中逐渐取得的。这与导致肿瘤生成的大爆炸模型有所不同，是不同区域中子克隆独立加速进化的产物。

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