第六节　质谱技术在多种羧化酶缺乏症诊断中的应用

一、多种羧化酶缺乏症简介

多种羧化酶缺乏症（multiple carboxylase deficiency，MCD）是常染色体隐性遗传代谢病，根据缺乏酶的不同可分为生物素酶缺乏症（biotinidase deficiency，BTD）和全羧化酶合成酶（holocarboxylase synthetase，HCs）缺乏症（HCSD）。MCD主要是由于生物素酶或HCS基因突变，相应酶的活性下降或丧失，导致生物素代谢紊乱而致病。BTD是由于生物素酶活性下降，影响生物素的体内再循环及肠道吸收，导致内源性生物素不足；HCSD是由于HCS活性下降，不能催化生物素与生物素依赖的羧化酶（乙酰CoA羧化酶、丙酰CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶及3-甲基巴豆酰CoA羧化酶）结合。MCD的临床表现缺乏特异性，常规诊断困难。目前通过先进的质谱技术、酶活性测定结合基因突变研究对该病进行早期筛查、诊断和生物素治疗，可降低误诊率、病残率及后遗症的发生率。

二、目前临床诊断多种羧化酶缺乏症的方法

该病的临床表现复杂多样，无特异性，涉及神经系统、皮肤、呼吸系统、消化系统和免疫系统等，新生儿、婴儿早期发病较严重，表现为喂养困难、呕吐、腹泻、难治性皮疹、脱发、肌张力低下、惊厥、意识障碍、共济失调、智力和运动发育落后等。

（一）实验室诊断

常规的生化检测难以诊断MCD，对临床疑似的高危患儿可通过串联质谱分析、尿气相色谱-质谱分析、生物素酶活性测定及基因分析进行诊断。

（二）生物素酶活性测定

进一步对MCD患儿进行生物素酶活性测定可以鉴别BID和HCSD。酶活性低于健康人的10%，考虑为完全型BTD；10%～30%为部分型BID。若酶活性正常，则考虑为HCSD。

（三）DNA分析技术

DNA分析技术是诊断遗传代谢病的特异性方法，能从基因水平明确诊断，准确性高。BTD和HCSD已发现百余种突变，逐一检测，花费时间及精力较大，未来的基因芯片技术有可能在此领域得到发展及突破。

三、质谱技术在多种羧化酶缺乏症诊断中的应用

收集新鲜尿液5～10ml，经萃取处理后，分析尿液中的135种代谢产物，对MCD等有机酸血症有特异性诊断价值。MCD患儿尿液中的3-甲基巴豆酰甘氨酸、3-羟基异戊酸、3-羟基丙酸、甲基枸橼酸、甲基巴豆酰甘氨酸含量增高，并伴有乳酸、丙酮酸、3-羟基丁酸、乙酰乙酸、丙酰甘氨酸等代谢产物的明显增高。

实例：

UPLC-MS/MS法测量生物素缺陷型患者尿液中的3-羟基异戊酸

样品来源：

样品是从10位无明显症状的生物素缺乏症患者中同一时间获得的60个尿样。

实验仪器：

使用超高效液相色谱（UPLC）系统（Waters，Millipore）、Thermo Electron TSQ量子串联质谱仪（MS/MS）（San Jose，CA）对样品进行分析。使用IEC CENTRA CL3-R离心机器（Thermo IEC，Needham Heights，MA）除去尿中的沉淀物。

色谱条件：

样品在自动进样器中冷却至5℃，取样品各1μl注射到配有HSS T3（2.1mm×100mm，1.8μm）色谱柱（Millipore）的UPLC系统中，保持在55℃。流动相为0.01%甲酸和甲醇。初始流动相为0%甲醇，时间保持1分钟恒定。接下来在2分钟内将甲醇含量线性增加至100%，然后在0.2分钟以上降低到0%。重新平衡0.8分钟以完成整个液质周期。整个LC周期流速保持400μl/min恒定。

样品前处理方法：

将待测样品包括质量控制（QC）样品解冻，加热至60℃，30分钟，冷却至环境温度，在3000g下离心10分钟以沉淀尿样，取上清液。使用从健康志愿者中不定时收集的新鲜尿液制备QC标准品，采取40ml等份尿样，合并后，将尿液彻底混合，等分放入15ml管中，立即在-20℃冷冻储存。

结果分析：

UPLC-MS/MS法测定（3-hydroxyisovaleric acid，3HIA）的色谱图如图2-7所示。MS/MS仪检测结果显示MCD患儿的血3-羟基异戊酰肉碱（3-hydroxyisovaleryl-carnitine，C5-OH）增高，可伴有丙酰肉碱（propionylcarnitine，C3）或 C3与游离肉碱（freecarnitine，C0）比值（C3/C0）、C3与乙酰肉碱（acetylcarnitine，C2）比值（C3/C2）增高。10例患儿的血C5-OH浓度（7.83±3.1）μmol/L（正常值 <0.5μmol/L），3 例伴有 C3、C3/C0、C3/C2 增高，2 例 C3/C0、C3/C2增高，3例 C3浓度（6.77±1.86）μmol/L（正常值 <5.0μmol/L），5例 C3/C00.58±0.21（正常值 <0.25）、C3/C20.8±0.34（正常值 <0.4）增高（表 2-8）。

气相色谱-质谱分析：收集新鲜尿液5～10ml或尿滤纸片，GC/MS分析尿中的代谢产物。此方法是半定量法，结果用待测物质与内标的相对总离子流面积比值数表示。MCD患者尿液中的3-甲基巴豆酰甘氨酸明显增高，可伴有3-羟基丙酸、甲基枸橼酸、3-羟基异戊酸、甲基巴豆酰甘氨酸等增高及酮症等。3HIA和IS分析的所有样品的保留时间在2.44～2.48分钟不等。3HIA可作为生物素缺乏的一个指标，UPLC-MS/MS方法可以用来测定3HIA的浓度。

由于MCD的临床表现多样化，常规的生化检测诊断困难。随着串联质谱和气相色谱-质谱技术的发展，对临床高度疑似为MCD的患者进行MS/MS和GC/MS检测，可早期诊断。MS/MS检测血C5-OH增高是MCD的主要诊断指标，由于丙酰CoA羧化酶活性受影响，患者可伴C3、C3/C0、C3/C2增高。但其他有机酸血症如3-羟基-3-甲基戊二酸尿症（HMG）、3-甲基巴豆酰辅酶羧化酶（MCC）缺乏症等血中C5-OH水平也增高，但不伴C3、C3/C0、C3/C2增高，进一步通过尿GC/MS分析进行鉴别：MCD、MCC患者的尿液3-甲基巴豆酰甘氨酸、3-羟基异戊酸均可增高，但MCD因多种羧化酶活性下降，可伴有3-羟基丙酸、丙酰甘氨酸、甲基枸橼酸、甲基巴豆酰甘氨酸、乳酸、丙酮酸及酮体增高，而MCC无这些代谢产物排出增多的情况；HMG患者尿中的特异性3-羟基-3-甲基戊二酸排出增多，无酮体产生，易与上述两种疾病相鉴别（表2-9）。案例中10例患儿的血C5-OH水平均明显增高，尿中的各种异常代谢产物排出增多符合MCD的诊断。诊断中10例患儿中仅1例诊断为生物素酶缺乏症，其余9例生物素酶活性正常，考虑为全羧化酶合成酶缺乏。因此，结果提示MCD患儿的病因多为HCSD，而BTD较少见。

总之，对于临床上原因不明的神经系统损害、难治性皮肤损害、代谢性酸中毒等症，常规检查难以诊断、一般对症治疗无效者，应需警惕生物素代谢相关的有机酸血症（尤其MCD），及早进行MS/MS、GC/MS联合分析及生物素酶活性测定，尽早明确疾病种类，进而早期治疗，降低病死率，改善患者的生活质量。

（李倩　张治然）

参 考 文 献

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