第五节　质谱技术在生物素酶缺乏症诊断中的应用

一、生物素酶缺乏症简介

生物素酶缺乏症是先天性生物素代谢异常的常见疾病，该疾病常表现为严重的神经和皮肤损害，可在各个年龄段发病，其死亡率、致残率极高，生物素补充治疗疗效明显。早期发现、合理治疗是挽救患儿、改善预后的关键。本症的发病情况目前国内报道甚少，自1983年首例生物素酶缺乏症被报道以来，此疾病逐渐受到世界各国的重视，为了使该疾病能够在出现症状前得到诊断，一些先进国家将此症列为新生儿筛查项目之一。本病的遗传方式为常染色体隐性遗传，致病基因为BTD基因。BTD基因上有4个外显子，位于3p25。生物素酶缺乏症可由全羧酶合成酶（holocarboxylase synthetase，HCS）、生物素基酶及外源性生物素酶缺乏所致，其中全羧酶合成酶及生物素基酶缺乏是导致多羧酶缺乏的主要原因，也是生物素酶缺乏的内源性因素。

二、目前临床诊断生物素酶缺乏症的方法

目前，该疾病的诊断主要依靠临床症状、化学分析手段监测血液酯酰肉碱谱、尿有机酸等。经气相色谱-质谱联用分析、尿有机酸测定及干燥滤纸血片生物素酶活性分析（比色法）确诊。同时通过血尿常规检查、血气分析、血氨、血糖、血乳酸、丙酮酸、肝肾功能、心肌酶谱、氨基酸分析、脑或脊髓CT、MRI等辅助检查了解病情。

三、质谱技术在生物素酶缺乏症诊断中的应用

对尿液中有机酸的分析是生物素酶缺乏症筛查与诊断的重要方法，典型患儿尿中可见大量丙酸、丙酮酸、乳酸、β-甲基巴豆酰甘氨酸、巴豆酰甘氨酸、β-羟基异戊酸、丙氨酸等异常代谢物。

实例：

串联质谱技术在生物素酶缺乏症鉴别诊断中的应用

样品来源：

临床疑似遗传性代谢病儿童78例，来自于全国80余家医院，年龄为1天～18岁，平均年龄为5.3岁。

实验仪器：

采用岛津GC/MS2QP2010分析仪、安捷伦1290液相色谱系统和Agilent6490三重四极杆质谱仪。

色谱及质谱条件：

毛细管电压为4000V。去溶剂化气体的温度和流速分别为200℃和11L/min。鞘气的温度和流速分别为100℃和3ml/min。碰撞能为20V。

乙酰肉毒碱（acetyl carnitine，Ac）、丙酰肉毒碱（propionyl，Pc）、丙二酰肉碱（malonyl carnitine，Mc）、丙二酰肉毒碱（methyl malonyl carnitine，MMC）、3-羟基异戊酸肉碱（3-hydroxy isovalerate carnitine，3HIAC）和 3-甲基戊二酰肉毒碱（3-methyl-glutaryl carnitine，MGC）是在选择反应检测模式下进行检测。检测离子对分别为m/z 204-85、218-85、248-85、262-85、262-85和 290-85。

样品前处理方法：

按照采用串联质谱检测干血滤纸片中酰基肉碱和氨基酸的方法制备样品，干血滤纸片经含酰基肉碱和氨基酸内标的甲醇萃取，经盐酸正丁醇衍生后即可上样检测。质控样品采用美国疾病控制和预防中心新生儿筛查质控部门提供的串联质谱酰基肉碱血滤纸片。

结果分析：

液相色谱-质谱法测定尿液样品中的生物素依赖酶的离子色谱图如图2-6所示。这4种疾病患儿的丙酰肉碱水平均显著高于健康儿童的上限值。生物素酶缺乏症和全羧化酶合成酶缺乏症患儿同时伴有C5-OH显著增高（表2-6）。生物素酶缺乏症、全羧化酶合成酶缺乏症、甲基丙二酰肉毒碱、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶缺乏症（3-hydroxy3-methyl-glutaryl，HMG）和酮基硫解酶缺乏症（keto thiolase deficiency，BKT）的串联质谱结果比较，这5种疾病患儿血中的C5-OH水平均高于健康儿童的上限值。MMC、HMG患儿仅表现为C5-OH水平增高，不伴有其他酰基肉碱异常。生物素酶缺乏症和全羧化酶合成酶缺乏症同时伴有C3增高。BKT同时伴有异戊烯酰基（C5：1）增高（表2-7）。