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第二节 血细胞化学染色检查
21.为什么细胞化学染色在血液病诊断中有重要价值
答：细胞化学染色是细胞学和化学相结合的一种技术。它以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞中的各种化学成分（包括酶类、脂类、糖类、铁等）、含量及分布状况做定性、定位、半定量分析的方法。细胞化学染色又称为组织化学染色，简称组化。
常用细胞化学染色包括：①过氧化物酶染色；②过碘酸-席夫染色，又称糖原染色；③氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色，又称粒细胞特异性酯酶染色；④非特异性酯酶染色；⑤酸性磷酸酶染色；⑥中性粒细胞碱性磷酸酶染色；⑦铁染色等。
细胞化学染色临床上主要用于：①辅助判断急性白血病的细胞类型。因为不同血细胞系列，其所含的化学物质成分、分布及含量各有不同，且随着细胞的逐渐成熟，化学物质成分、分布及含量等发生相应的变化。因此依据细胞化学染色结果不同，可推断细胞系列，如过氧化物酶染色、非特异性酯酶染色、特异性酯酶染色等；②辅助血液系统等疾病的诊断和鉴别诊断。因为血细胞在病理情况下，其化学物质成分及含量会发生改变，如中性粒细胞碱性磷酸酶染色、铁染色等。所以，细胞化学染色在血液系统等疾病诊断中具有重要价值，并能为临床鉴别细胞类型、疗效判断、预后评估等方面提供重要依据。
22.为什么要进行过氧化物酶染色
答：过氧化物酶（peroxidase，POX）染色，是最重要的细胞化学染色，是区分急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）和急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）最常用的方法。POX染色是指粒细胞和一部分单核细胞胞质内的颗粒含有过氧化物酶，此酶能将过氧化氢分解，释放出新生态的氧，后者使联苯胺氧化成氧化联苯胺，再与亚硝基铁氰化钠结合成棕色或棕黑色颗粒，沉淀于细胞内。细胞POX反应程度的划分如下：①（-）无颗粒沉着；②（±）阳性颗粒细小、弥散分布；③（+）少数阳性颗粒、局灶分布；④（++）多数阳性颗粒，占胞质的1/2～2/3；⑤（+++）布满阳性颗粒，其间尚有空隙；⑥（++++）布满阳性颗粒，其间无空隙。
各系正常血细胞的POX染色反应为：①粒细胞系统：原始粒细胞阴性，早幼粒细胞以下各阶段细胞，胞质内的棕黑色颗粒逐渐增多。嗜酸性粒细胞呈强阳性反应；嗜碱性粒细胞呈阴性反应。②单核细胞系统：原始单核细胞阴性，单核细胞弱阳性反应，其阳性颗粒细小，形不整，且弥散可覆盖核上。③淋巴细胞系统：均呈阴性反应。④红细胞、浆细胞、巨核细胞和血小板均呈阴性反应。⑤颗粒网状细胞呈阳性反应。
23.为什么过氧化物酶染色可以鉴别急性髓细胞和急性淋巴细胞白血病
答：过氧化物酶（POX）染色是辅助鉴别急性淋巴细胞白血病（ALL）和急性髓细胞白血病（AML）最常用的方法。白血病细胞POX染色阳性率>3%时，可诊断为AML，在AML各型中阳性程度依次为急性粒细胞白血病>急性粒单细胞白血病>急性单核细胞白血病；而白血病细胞POX染色呈阴性或阳性率<3%时（骨髓片中残留的少许原始粒细胞可为阳性反应），可提示ALL。需注意的是，有些分化差的原始粒细胞及原始单核细胞POX染色也呈阴性反应，容易误诊为ALL。
24.为什么要进行糖原染色
答：过碘酸-席夫（periodic acid-schiff，PAS）染色，又称糖原染色。各种类型白血病细胞的胞质内多糖含量和分布不一，因此糖原反应的程度有助于区别白血病细胞类型。血细胞中的糖原、黏多糖、糖蛋白、糖脂和纤维蛋白等的化学结构中含有乙二醇基，在过碘酸的作用下，使细胞内含有乙二醇的多糖类物质氧化而产生双醛基，醛基与雪夫染液中的无色品红结合产生紫红色化合物。PAS阳性反应物可呈红色颗粒、块状物或弥漫状，定位于细胞胞质内。细胞含糖原量少者，呈粉红色；量多者，呈深紫红色。这种物质可被唾液淀粉酶水解，故可供对照用，经此处理后为阴性者，表明糖原存在；如仍为阳性反应，则表明有其他多糖。糖原是细胞进行生命活动所需能量的主要来源，反映着细胞功能成熟的过程。
各系正常血细胞PAS染色反应为：①粒细胞系统：原粒细胞呈阴性反应，自早幼粒细胞至中性分叶核粒细胞均呈阳性反应，并随细胞的成熟阳性反应的程度逐渐增强，阳性呈弥漫状、细颗粒状；嗜酸性粒细胞中的颗粒不着色，细胞质为阳性；而嗜碱性粒细胞中的颗粒着色，细胞质为阴性。②单核细胞系统：原始单核细胞呈阴性，幼稚单核细胞及单核细胞呈阳性，阳性多数呈细颗粒状，有时在胞质的边缘处阳性颗粒较粗大。③淋巴细胞系统：大多数呈阴性，少数呈阳性，阳性呈粗颗粒状或块状。④红细胞系统：有核红细胞和成熟红细胞均呈阴性。⑤巨核细胞系统：巨核细胞和血小板呈阳性，阳性呈粗大颗粒状或块状。⑥少数浆细胞呈阳性反应，巨噬细胞可呈阳性反应，两者均呈细颗粒状。
25.为什么糖原染色有助于区别白血病细胞的类型
答：因为各种类型白血病细胞的胞质内多糖含量和分布不一，因此糖原反应的程度也不同，有助于区别白血病细胞类型。①急性粒细胞白血病：原始粒细胞呈阴性或弥散阳性；②急性早幼粒细胞白血病：白血病性早幼粒细胞呈片状或弥散阳性；③急性单核细胞白血病：原始及幼稚单核细胞呈阴性或阳性，阳性为细颗粒状，胞质边缘及伪足处颗粒粗大些；④急性淋巴细胞白血病：原始及幼稚淋巴细胞多数阳性，阳性呈粗颗粒状或块状，围绕核周呈环形排列，胞质底色无红色；⑤红血病及红白血病：幼红细胞可呈阳性或强阳性，成熟红细胞有时亦可为阳性；⑥急性巨核细胞白血病：原始巨核细胞呈阳性或强阳性，阳性呈颗粒状或块状。
26.为什么糖原染色有助于鉴别红白血病和巨幼细胞贫血
答：正常人有核红细胞和成熟红细胞的糖原染色均为阴性。但在红白血病时，幼红细胞糖原染色多呈阳性或强阳性反应，阳性率高，反应强，成熟红细胞有时亦可为阳性。其他类型急性白血病或慢性白血病的幼红细胞和成熟红细胞的糖原染色均为阴性反应。而在巨幼细胞贫血时，幼红细胞和成熟红细胞的糖原染色均呈阴性反应。所以，幼红细胞糖原染色对红白血病的诊断和巨幼细胞贫血的鉴别颇有价值。
27.为什么要进行非特异性酯酶染色
答：非特异性酯酶染色，同时做氟化钠抑制试验能较好地区分急性粒细胞白血病与急性单核细胞白血病。血液细胞内的非特异性酯酶及其同工酶种类很多，都是作用于短链脂肪酸、水解醇和酚的羟酸酯，习惯上称非特异性酯酶者，实际上是指中性非特异性酯酶染色法。此法因底物不同，分成α-醋酸萘酚酶染色法、醋酸萘酚AS酯酶染色法和醋酸萘酚AS-D酯酶染色法3种，以α-醋酸萘酚酶染色法最为常用。
血细胞内的α-醋酸萘酚酯酶（α-naphthol acetate esterse，α-NAE）将孵育液中的基质-醋酸萘酚水解，产生-萘酚，萘酚再与重氮盐偶联，生成不溶性灰黑色或棕黑色沉淀，定位于细胞质内酶所在部位。色反应强度可分为：灰黑色（弱阳性）、棕黑色（阳性）和深黑色（强阳性）。氟化钠抑制试验是在非特异性酯酶染色的基础上，再做氟化钠抑制试验时，单核细胞系统的阳性可被氟化钠抑制，而粒细胞则不被抑制。抑制即将原着色之沉淀去掉；不抑制即原着色之沉淀颗粒物未去掉。
各系正常血细胞α-NAE染色反应为：①单核细胞系统：原始单核细胞呈阴性或弱阳性反应，幼稚单核及单核细胞呈阳性反应，阳性反应能被氟化钠抑制。所谓抑制是指氟化钠试验的抑制率大于50%；②粒细胞系统：各期粒细胞呈阴性或弱阳性反应，阳性反应不被氟化钠抑制；③淋巴细胞系统：大多数呈阴性，少数呈阳性，阳性反应不被氟化钠抑制；④巨核细胞和血小板呈阳性反应，阳性反应不被氟化钠抑制；⑤其他血细胞：幼红细胞呈阴性反应，有时少数幼红细胞可呈弱阳性反应，阳性反应不被氟化钠抑制。浆细胞呈阴性反应。
28.为什么在进行α-醋酸萘酚酯酶染色的同时需做氟化钠抑制试验
答：在α-醋酸萘酚酯酶染色基础上同时做氟化钠抑制试验能较好地区分急性单核细胞白血病与急性粒细胞白血病。①急性单核细胞白血病：原始及幼稚单核细胞大多数呈阳性或强阳性，但能被氟化钠抑制；②急性粒细胞白血病：原始粒细胞呈阴性或弱阳性，阳性不被氟化钠抑制；③急性早幼粒细胞白血病：白血病性早幼粒细胞呈阳性或强阳性，阳性不被氟化钠抑制；④急性粒-单核细胞白血病：阳性反应的单核细胞系白血病细胞能被氟化钠抑制，而粒细胞系白血病细胞不被氟化钠抑制；⑤急性淋巴细胞白血病：原始及幼稚淋巴细胞呈阴性或弱阳性，阳性不被氟化钠抑制。
29.为什么要进行氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色
答：氯乙酸AS-D萘酚酯酶（naphthol AS-D chloroacetate esterase，NAS-DCE）染色，又称粒细胞特异性酯酶染色，其阳性反应几乎仅见于粒系，因此其对诊断粒细胞白血病较过氧化物酶染色更具特异性。血细胞内的NAS-DCE将基质液中的氯乙酸AS-D萘酚水解，产生萘酚AS-D，再与稳定的重氮盐偶联，生产不溶性红棕色沉淀，定位于细胞质内酶所在部位。细胞NAS-DCE反应程度的划分如下：①（-）胞质无色；②（+）胞质呈淡红色；③（++）鲜红色布满胞质；④（+++）深红色充满胞质。
各系正常血细胞NAS-DCE染色反应为：①粒细胞系统：原始粒细胞呈阴性或阳性，自早幼粒细胞至成熟中性粒细胞均呈阳性，酶活性并不随细胞的成熟而增强；②单核细胞系统：仅个别细胞呈弱阳性，其他呈阴性；③淋巴细胞、浆细胞、有核红细胞、巨核细胞和血小板均呈阴性。
NAS-DCE染色在各种类型白血病中表现为：①急性粒细胞白血病：原始粒细胞多呈阳性反应；②急性早幼粒细胞白血病：白血病性早幼粒细胞多呈强阳性反应；③急性单核细胞白血病：原始和幼稚单核细胞几乎均呈阴性反应；④急性淋巴细胞白血病：原始和幼稚淋巴细胞呈阴性反应。
30.为什么要进行酸性磷酸酶染色
答：酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）染色，在诊断和鉴别多毛细胞白血病时最常用。血细胞内的ACP在酸性条件下水解基质液中的磷酸萘酚AS-BI，释放出萘酚AS-BI，后者与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的红色沉淀，定位于细胞质内酶所在部位。有些细胞中的酸性磷酸酶耐酒石酸，故抗酒石酸酸性磷酸酶染色有助于疾病的诊断及鉴别诊断。细胞ACP反应程度的划分如下：①（-）胞质无色；②（+）胞质呈淡红色；③（++）胞质布满鲜红色；④（+++）胞质充满深红色。
正常血细胞ACP染色反应为：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、巨噬细胞均呈阳性。
ACP染色主要用于疾病的诊断和鉴别诊断。①诊断多毛细胞白血病：毛细胞ACP染色呈阳性或强阳性反应，且阳性不被酒石酸抑制；慢性淋巴细胞白血病和恶性淋巴瘤时也可呈阳性反应，但阳性可被酒石酸抑制；②戈谢细胞和尼曼-匹克细胞的鉴别：戈谢细胞ACP染色呈强阳性反应；尼曼-匹克细胞ACP染色呈阴性或弱阳性反应。
31.为什么碱性磷酸酶被称为中性粒细胞的标志酶
答：血细胞含有的磷酸水解酶主要为碱性磷酸酶。碱性磷酸酶由许多同工酶组成，在碱性条件下（最适pH为9.3～9.6）催化各种醇和酚的单磷酸酯，以磷酸萘酚AS-MX为底物，以偶氮盐为偶联剂的Kaplow法和Tomonaga法。这两种染色显示碱性磷酸酶反应产物清晰、易辨认、不弥散，而且孵育时间短，稳定。
碱性磷酸酶主要分布在中性粒细胞的特殊颗粒内，是中性粒细胞的标志酶，所以又称为中性粒细胞碱性磷酸酶（neutrophilalkalinephosphatase，NAP）。碱性磷酸酶的含量以成熟粒细胞（主要是杆状和分叶核细胞）为最高，原始粒细胞碱性磷酸酶反应阴性。其他血细胞，如嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨核细胞、浆细胞及红细胞系统细胞都无碱性磷酸酶活性。
32.为什么要进行中性粒细胞碱性磷酸酶染色
答：中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）主要存在于成熟粒细胞中，NAP染色测定其活力及积分不但有助于白血病类型的鉴别，还可为判断疗效及预后提供重要依据。NAP在pH 9.3～9.6的条件下，将基质液中的α-磷酸萘酚钠水解，产生α-萘酚，α-萘酚与重氮盐偶联形成不溶性灰黑色或黑色沉淀，定位于酶活性所在之处。NAP染色及积分参考标准如下：①（-）阴性反应，为0分；②（+）胞质出现灰褐色沉淀，为1分；③（++）胞质深褐色沉淀，为2分；④（+++）胞质中已基本充满棕黑色颗粒状沉淀，但密度较低，为3分；⑤（++++）胞质全被深黑色团块沉淀所充满，密度高，甚至遮盖胞核，为4分。
NAP存在于成熟粒细胞中，在显微镜油镜（放大1000倍）下，计数100个成熟中性粒细胞，求得阳性细胞百分数和积分值。100个细胞中阳性细胞总数即为阳性率，100个细胞中阳性细胞分数总和即为积分。正常人NAP参考积分值为14～113分。有些生理因素可使酶活性发生改变，如应激状态、经前期、妊娠期、新生儿等可使NAP活性增加。
33.为什么在慢性粒细胞白血病中中性粒细胞碱性磷酸酶积分是降低的
答：中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）的活性可反映成熟粒细胞的成熟程度和功能，随着细胞的成熟，酶的活性也逐渐增强。而慢性粒细胞白血病的慢性期，虽然是粒细胞增多，但NAP活性是降低甚至消失，故NAP积分值减低，甚至为0分。但在慢性粒细胞白血病的缓解期，NAP积分值可恢复至正常范围，到加速期和急变期，NAP积分值可有不同程度增高。NAP检测可作为观察慢性粒细胞白血病疗效和预后的一项指标。
34.为什么中性粒细胞碱性磷酸酶染色有助于多种疾病的鉴别诊断
答：中性粒细胞碱性磷酸酶染色对以下疾病鉴别诊断有一定参考价值：①有助于细菌性感染与病毒性感染的鉴别：前者显著增高，后者一般无明显变化；②有助于类白血病与慢性粒细胞白血病的鉴别：前者常显著增高，而后者明显减低，常为0分；③有助于急性淋巴细胞白血病与急性粒细胞白血病的鉴别：前者常增高，后者常降低；④有助于再生障碍性贫血与阵发性睡眠性血红蛋白尿症的鉴别：前者常增高，后者常降低；⑤有助于真性红细胞增多症与继发性红细胞增多症的鉴别：前者常增高，后者常降低；⑥有助于反应性组织细胞增多与恶性组织细胞病的鉴别：前者常增高，后者常降低。
35.为什么在进行骨髓铁染色时要观察细胞外铁
答：正常人骨髓中贮有一定量的铁，这种铁以含铁血黄素的形式存于骨髓的网状组织和网状细胞内，以供红细胞合成血红蛋白之用。在光学显微镜下所见之铁即含铁血黄素铁，称之为细胞外铁。细胞外铁是机体中储存铁的主要形式之一。骨髓中所含铁团块之三价铁与蛋白质的结合不牢固，可经稀盐酸处理后游离出来，三价铁在酸性溶液中与亚铁氰化钾作用后，呈现阳性普鲁士蓝色反应。
细胞外铁主要存在于骨髓小粒的巨噬细胞中。先用低倍镜于涂片尾部找到骨髓小粒，然后用油镜（放大1000倍）判断铁量多少。标准如下：①（-）无蓝色铁颗粒；②（±）似乎显示蓝色铁颗粒；③（+）少许蓝色铁颗粒或偶见蓝色小珠；④（++）蓝色铁颗粒较多，并杂以蓝色小珠；⑤（+++）蓝色铁颗粒多，其间含有蓝色小珠和少许蓝色小块；⑥（++++）蓝色铁颗粒极多，其间很多蓝色小珠小块。正常人细胞外铁为（+）～（++），约2/3的人为（++）， 约1/3的人为（+）。
36.为什么在进行骨髓铁染色时要观察细胞内铁
答：正常机体中各阶段有核红细胞和无核红细胞中含有铁，这种铁多以铁蛋白或铁粒的形式存于细胞内，用普鲁士染色法可显示出来，只是原始和早幼红细胞含铁量甚微，又不集中，所以用普鲁士染色不能反应出来；而中、晚幼红细胞含铁较多，且集中，此法结果可以看到蓝色的颗粒铁。有核红细胞含铁粒者，称为铁粒幼红细胞；无核红细胞含铁粒者，称为铁粒红细胞。
细胞内铁主要存在于中、晚幼红细胞中。在显微镜油镜（放大1000倍）下，计数100个中、晚幼红细胞，记录细胞质中含有蓝色铁颗粒细胞（即铁粒幼红细胞）的百分数，同时注意细胞内铁颗粒数目、大小、分布排列情况，尤其要注意有无环核铁粒幼红细胞（是指幼红细胞含铁粒>6绕核径2/3以上者）。按细胞阳性程度归为以下4型：①Ⅰ型（正常型）：胞质内有1～2个铁粒；②Ⅱ型：胞质内有3～5个铁粒；③Ⅲ型：胞质内有6～10个铁粒；④Ⅳ型：胞质内含铁颗粒11个以上。正常人铁粒幼红细胞阳性率约为19%～44%，以Ⅰ型为主，少数为Ⅱ型，无环核铁粒幼红细胞。
37.为什么骨髓铁染色是鉴别缺铁性贫血和其他贫血简便而可靠的方法
答：骨髓铁染色的表现如下，①缺铁性贫血：细胞内铁、细胞外铁都减少，甚至消失，经铁剂治疗有效后，细胞内外铁又恢复正常；②其他非缺铁性贫血，如溶血性贫血、巨幼细胞贫血、再生障碍性贫血等，其细胞内铁和细胞外铁都正常或增加；③铁粒幼红细胞性贫血：细胞内外铁明显增多，环核铁粒幼红细胞增多（如在有核红细胞中环核铁粒幼红细胞>15%，则可有助于骨髓增生异常综合征伴环核铁粒幼红细胞增多的诊断）。因此，骨髓铁染色可作为诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的重要检查方法，是诊断和鉴别缺铁性贫血和其他贫血的简便而可靠的方法之一。
（陈琼）