答：骨髓活体组织检查（bonemarrow biopsy，BMB），简称骨髓活检，就是用一个特制的穿刺粗针取一块大为0.5～1cm长的圆柱形骨髓组织来做病理学检查，常作为骨髓穿刺术的一部分，通过观察骨髓组织结构和空间定位，补充骨髓涂片检查诊断的一个有效方法，能提供更为具体的骨髓细胞结构信息以及疾病的程度。骨髓活检的适应证包括：①骨髓穿刺多次失败（怀疑骨髓纤维化、骨髓转移癌、多发性骨髓瘤、毛细胞白血病、某些急、慢性白血病及骨髓硬化症等）；②血象显示全血细胞减少，反复骨髓穿刺均为 “血稀”或骨髓增生低下，病态造血，怀疑再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征及低增生性白血病的患者；③某些贫血、原因不明的发热、脾脏或淋巴结肿大，骨髓涂片检查不能确诊者；④对白血病疗效的观察有指导价值。有时骨髓涂片已达到完全缓解，但骨髓活检切片内仍可检出白血病性原始细胞簇，因此，在急性髓细胞白血病的缓解后化疗及长期无病生存期间，应定期做骨髓双标本取材。倘若骨髓涂片未达复发标准，而切片内出现了异常原始细胞簇，提示已进入早期复发，应及时对症治疗。骨髓活检除血友病外目前没有绝对的禁忌证，但是，对于一般情况患者来说有一些相对的禁忌证及一些特殊患者如婴幼儿麻醉或者深部镇静的风险。穿刺活检部位如髂后上棘皮肤的活动性感染，会影响穿刺部位的使用。然而，如果符合骨穿适应证的话，穿刺也可以在其他部位进行。其他被用于做骨穿的部位常常包括髂前上棘、胸骨柄、胫骨（婴儿），及很少使用的椎骨。血小板减少及其他凝血障碍对于一个熟练的骨穿操作者来说并不是骨穿的禁忌证。胸骨不作为骨髓活检的推荐部位。

答：20世纪80年代以前，临床上血液病的骨髓检验一般仅凭骨髓抽吸物涂片细胞形态学分析作为判定的主要依据。应该说这种方法通过油镜下可以清楚地观察细胞形态和结构，但骨髓的分布并不均匀，增生的骨髓细胞浸润较为广泛，发育不全的骨髓变化，则呈散在分布，很不均匀。不能较全面的观察组织结构，无论是骨髓增生度还是对疾病本身的判定都存在明显不足，骨髓活检有利于髓内组织构形的保存，更有助于从造血主质、脂肪细胞、间质和骨小梁结构关系的研究中获取更多的信息（如骨髓增生度、骨髓纤维化、病态造血），能较全面的观察组织结构。近年来结合传统的血涂片、骨髓涂片与骨髓活检切片病理学（形态学、组织化学和特异性免疫标记）的信息，进行综合分析判定可以明显提高诊断的准确性。

答：骨髓涂片用于血液疾病诊断开展早，相对简便易行，优点在于可重复及多次穿刺，对单个细胞的形态观察优于骨髓活检。反映的是血细胞数量、形态和比例的改变，但不能有效反映骨髓组织结构及间质成分的变化，而了解骨髓造血组织的结构和细胞之间和组织之间的相互关系对很多血液系统疾病的诊断都具有重要意义，在某些情况下骨髓涂片有明显的局限性：如造血细胞减少不等于增生减低（骨髓纤维化、细胞之间的黏附和塞实导致的肿瘤细胞负荷的估计偏差、造血 “热点”的观察）、骨髓外来细胞的浸润、微小残留病灶的观察、幼稚前体细胞异常定位等。骨髓活检能保持造血组织的天然结构，便于判断红髓和脂肪组织的比例，能较全面的了解骨髓真实的增生程度，有核细胞密度及其分布，可以避免血窦血的稀释，特别对骨髓纤维化、毛细胞白血病、再生障碍性贫血、肿瘤的骨髓转移有确诊作用，能提示骨髓增生异常综合征的病态造血，对 “干抽”（抽不出骨髓）现象，有鉴别作用，此时做骨髓活检常可获得阳性结果，骨髓涂片及活检同时进行，更全面可靠。

答：骨髓活检和骨髓穿刺比较各自有优缺点，临床上骨髓穿刺较为常用，两者检查应当是相辅相成的，见表1-2。

答：骨髓活检必须按规范操作。在获得患者或者监护人的同意后，首先检查患者的标示符，确保患者已做好骨穿准备，确保选择正确骨穿部分进行操作。如果选择髂后上棘进行穿刺活检，患者一般采取侧卧位或者是俯卧位进行骨穿。对骨穿部位进行消毒，铺无菌洞巾；注射局麻药物，使之浸润皮肤，软组织及骨膜。局麻药物起作用后，操作方法与骨髓穿刺术相仿，做一个小切口，使其能插入活检针，随后进行活检，调整针尖以不同的角度刺入骨头。使用顺时针方向，使针刺入骨膜。取出针芯，继续旋转进针约2cm。当遇到阻力时，可通过插入针芯，来估计标本的深度。从针中心到针芯螺旋盖的距离就是针管内活检标本的长度。在成人中，取标本的长度约2cm。为了确保标本不会留在组织中，当退针时顺时针和逆时针旋转穿刺针几次，并朝不同方向来回轻轻摇动，然后缓慢地拔出针头。拔出针头后，用另一根细点的针芯或探针把活检组织从针管里取出，放在无菌纱布上或者是玻片上。随后将活检标本放入贴有标签的含有固定液的无菌容器里。压迫止血数分钟或更长时间（凝血障碍患者），用酒精或其他消毒剂消毒穿刺部位，敷上干净或浸有抗生素的纱布块，并可使用绷带压迫。绷带在24小时后应被取下。一旦纱布移位了，必须监测感染及出血情况。

答：骨髓活检与骨髓涂片是相辅相成的，骨髓活检可有效提高骨髓异常性疾病诊断的准确率，骨髓活检的临床意义在于及有助于诊断的疾病包括：可较全面而准确地了解骨髓增生程度，造血组织、脂肪组织或纤维组织所占的容积比例；了解粒红比值及骨髓内铁储存情况，对于某些疾病（如再生障碍性贫血、缺铁性贫血及骨髓增生异常综合征）及化疗后骨髓抑制程度有明确的诊断价值；可以发现骨髓穿刺涂片检查不易发现的病理变化，当骨髓增生极度活跃或极度低下，纤维组织增多及骨质增生而发生干抽或骨髓稀释时活检显得格外重要，如低增生白血病、毛细胞白血病、骨髓纤维化、骨髓坏死、恶性肿瘤累及骨髓等。对相关疾病的诊断、骨髓造血微环境及骨髓移植的研究有重要意义；活检比涂片能较早的预测疾病的预后，因骨髓活检比涂片能更早、更全面的发现早期的病理改变，对各种急、慢性白血病和骨髓增生异常综合征有确诊和判断预后的意义，对骨髓转移癌、恶性组织细胞病，戈谢病和尼曼-匹克病等诊断的阳性率比骨髓涂片高；活检可协助诊断慢性骨髓增生性疾病，如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化等；对骨病本身和某些骨髓疾患，例如囊状纤维性骨炎、骨纤维发育异常症、变应性骨炎（Paget病）、骨软化症、骨质疏松症和骨髓腔真菌感染等的诊断，骨髓活检也能提供有意义的资料；未正确判断骨髓铁贮存，尤其疑为贮铁降低或缺铁时，在骨髓活检切片上作铁染色较涂片为优。

答：由于骨髓与其他生物学标本切片制备有明显不同，存在一些自身的特点如不均质性（坚硬的骨小梁和柔软的髓质和脂肪构成的混合体）、对于细胞形态观察的要求很高等。20世纪九十年代开始，随着骨髓活检技术的广泛开展，活检标本的处理包埋方法不断改进。主要有3种途径：脱钙的石蜡包埋、不脱钙的塑胶包埋（乙二醇-甲基丙烯，GMA）和不脱钙的最适切割温度（optimum cutting temperature，OCT）冰冻切片。①脱钙的石蜡包埋切片：细胞形态皱缩、只能分清晚幼红、晚幼粒和巨核系，脱钙后无法精确观察骨小梁等结构、优点是可进行免疫表型检测；②不脱钙的OCT冰冻切片：细胞形态差、冰冻切片易致抗原扩散出现人为染色反应；③不脱钙的塑胶（GMA）包埋切片：价格低廉、操作简便，细胞形态清晰、容易分辨各系细胞，适于推广，不脱钙可以精确观察骨小梁等结构、由于聚合过程中的高温热效应所致的酶性破坏或抗原遮蔽无法进行免疫表型检测，其他的改进型可以克服这一缺点（如冷-真空、丙酮和甲基丙烯酸甲基酯MMA等），但由于操作较繁琐目前应用较少。

答：骨髓活检块离体之后需要经过以下几个步骤：固定（Bouin液30～60分钟，不超过3小时）、脱水（乙醇梯度60%→70%→80%→95%→100%脱水）、塑胶包埋、切片与制片、常规染色、特殊染色等一系列过程。制片需要制成2～3μm和5μm两种。每份标本常规切片5～8张，由于切片制片是连续性的，为了观察不同的细胞和组织学形态特征，减少信息偏移，制片时需要采用顺序轮换的方法安排每一张载玻片上的切片条。常规染色方法包括苏木精-伊红（HE）染色（2～3μm厚）　（仅供记点用），对粒红巨三系形态进行初步观察；苏木精-Giemsa-酸性品红（HGF）染色（2～3μm厚），对各系形态观察更为清楚，特别是嗜酸粒和巨核系；PAS染色，在区分原始粒系和淋巴系上有意义，另外纤维组织增生时PAS染色也是阳性，在网硬染色不理想时可以做一定参考；网硬蛋白纤维（Gomori）染色（5μm厚）；铁染色。

答：骨髓活检切片常规需观察以下内容：骨膜组织与皮质骨；骨小梁-骨髓造血组织-脂肪组织的结构；骨小梁是骨皮质在松质骨内的延伸部分，在骨髓腔中呈不规则网状立体结构，如丝瓜络样，起支持造血组织的作用，骨小梁形态有无破坏、疏松、溶解、增宽、变细、侵蚀、软化和硬化；骨重建情况判定；骨髓病理检查中首先要观察骨髓细胞增生程度，然后对各系统各阶段造血细胞成分病理变化作细致观察及分析，造血组织与脂肪组织比例（红系、粒系、单核系、巨核系、粒红比）；骨小梁之间充满骨髓组织，包括造血细胞、非造血细胞和血管间质等，此为狭义的骨髓组织。间质构形的评估（脂肪、纤维、血管与静脉窦、网状巨噬细胞、淋巴浆细胞、肥大细胞和间接分裂等）；贫血患者的铁评估；外来恶性细胞；淋巴集簇和淋巴小结；病理结论。

答：可用显微镜目镜网格测微尺测定、电脑自动分析系统测定或根据脂肪细胞与造血组织所占面积或容量（volum）凭经验测定。常用网形测微器计点法计算造血、脂肪组织和骨小梁。造血组织VOL%=造血组织击中数/（造血组织击中数+脂肪组织击中数+骨小梁击中数）×100%。采用骨髓增生程度四级分法，与骨髓穿刺涂片的增生程度分级一致，例如骨髓脂肪细胞空泡的面积骨髓造血细胞面积各占50%即增生程度大致正常，与涂片分级为 “增生活跃”为同义词。四级分法如下：①增生极度活跃：记为++++，造血组织面积≥90%；②增生明显活跃：记为+++，造血组织面积50%～89%；③增生活跃，记为++，造血组织面积35%～49%；④增生极度低下，记为+，造血组织面积≤34%，增生极度低下常伴有间质水肿，脂肪组织显著增生，更无巨核细胞，不见骨内膜细胞。因为不同的疾病其骨髓增生程度是不一样的，例如慢性粒细胞白血病必须是增生极度活跃的，急性再生障碍性贫血必定是增生极度减低的，否则就不能诊断这两种病。换句话说，增生极度活跃和增生极度减低分别是诊断这两种病的必要条件之一。

答：成纤维细胞（fibroblast cell）来自未分化间叶细胞，胞体中等大，梭形，两端尖，核梭形，有核仁。成纤维细胞发育为纤维细胞后胞体细长，胞浆嗜酸性两端有分叉，即形成胶原纤维，胞核细杆状，两端尖，无核仁。在胶原纤维形成之前已有网硬蛋白（reticulin）或网状纤维形成，由纤维细胞、成纤维细胞及胶原纤维构成的组织称纤维组织。骨髓坏死后、骨髓转移瘤、肿瘤或白血病放或化疗后常引起骨髓纤维组织反应性增生。纤维组织增生主要受血小板释放的成纤维细胞刺激因子及其他多种因子的影响。可用Masson三色染色法显示病理切片中的胶原纤维，呈绿色。嗜银染色网状纤维呈粗细均匀的黑色发丝状。在骨髓活检病理诊断中常常根据网状纤维稀疏密度进行分级：一般分为五级或 “0～4+”。

答：网硬蛋白（Gomori银浸）染色网状纤维积分的分级标准：①+/-（正常）：偶见纤细或粗大的单一纤维丝，或同时可见血管周围的局限性纤维网络；②+：可见贯穿于切片大部分区域的纤细纤维网络；③++：可见弥漫性纤维网络伴以散在分布的粗纤维增多现象；④+++：可见弥漫性的粗纤维为主的网络形成，但胶原纤维的三色染色（Masson）为阴性；⑤++++：可见弥漫性的粗纤维为主的网络形成，但胶原纤维的三色染色阳性的胶原形成区。大部分正常人骨髓中网状纤维为0～+级，偶尔也可有++级者。正常时网状纤维主要集中在血管周围。在评估骨髓中网状纤维的含量时，上述部位的网状纤维应排除。骨髓纤维化是指骨髓中胶原纤维增多，单纯网状纤维增多不称骨髓纤维化。为了避免混乱，在临床诊断中习惯根据上述半定量法区分，把网状纤维在 “+++”以上，并有胶原纤维增生占视野1/3以上者诊断为骨髓纤维化或纤维化期。

答：有研究对各种血液病骨髓活检的网状纤维阳性强度及其检出率和分布方式进行观察，结果表明从检出率来看骨髓纤维化和骨髓转移瘤阳性率最高（100%），其次为多发性骨髓瘤（93.3%）、原发性血小板增多症（85.7%）、骨髓增殖性疾病（不能分类）（76.5%）及骨髓增生异常综合征（59.1%），再生障碍性贫血阳性率最低（5%），从骨髓网硬蛋白分布方式来看：骨髓转移癌的网状纤维总是环绕癌巢分布，而转移性肉瘤的网状纤维和造血细胞肿瘤组织的网状纤维总是穿插瘤细胞之间的。与髓系肿瘤与淋巴系肿瘤，尤其是与骨髓瘤的网状纤维密度方面有显著不同，这在某些血液病骨髓活检诊断与鉴别诊断中有重要参考意义。

答：铁染色在贫血性疾病、骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes， MDS）铁过载、MDS中伴有环形铁粒幼细胞增多的难治性贫血等疾病的诊断与鉴别中意义较大，铁染色分级标准包括：①0：切片内无含铁血黄素颗粒；②+：低倍镜下偶见间质中散在细小蓝色颗粒和（或）巨噬细胞，细胞质中细小蓝色颗粒。每3～4个高倍镜视野可见少数带有细小铁颗粒的细胞；③++：低倍镜下易见间质中散在大小不一的蓝色颗粒和（或）巨噬细胞，细胞质中大小不一的蓝色颗粒，每2～3个高倍视野可见较多带有铁颗粒或小珠的细胞；④+++：低倍镜下易见间质中散在大小不一的蓝色颗粒和（或）巨噬细胞，细胞质中大小不一的蓝色颗粒，明显增多，颗粒较大，每个高倍视野可见1个或多细胞内有铁粒或铁小块；⑤++++：低倍镜下易见间质中散在大小不一的蓝色颗粒和（或）巨噬细胞，细胞质中大小不一的蓝色颗粒，显著增多，分布广泛，颗粒可聚集成团块，高倍镜下切片内带有铁粒、小珠和小块之细胞密集成堆。

答：骨小梁及其周围区域和幼红细胞簇是骨髓活检中较为重要的组织区域，骨小梁由层板骨构成的复层结构，表面被覆一层骨内膜细胞，光镜下为连续的内膜衬里细胞层，骨细胞定位于基质陷窝内。骨小梁的形态观察对于骨髓活检切片读片十分重要，尤其观察骨小梁旁开50μm的 “小梁旁区”的造血细胞分布特征。伴有吞噬功能的网状-巨噬细胞、形成网眼的网硬蛋白纤维支架、血管系统和脂肪细胞共同构成骨髓间质。造血细胞散布于网眼及血管外间隙。幼红细胞簇（岛）定位于骨小梁间区静脉窦附近，在活体内呈球状。1～2个巨噬细胞定位于中央，四周围绕不同发育阶段的幼红细胞，内层的往往较外层更加幼稚。由于切片厚度仅为2～3μm，往往很难看到完整的、典型的幼红细胞簇（岛），而更常见的是中央无巨噬细胞的幼红细胞簇（岛）。

答：①伴吞噬功能的网状-巨噬细胞实体，以及形成网眼的网硬蛋白纤维支架，外加血管系统和脂肪细胞共同构成骨髓间质，造血细胞（又称红髓或主质）散布于网眼及血管外间隙内；②红系前体细胞定位于骨小梁间区静脉窦附近，在活体内呈球状，1～2个巨噬细胞定位于中央，四周围绕不同发育阶段的幼红细胞，内层的往往较外层更加幼稚；③原始粒细胞与早幼粒细胞常单个（至多两个）散布于小梁旁区及小微动脉四周，组织学上可见越靠近骨小梁的粒细胞越幼稚，形成较窄的2～3层幼稚细胞带，越远离骨小梁越成熟。骨髓标本超微结构也显示未分化幼稚细胞靠近骨小梁（正常早期粒系生成的部位），支持这些的前体细胞来自骨内膜细胞。粒系细胞有6个发育阶段，3个系列，即中性粒细胞，嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞随着成熟逐渐定位于小梁间区并渐次向静脉窦窦壁移动，最终由孔隙释放入血；④巨核细胞一般聚集于静脉窦窦壁外，少数也可散布于全骨髓切片的不同区域。成熟巨核细胞通过窦壁内皮间小孔隙，以原浆带状结构自巨核细胞上剥落后释放血小板进入窦腔内，继而入血液循环；⑤淋巴细胞、浆细胞和单核细胞常定位于造血主质的小动脉或静脉窦四周。

答：正常骨髓切片内的原始、原单和早幼粒细胞等前体细胞应单个（至多两个）散布定位于小梁旁区，倘若3～5个以上聚集成簇，位于小梁间区、中央区和旁区，则称之为幼稚前体细胞的异常定位（abnormal localization of immature precursor，ALIP）。若能根据集簇的大小并结合免疫酶标染色，则更加精确。ALIP现象是MDS的病理组织学特征。每平方毫米骨髓面积中至少检出3处即为阳性，但必须以HGF或MGG染色的切片为准，而不能以HE染色进行判定。一般认为，在MDS全部的RAEB/RAEB-T和CMML等高危病例的骨髓切片中，均可检出ALIP；而在RA、RARS、RCMD、RCMD-RS和5q-综合征等其他低危病例中仅约50%存在ALIP样簇状结构，此时骨髓涂片中常无原始细胞过多现象。

答：骨髓活检切片能保持造血组织的天然结构，有助于正确判定MDS患者造血组织面积和增生程度，约60%MDS患者造血组织面积>50%，即增生异常活跃型；25%病例在25%～50%，即增生正常型；另15%为增生减退型，其造血组织面积<25%。所有MDS患者活检切片均伴有不同程度的局部解剖学异常，即骨髓正常构形的破坏，包括正常人不同发育阶段的粒系细胞主要分布于小梁旁区，而MDS时常向小梁间的中央区转位，幼红细胞岛和巨核系细胞由正常的小梁间区和中央区移向小梁旁区或骨小梁表面。正常骨髓活检切片内的原始细胞由原来的散在定位于小梁旁可聚集成簇。约80%的MDS患者可见巨核系病态造血，且活检切片较涂片更易查出，这主要与切片上的巨核细胞较涂片为丰富的缘故。此外，约50%的MDS患者切片内伴有轻至中度骨髓纤维组织增生，另有11%～15%病例病程中合并显著骨髓纤维化。

答：现代骨髓活检内血细胞形态的观察及分类必须在经染色的切片上进行。在镜下观察时，由于半薄切片仅切割下胞体的某一片段，与涂片细胞形态相比有以下特点：同一细胞在不同切面上胞体的大小可有一定的差异，有的切片仅有胞浆片，而无胞核片；切片上血细胞的核膜切割面与染料直接接触，故其厚薄度较涂片所见更清晰易辨；同一前体细胞在不同切面上核仁大小，形态及数目可不同，某些切片的胞片内无核仁；涂片内核仁呈浅蓝色，而切片内核仁直接与染料充分接触，呈深蓝色，清晰可辨；由于切片切割厚2～3μm的一片，故各系前体细胞核内的常染色质和异染色质含量均少，但由于切片上的染色质与染料直接接触，故两者分辨十分清楚。凡核内呈解螺旋状态而功能又活跃的部分，称常染色质（即涂片上所称的副染色质），淡染；凡螺旋化程度高而功能不活跃的部分，称异染色质，呈深蓝色块状、颗粒或斑点状；由于半薄切片厚仅2～3μm，以一个早幼粒细胞为例，在切片上其胞片厚度仅为胞体直径的1/6左右，故不仅胞质量少（着色淡），且颗粒数少。此外，嗜天青颗粒及嗜碱性颗粒易溶于水溶性固定剂内，故凡带此类颗粒的细胞，辨认就较为困难；由于胞浆片薄，浆内细胞化学组分含量少，加之无胞膜遮蔽，在制片过程中易于丢失，故切片上组织化学染色的效果不如涂片佳；切片内成熟红细胞形态与涂片所见不同，既可为圆形，亦可为棒形或新月形。在遗传性球形细胞增多症时，切片静脉窦及主质出血区内的红细胞多数呈圆形，正常所见的新月形、棒形红细胞显著减少，有助于诊断。