第三节　细胞培养生物学

一、体外培养细胞与体内细胞的差异与分化

1.体外培养细胞与体内细胞的差异

细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。

2.体外培养细胞的分化

正常个体发育开始于完成受精后的合子状态，由合子经过细胞分裂与细胞分化过程逐渐形成细胞的多样性，出现组织与器官的形态与结构。细胞分化是机体不同组织与器官发挥功能的先决条件，细胞分化的标志是特异性蛋白的合成。细胞离体培养环境的改变，失掉体内的调节系统，细胞的分化可能会发生其它方面的变化，如不适应、脱分化或去分化。

二、体外培养细胞的类型

根据体外培养的细胞能否贴附在培养容器上生长的特性，主要分为贴附型的生长细胞与非贴附型的生长细胞（悬浮型）两大类。

（一）贴附型

细胞在培养时能贴附在支持物的表面生长，即只有依赖于贴附才能生长的细胞称为贴附型细胞。贴附生长本是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。贴附有两种含义：一是细胞之间相互接触；二是细胞与细胞外基质之间的相互接触。动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞是必须附壁即附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创面。

目前已有很多种细胞能在体外培养生长，包括正常细胞和肿瘤细胞。例如成纤维细胞、骨骼组织、心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺、皮肤、神经胶质细胞、内分泌细胞、黑色素细胞及各种肿瘤等。这些细胞在活体体内时，各自具有其特殊的形态，但是处于体外培养状态下的贴附生长型细胞则常在形态上表现为比较单一化而失去其在体内原有的某些特征，并多反映出其胚层起源的情况。贴附生长的体外培养的细胞从形态上一般大体可分为上皮型细胞及成纤维型细胞，以及游走型和多形型。

1.成纤维型细胞

胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。

2.上皮型细胞

细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆呈上皮型形态。

3.游走型细胞

体外培养的游走型细胞具有类似巨噬细胞样的特征。形态学特征为：游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成片、形成群落；细胞胞质常伸出伪足和突起；在培养器皿壁上生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则；细胞内易出现暗色的吞噬性颗粒。该类细胞不很稳定，外形不规则且不断变化，当细胞密度增大、连接成片时，形状类似于成纤维样细胞型或上皮细胞型。表现这种细胞形态的主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。

4.多形型细胞

有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。

以上分类仅是为了实际工作的方便而进行的笼统提法，体外的这些细胞类型并不能等同于体内相应类型的细胞，仅仅是描述培养细胞的形态而已。体外培养时所谓的上皮细胞型细胞或成纤维细胞型细胞，仅是因为其形态与体内的上皮细胞或成纤维细胞类似，并不能将体外培养的这些细胞与体内同名的细胞完全等同；而且，这种名词系使用于描述细胞的外形而并非说明细胞的起源。

（二）悬浮型

少数类型细胞在体外培养时不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及癌细胞。这些细胞在悬浮中生长良好，可以是单个细胞或为细小的细胞团，观察时细胞呈圆形。由于悬浮生长于培养液之中，因此其生存空间大，具有能够繁殖大量细胞、传代繁殖方便（只需稀释而不需消化处理）、易于收获细胞等优点，并且适于进行血液病的研究。缺点是不如贴附生长型观察方便，而且并非所有的培养细胞都能悬浮生长。

三、体外培养细胞的生长与增殖过程

体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。另外，很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存也不是无限的，存在着一个发展过程。所有这一切，使组织细胞在培养中有着一系列与体内不同的生存特点。

（一）培养细胞生命期

所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。组织和细胞在培养中生命期如何？这要看细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况。人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维持一年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；如培养的为其它细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获得永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。

正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致都经历以下三个阶段（图1-1）：

1.原代培养期

原代培养也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1～4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。原代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。

2.传代期

体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。原代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系。

传代期特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。

3.衰退期

特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。

（二）组织细胞培养一代生存期

“一代”指细胞从接种到分离再培养所需要的时间。与细胞倍增一代不是一个含义。在细胞一代中，细胞能倍增3～6次，经历三个阶段。置于体外培养的细胞，如条件合适，将生长繁殖。在培养器皿中，细胞繁殖到一定程度后，供培养生长的区域被细胞占满，培养基中的营养物质将被耗尽，如不及时传代，原代细胞将逐渐死亡。原代细胞培养传代后即为细胞系。成为第二代的细胞，以后可能继续传代。有限细胞系经过一定的代数之后，最终衰退而死亡；无限细胞系或连续生长细胞系则因具不死性而可无限/永久地传代、生长。在细胞的生长过程中，繁殖到一定密度后，将之分开而移至新的培养皿中（称为接种），使之继续繁殖生长，即为传代细胞自接种至新培养皿中至其下一次再传代接种的时间为细胞的一代。每代细胞的生长过程可分为三个阶段（图1-2）：细胞先进入生长缓慢的潜伏期，以后为增殖迅速的对数增生期，最后到达生长停止的稳定期。

1.潜伏期

细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此期细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴壁速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。贴附现象是非常复杂和受多种因素影响的。

细胞潜伏期具有如下特点：

（1）细胞贴附后进入潜伏期，细胞无增殖。少见分裂相，细胞有运动活动。

（2）初代培养细胞潜伏期约为24～96h或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期约6～24h。

（3）细胞接种密度大潜伏期短。

（4）细胞出现分裂相增多时，标志细胞进入指数增生期。

2.对数增生期

又称指数增生期。是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。对数生长期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%～0.5%，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3%～5%。对数生长期是细胞活力最好的时期，是进行各种实验的最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。在接种细胞数量适宜情况下，对数增生期持续3～5h后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象。而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象（图1-3），能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积。细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。但是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象。

3.稳定期

细胞数量达到饱和密度后，如不及时进行传代，细胞就会停止增殖，进入稳定期。此时细胞数持平，故也称平台期。稳定期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动。如不进行分离传代，细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH下降等因素中毒，出现形态改变，贴壁细胞会脱落，严重的会发生死亡，因此，应及时传代。

细胞稳定期特点：细胞不增殖，有代谢活动。培养液中的营养已逐渐耗尽，代谢产物积累增多，pH值降低，此时需要传代，否则细胞将会中毒，发生形态改变，细胞会从底板脱落死亡。传代过晚将影响下一代细胞的生长，至少要再传1～2代，通过换液可淘汰死细胞和受损较轻的细胞。待细胞全部恢复后再用。

四、细胞周期

细胞周期即一个母细胞分裂结束后形成的细胞至其下一次再分裂结束形成两个子细胞的这段时期，可分为间期和M期（分裂期）两个阶段。细胞群中多数细胞处于间期，少数细胞处于M期。一般间期的时间较长，而M期的时间较短。在间期，细胞完成生长过程，主要为DNA的合成，即遗传物质DNA的复制。在M期，细胞所完成的主要是分裂，即遗传物质的分配。在间期中，DNA合成仅占其中的一段时间，称为DNA合成期（S期）；在S期之前和S期之后，分别有两个间隙阶段，称为DNA合成前期（G1期）及DNA合成后期（G2期）。因此，可将细胞周期归纳如下：

间期=G1期+S期+G2期

细胞周期=间期+M期=G1期+S期+G2期+M期

1.G1期

从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成RNA和蛋白质，细胞体积显著增大。这一期的主要意义在于为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备。各种细胞G1期持续时间的长短差异较大，短者4～5h，长者可达数日。增殖旺盛细胞的G1期持续时间短，衰退细胞则时间长。

2.S期

即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。DNA复制所需要的酶都在这一时期合成。在S期的开始阶段，DNA合成的强度较大，以后逐渐减少，至S期结束时DNA含量将加倍。本期为遗传物质较易受损的时期，因DNA在合成过程中，其核苷酸双链分离，易于受到致突变或致癌物的影响。各种细胞的S期持续时间差别较小，在2～30h之间，平均6～8h。

3.G2期

为DNA合成后期，是有丝分裂的准备期。在这一时期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。在G2期，蛋白质的合成与细胞的分裂有关，若此期内蛋白质的合成受阻，将影响细胞进行分裂。细胞于本期中对周围环境较敏感，易因温度、pH等因素的影响而受干扰，停阻于G2期，但当这些不利的作用因素去除后常能恢复。本期持续时间较短，为2～3h或略长。

4.M期

为细胞分裂期。细胞的有丝分裂需经前、中、后、末期，是一个连续变化过程，由一个母细胞分裂成为两个子细胞。细胞处于分裂时称为分裂相。细胞分裂相的多少可作为细胞生活状态和增殖旺盛情况判断的重要参考指标。M期整个持续时间很短，也较稳定，一般需1～2h。

（1）前期　染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体。染色体短而粗，强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动，在细胞中形成两极；而后以中心粒随体为起始点开始合成微管，形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。前期持续时间为20～30min。

（2）中期　细胞变为球形，核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群，共46个，其中44个为常染色体，2个为性染色体。男性的染色体组型为44+XY，女性为44+XX。分离的染色体呈短粗棒状或发夹状，均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。中期持续时间为20～30min。

（3）后期　由于纺锤体微管的活动，着丝点纵裂，每一染色体的两个染色单体分开，并向相反方向移动，接近各自的中心体，染色单体遂分为两组。与此同时，细胞波拉长，并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑铃形。后期持续时间最短，仅5～6min。

（4）末期　染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁；内质网囊泡组合为核被膜；细胞赤道部缩窄加深，最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。本期持续的时间为20～30min。

整个细胞周期的持续时间和细胞周期中各期的持续时间因不同细胞类型而异。一般说来，哺乳动物细胞的细胞周期为10～30h。其中S期、G2期及M期一起为10h左右，不同细胞的变异程度较小；而G1期持续的时间差别则较明显。因此，某种细胞的细胞周期时间的长短主要与G1期的关系密切。