第四节 细胞培养条件与影响因素
体外培养组织与细胞与体内环境不同，在保证细胞生长所需的各种营养成分的同时，也得模拟体细胞生长的环境，满足基本的理化生存环境与无菌条件。
一、无菌环境
培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。人体内环境同样需要无菌和无毒。但在有害物侵入体内或代谢产物积累时，由于体内存在着强大的免疫系统和解毒器官（肝脏等），对它们可进行抵抗和清除，使细胞不受危害。当细胞被置于体外培养后，便失去了对微生物和有毒物质的防御能力，一旦被污染或自身代谢物积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无任何污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。
无菌操作基本要求：①手指不能触及器材使用端；②减少手指与器材的接触面积，学会手指操作；③一切操作，如打开或封闭瓶口、安装吸管等，都要在火焰前方进行、使用端用前要经过火焰消毒；④瓶口要顺风斜放在支架上；⑤细胞培养各种用液专管专用，并要勤换吸管，防止扩大污染和交叉污染；⑥瓶口液滴不能再倒回瓶内，要用干酒精棉球擦拭，瓶口要再经火焰消毒；⑦操作者动作要准确敏捷，尽量避免空气流动。
二、细胞分离方法
细胞培养之前，首先要进行组织块的分离，其主要方法包括：直接分离法（包括机械法和EDTA螯合法）和酶消化法（包括胰蛋白酶消化和胶原酶消化）。
（1）直接分离法 该方法分离得到的细胞数量没有酶消化法得到的多，但可满足一般实验的要求，该方法的优点是操作流程简单，不需要复杂的仪器和昂贵的胶原酶。
（2）酶消化法 多用于新生动物组织或动物胚胎的肝细胞培养。胰蛋白酶消化法具有分离效果好、操作简单和价格便宜的特点，因为胰酶消化的条件很难掌握，所以未被广泛应用；胶原酶消化法具有分离效果好、细胞产量高（即时存活率高、对细胞损伤小）、维持细胞特异性功能的时间长等优点。
三、细胞培养温度
不同种类的动物细胞对温度的要求并不一致，如人和哺乳动物的细胞培养温度为35～37℃，鸟类细胞培养温度为38.5℃，鼠类细胞为34℃。一般来说，细胞对低温的耐受力比高温强。因此，在细胞的培养过程中要及时地根据细胞的类型调整适宜的温度。在使用恒温培养箱时，箱内温度应维持在37℃、CO2体积分数为5%。
四、细胞培养基的成分
培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基，按其来源分为天然培养基和合成培养基。
1.天然培养基
最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最为普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及多种活性物质。与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。质量好的血清应该是无溶血、橘黄色、清亮透明、无细菌、无支原体污染的黏稠状液体。血清的体积分数要控制在5%～20%，当超过30%时反而不利于细胞生长，过高或过低的血清体积分数都不利于细胞的生长和增殖。一般将血清保存于－20℃以下，时间不宜过长。
2.合成培养基
合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好地生长增殖。迄今为止，人工合成的培养基已有多种，如RPMI-1640、Eagle’s MEM、DMEM等，其主要差别在于氨基酸、维生素、无机盐和能源物质的组成及含量不同。一般认为RPMI-1640营养全面，对各种组织生长都适用；Eagle’s MEM适合于细胞株的传代培养；DMEM有利于细胞的分裂增殖；Ham’s F12能促进细胞的分化。也有学者将不同培养基混合应用，从而得到较好的培养效果。培养液中的抗生素是青霉素和链霉素。此外，卡那霉素、新霉素、两性霉素、氯霉素等都可以防止细胞培养过程中细菌和真菌的污染。
五、接种密度
一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，细胞密度过大时，养分不足，使细胞迅速老化；而密度过小时不利于细胞单层的形成。在传代培养中，细胞的密度取决于传代的时间。一般分瓶的稀释比例为1∶3至1∶6，依细胞种类而异。在细胞生长的外部条件完全相同的情况下，细胞分散比率不同会导致不同的增殖倍数，影响细胞产量，这对培养种细胞尤其重要。
六、培养基的pH值
在培养动物细胞时，不同种动物或是同一种动物的不同部位对pH值的要求各不相同。一般认为，动物细胞培养基的pH值一般在7.2～7.4，呈弱碱性。培养过程中pH值低于6.8时对细胞生长会有抑制作用，细胞生长缓慢；而当pH高于7.6时则细胞不能生长，这可能是由于空气的接触而导致培养基中的营养成分被氧化所致。
七、细胞的冻存与复苏
细胞冻存和复苏的基本原则是“慢冻快融”，实验证明这样可以最大限度地保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质都能提高细胞膜对水的通透性。缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
1.细胞冻存
传代培养的细胞，如果暂时不用，可以冷冻保存。利用冻存技术将细胞置于－196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候再复苏细胞后用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其它意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂至终体积分数5%。15%的甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。标准冷冻速度开始为－1℃/min或者－2℃/min，当温度低于－25℃时可加速，到－80℃之后可直接投入液氮内（－196℃）。
2.细胞复苏
复苏细胞的原则为快速解冻，从液氮中取出细胞冻存管之前应准备好38℃的温水，冻存管取出后用镊子夹住顶端迅速放入温水中，结束后还要在75%酒精中清洗几次，除去透明过程中染上的杂质。冻存复苏后的状态主要与冻存保护剂的种类、浓度以及细胞复苏方法和复苏后培养液中小牛血清浓度等有关。二甲基亚砜（DMSO）是一种具有非常强的溶解能力和非凡渗透能力的化学物质，也是应用最广泛的体外培养细胞冻存保护剂，其常用体积分数为10%～20%，不同种属细胞的最适浓度也存在一定差别。
八、附着底物
除少数悬浮型细胞外，绝大多数体外培养细胞需附着在适宜的底物上才能生长。细胞贴附在底物上生长的性质称锚着依赖性。原则上讲，凡对细胞无毒性的物质都可用作底物，但不同的细胞，对底物要求各异，底物不适，细胞生长不良。根据所培养细胞的种类和培养的目的，常用底物有以下几种。
1.玻璃
这是最常用的底物，有透明、便于观察、易洗涤和能反复使用等优点，质地以中性玻璃为上。玻璃底物适于各种细胞附着生长，玻璃用强碱如NaOH处理后，性质能受一定影响，需用酸中和后才可用。缺点是易破碎。
2.一次性塑料
塑料种类很多，常用有聚苯乙烯，欧美等国已广泛使用，我国也开始生产。聚苯乙烯材料具有疏水性，制成培养瓶（皿）后，需加工处理，使表面带有电荷，遂产生疏水性。由聚苯乙烯制成的培养瓶（皿），光洁平坦，用于培养正常细胞、无限细胞系、转化细胞和肿瘤细胞均可。市售包装好的消毒商品，使用方便，一般限一次使用，消耗量大，不甚经济，不同厂家产品，尚有质量上的差异。此外还有聚四氟乙烯制品，有充电荷和非充电荷两种，前者具有亲水性，适合一般单层细胞培养，后者具有疏水性，适合巨噬细胞和转化细胞培养。聚四氟乙烯透气性好，还可制成薄膜，剪成小块后能置入各种瓶（皿）中，适于细胞贴附生长，便于取出、染色和做电镜切片。塑料瓶（皿）用后，必要时尚可重用；用水冲洗干净，如有残余细胞附着牢固，可用膜蛋白酶消化去除，晾干包装后，钴60辐射灭菌，但仅限一两次，使用次数过多，易出划痕和破坏疏水性。一次性塑料为理想的培养器皿。随着经济条件改善，有日趋普遍应用和取代其它培养器皿之趋势。
3.微载体
微载体是由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球体，附着面大，利于大量增殖细胞。
4.饲养细胞
饲养细胞也称滋养细胞，可用成纤维细胞或其它细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力但尚存活和有代谢活动。令其作为底物，将其它细胞接种于其上；饲养细胞的代谢产物利于其它细胞生长，从而被称为饲养细胞。饲养细胞可用于培养特殊难培养的细胞。
九、细胞供体年龄
原则上所有个体都可作为组织细胞的供体，但同样培养物，来自幼年个体比老年者易于培养；来自同一个体的组织，分化低的组织细胞比分化高的容易培养。同一个培养物中的细胞成分性状是不均一的，即存在着异质性，表现在分化程度、生物性状、增殖能力和对体外培养环境的适应能力不同等。如皮肤组织培养时，成纤维细胞大多先生长，并能压过表皮细胞的生长；干细胞比非干细胞易生长增殖等。