八、禽白血病

禽白血病又称禽白细胞增生病（Avian leukosis），是由禽白血病/肉瘤病毒群引起的禽类多种肿瘤性疾病的通称，包括淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病、骨髓细胞瘤、血管内皮瘤、肾瘤和肾胚细胞瘤、肝瘤、纤维肉瘤、骨石化（硬化）病、结缔组织瘤等。自然条件下最常见的是淋巴细胞性白血病。OIE将本病列为B类动物疫病，我国把其列为二类动物疫病。

本病造成的经济损失主要有以下几个方面：

（1）引发肿瘤直接造成感染鸡死亡，通常情况下本病的病死率为2%～3%，有时在种鸡群可达23%以上。

（2）通过病毒的亚临床感染（非肿瘤性综合征），严重影响鸡群的生产性能和免疫应答能力，造成免疫反应性降低、性成熟推迟、母鸡产蛋率下降、蛋重下降、受精率和孵化率下降等。

（3）大部分种鸡可以通过种蛋持续或间歇性排毒，垂直感染下一代，而先天性感染的子代鸡群会产生免疫耐受，这些鸡外表看似健康，但其血液中含毒量ID50可高达109个/ml。

（4）污染以鸡胚为原料生产的人和动物的疫苗，导致该病的传播。

禽白血病是一种世界性分布的疾病，目前在许多国家已得到很好的控制。

（一）病毒特征

禽白血病/肉瘤病毒（Avian leukosis/ sarcoma virus，ALV），属反转录病毒科（reoviridae）甲型反转录病毒属（旧称C型反转录病毒）。病毒粒子近似球形，直径为80～120nm，有囊膜，其蔗糖浮密度为1.15～1.17g/ml。

根据病毒中和试验、宿主范围及分子特性，分离自鸡的白血病/肉瘤病毒可分为A、B、C、D、E和J六个亚群，每一个亚群由几种不同种类的抗原型组成，同一个亚群的病毒具有不同程度的交叉中和反应，但除了B亚群和D亚群外，不同亚群之间没有交叉反应。

A～D亚群为外源性病毒，宿主为鸡，具有完整的病毒颗粒，有传染性。在蛋鸡群中A亚群最为普遍，其次为B亚群，主要引起3月龄以上的鸡发生肿瘤。C、D亚群致病力低，也能引起肿瘤的发生，但比较少见。E亚群是内源性病毒，可整合进鸡的染色体中，通常不致病。J亚群于1988年在英国发现，外源性，宿主为鸡，引起髓细胞瘤，对肉用鸡危害严重。

此外，从几个品种的野鸡中分离到的内源性病毒归属于F、G亚群，从斑鸠中分离到的内源性病毒归属于H亚群，从鹌鹑中分离到的内源性病毒归属于I亚群。

本病毒群中的劳氏肉瘤病毒（RSV）和其他肉瘤病毒可以感染1日龄雏鸡，用其接种1日龄鸡胚绒毛尿囊膜后可引起种瘤（痘）斑。接种鸡胚成纤维细胞后可引起细胞快速向肿瘤状态转化。

本病毒对脂溶剂和去污剂敏感，乙醚、氯仿和十二烷基硫酸钠可破坏病毒。对热不稳定，在50℃半衰期为9min，60℃半衰期为40s，56℃30min可使之灭活。该病毒只有在－60℃以下才能较长时间保存而不丧失感染力，但不耐反复冻融。0.3%甲醛48h病毒可完全灭活。

（二）临床症状

自然感染潜伏期长短不等，传播缓慢，持续时间长，无发病高峰。

由禽白血病/肉瘤病毒引起的种瘤种类很多，其中对养禽业危害较大、流行较广的白血病类型包括淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、成骨髓细胞性白血病、骨髓细胞瘤病、血管瘤、肾瘤和肾胚细胞瘤、肝癌、骨石化（硬化）病等。各病型的表现有差异。

淋巴细胞性白血病：自然病例多见于14周龄以上的鸡。临诊见鸡冠苍白、腹部膨大，触诊时营可触摸到肝、法氏囊和肿大的肾，羽毛有时有尿酸盐和胆色素沾污的斑。

成红细胞性白血病：病鸡虚弱、消瘦和腹泻，血液凝固不良，致使羽毛囊出血。

成髓细胞性白血病：病鸡贫血、衰弱、消瘦和腹泻，血凝固不良致使羽毛囊出血。外周血液中白细胞增加，其中成细胞占3/4。

血管瘤：见于皮肤表面，血管腔高度扩大形成“血疱”，通常单个发生。“血疱”破裂可引起严重失血而死亡。

一般情况下，禽白血病病鸡无特异的临诊症状，有的病鸡甚至可能完全没有症状，感染率高的鸡群产蛋量很低。

（三）病理变化

各病型的病理变化有差异。

淋巴细胞性白血病：剖检（16周龄以上的鸡）可见结节状、粟粒状或弥漫性灰白色肿瘤，主要见于肝、脾和法氏囊，其他器官如肾、肺、性腺、心、骨髓及肠系膜也可见。结节性肿瘤大小不ー，以单个或大量出现。粟粒状肿瘤多见于肝脏，呈均匀分布于肝实质中。肝发生弥散性肿瘤时（图1-32），呈均匀肿大，比正常增大几倍，且颜色为灰白色，俗称“大肝病”，这是本病的主要特征。根据肝脏肿瘤形态和分布特点，可分为结节型、弥漫型、颗粒型和混合型4种类型。

结节型：肝肿大，可见黄豆大到鸽蛋大或鸡蛋大的灰白色肿瘤结节，在器官表面一般呈扁平或圆形，与周围界限清楚，瘤体柔软、平滑、有光泽。

弥漫型：肝脏肿瘤细胞弥漫性增生，肝内有无数细小的灰白色瘤灶，使肝肿大呈灰白色或黄白色，比正常大几倍。

颗粒型：肝肿大，有多量灰白色小点，肝表面呈颗粒状而高低不平。

混合型：主要表现为肝内有大量灰白色或灰黄色大小不等的瘤体，形态各异，有的呈颗粒状，有的呈结节状，有的呈弥漫性大片病灶。

脾脏变化与肝相同，体积增大，呈灰棕色或紫红色，在表面和切面上可见许多灰白色脚瘤病，偶尔也有凸出于表面的结节。法氏囊肿大，剖面皱壁有白色隆起或结节增生，随瘤体发育法氏囊也增大，失去原有结构。瘤体剖面有时有干酪样坏死或豆腐渣样物质。腿骨的红骨中有明显的白色结节性瘤病变，有时也可见弥漫性增生、骨髓褪色。肺脏、肾脏肿大，色变淡，切面常有颗粒性增生结节或有较大的灰白色瘤组织。

鸡到开产期胸腺已萎缩，呈小豆大或米粒大扁平状，如遭白血病侵害，胸腺肿大呈指头状串珠样排列，切面白色均匀。胰腺肿大2～3倍。卵巢间质有瘤组织增生，受侵害的卵巢为灰白色呈均匀肿块状，整体外观呈菜花状。此外，心、肺、肠、睾丸等也可见肿瘤结节。

成红细胞性白血病：血液凝固不良致使羽毛囊出血。分增生型（胚型）和贫血型两种。

增生型以血流中成红细胞大量增加为特点。特征病变是肝、脾、肾弥散性肿大，呈樱桃红色或暗红色，且质软易脆。骨增生、软化或呈水样，呈暗红色或樱桃红色。

贫血型以血流中成红细胞减少、血液淡红色、显著贫血为特征。剖检可见内脏器官（尤其是脾）萎缩，骨髓色淡呈胶冻样。

成细胞性白血病：骨髓质地坚硬，呈灰红或灰色。实质器官增大而质脆，肝脏有灰色弥漫性肿瘤结节。晚期病例，肝、肾、脾出现弥漫性灰色浸润，使器官呈斑驳状或颗粒状外观。

骨髓细胞瘤：特征病变是骨骼上长有暗黄白色、柔软、脆弱或呈干酪状的骨细胞瘤，通常发生于肋骨与肋软骨连接处、胸骨后部、下颌骨和鼻腔软骨处，也见于头骨的扁骨，常见多个肿瘤，一般两侧对称。

血管瘤：可见于内脏表面，血管腔高度扩大形成“血疱”。

近年来出现的J亚群白血病病毒感染，原发肿瘤主要是骨髓，骨髓瘤扩张时可挤破骨质到达骨膜下而成为肉眼可见的肿瘤病灶。病初多见于胸骨、肋骨、骨盆、髋关节、膝关节周围以及头骨和椎骨，尤其以胸骨和肋骨的骨髓瘤病灶出现最早，病变部位的骨膜下可见白色石灰样增生的肿瘤组织，可与其他亚群白血病及马立克氏病区别。随着疾病的进一步发展，肿瘤组织可广泛出现于肝脏、脾脏、肾脏、卵巢和睾丸等器官，此时与其他类型白血病的区别较为困难。

（四）流行病学特征

易感动物：鸡、鸭、鹅和野鸭是该群病毒中所有病毒的自然宿主，尤其以肉鸡最易感。鹧鸪、鹌鹑将也会感染此病。鸡的品种不同其易感性有差异，产褐色蛋的母鸡易感性较强。主要侵害26～32周龄鸡，35周龄以上很少发病。

传染源：病鸡和带毒鸡是本病的传染源。公鸡是病毒的携带者，它通过接触及交配成为感染其他鸡的传染源。

传播途径：经卵垂直传播是病毒的主要传播方式，接触及交配等水平传播也是本病的重要传播方式。母鸡的输卵管壶腹部含有大量的病毒并可在局部复制，因此鸡胚和卵白蛋白也携带有白血病病毒，从而使新生雏鸡长期持续携带病毒。另外，污染的粪便、飞沫、脱落的皮肤等都可通过消化道使易感鸡感染。人工接种污染了禽白血病病毒的各种禽用疫苗可造成本病水平传播。

流行形式及因素：病毒感染鸡群后可出现以下4种状态，即无病毒血症无抗体状态（V－A－）、无病毒血症而有抗体状态（V－A+）、有病毒血症而无抗体状态（V+A－）和有病毒血症也有抗体状态（V+A+）。先天性感染的鸡可形成免疫耐受，因而常常出现V+A－现象，这种病鸡是该病净化的主要对象。

（五）预防及治疗

药物治疗及免疫接种的效果不佳。该病的防控策略和方法是通过对种鸡检疫、淘汰阳性鸡，以培育出无ALV的健康鸡群，也可通过选育对禽白血病有抵抗力的鸡种，结合其他综合性疫病控制措施来实现。用于制备疫苗的鸡胚尤其要加强病毒的监测，严防污染。

目前，国内外通常采用 ELISA检测ALV群特异性抗原P27的方法，以揭示任何亚群禽白血病病毒的存在状况，从而可以检出ALV带毒鸡或排毒鸡，故使白血病病鸡的净化和淘汰计划能够实现。鸡白血病净化的重点在原种场，也可在祖代场进行。通常推荐的程序和方法是鸡群在8周龄和18～22周龄时，将种鸡分别编号，用 ELISA方法检查泄殖腔拭子中ALV抗原，然后在开产期（22～24周龄）检查种蛋蛋清中和雏鸡胎粪中的ALV抗原。阳性鸡及其种雏一律淘汰。经过持续不断的检疫，并将假定健康的非带毒鸡严格隔离饲养，最终达到净化种群的目的。为了减少或排除水平传播，所有设备如孵卵器、育雏舍等都应在每次使用前彻底消毒，不同年龄的鸡不应混群。鸡群应采取全进全出饲养模式。

对于某些污染严重的原种场，应及时更换品系。某些祖代和父母代种鸡场存在该病时，采取上述净化措施常常并不现实，应以提高饲养管理水平，及时淘汰瘦弱、贫血及患大肠杆菌病鸡，并加强日常卫生管理和消毒措施，尤其是孵化后的阶段，以减少该病的水平传播和疾病损失。

此外，种鸡在交配前，种公鸡和种母鸡分开饲养；进行其他疫苗接种时，应减少一枚针头连续注射种鸡的数量，从而可减少该病水平传播的机会。

（六）实验室检测

1.禽白血病病毒P27抗原酶联免疫吸附试验

参照标准：NY/T 680—2003。

（1）实验材料

1）试剂

抗p27蛋白抗体：应用提纯的禽成髓细胞性白血病病毒p27蛋白免疫家兔制备。

阳性抗原：含鸡白血病/肉瘤病毒群特异性p27蛋白抗原的鸡蛋清。

阴性血清：无鸡白血病/肉瘤病毒群特异性p27蛋白抗原的SPF鸡蛋清。

酶结合物：辣根过氧化物酶标记的抗p27蛋白抗体。

磷酸盐缓冲液（PBS）：配制见附录A。

包被液：配制见附录A。

洗涤液：配制见附录A。

样品稀释液：配制见附录A。

底物溶液：配制见附录A。

终止液：配制见附录A。

2）器材

酶联检测仪；

聚苯乙烯板；

微量加样器，容量50～200μl；

37℃恒温箱培养。

3）样品

鸡蛋样品：将待检鸡蛋小的一端朝上放置，打碎蛋壳，用移液器无菌吸取蛋清，密装于灭菌小瓶内。

细胞培养物：用移液器无菌吸取细胞培养物，密装于灭菌小瓶内，4℃或－30℃保存或立即送检。试验前将送检样品统一编号，试验时不做稀释。

（2）操作方法

1）用包被液将抗p27蛋白抗体作4000倍稀释，每孔100μl加入96孔聚苯乙烯板中，4℃过夜。

2）取出包被好的聚苯乙烯板，将液体倒弃，每孔加250μl洗涤液漂洗3次，每次2min，甩干。

3）每孔加150μl质量浓度为1%的明胶封闭液，37℃反应60min。

4）重复2）。

5）在A1、A2孔各加100μl标准阴性对照，A3、A4孔各加100μl标准阳性对照。

6）将待检样品加入其他各孔，每个待检样品加两孔，每孔100μl，37℃反应60min。

7）重复2）。

8）每孔加100μl工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗p27蛋白抗体，37℃反应60min。

9）重复2）。

10）每孔加100μl新配制的底物溶液，室温，避光反应10min。

11）每孔加100μl终止液。

12）置酶联检测仪于450nm测定各孔吸光度（OD）值。

（3）结果判定

1）阴性对照OD均值等于（A1孔OD值+A2孔OD值）/2；阳性对照OD均值等于（A3孔OD值+A4孔OD值）/2。

2）阴性对照OD均值小于0.15，阳性对照OD均值减去阴性对照OD均值大于0.3时试验成立，否则重做。

3）S/P值等于（样品孔OD均值-阴性对照OD均值）/（阳性对照OD均值-阴性对照OD均值）。

待检样本S/P≤0.2判为阴性，表示待检样品中无ALVsp27蛋白抗原。

待检样本S/P>0.2判为阳性，表示待检样品中有ALVsp27蛋白抗原。

2.病毒分离培养检测和鉴定

参照标准：GB/T 26436—2010。

（1）试剂和仪器

1）试剂　DMEM液体培养基（pH7.2）、0.25%胰酶、磷酸盐缓冲（0.01mol/L PBS，pH7.2）、抽提缓冲液、青霉素（10万U/ml）、链霉素（10万U/ml）、抗ALV单抗、抗ALV单因子鸡血清、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗小鼠IgG抗体、ALV-p27抗原酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒、聚合酶链式反应（PCR）试剂、RT-PCR试剂、生理盐水（0.9%氯化钠）、无水乙醇（分析纯）、丙酮（分析纯）、甘油（分析纯）、75%酒精、碘酒、细胞生长液（含有5%胎牛血清或小牛血清的DMEM液体培养基）、细胞维持液（含有1%胎牛血清或小牛血清的DMEM液体培养基）、大肠杆菌（TG1）、蛋白酶K、70%冷乙醇、乙酸钠（分析纯）、三氯甲烷（分析纯）、异戊醇（分析纯）、10×加样缓冲液、琼脂糖、DL2000DNA Marker、TAE电泳缓冲液、氯化钙（0.1mol/L）、氨苄青霉素（100μg/μl）、双蒸水、LB液体培养基、TE缓冲液、RNase、细胞裂解液、0.1%的DEPC（焦碳酸乙二脂）、水等。

2）仪器　锥形瓶、荧光显微镜、恒温培养箱、冷冻台式离心机（≥12000r/min）、－20℃冰箱、－80℃冰箱、Eppendorf管（离心管）、棉棒、载玻片、盖玻片、细胞培养平皿、37℃摇床、96孔培养板、SPF隔离器、紫外光凝胶成像分析仪、微量移液器、低温恒温水槽（16℃）、吸水纸。

（2）分离病毒用细胞

1）鸡胚成纤维细胞（CEF）　鸡胚成纤维细胞制备方法见附录B。

2）鸡胚成纤维细胞自发永生株（DF1）细胞

DF1细胞培养基制备方法见附录C。

（3）病料的采集与处理

1）全血、血清或血浆　取疑似病鸡的全血、带有白细胞的血浆或血清，无菌接种于长成单层的CEF或DF1，置于含5%二氧化碳的37℃恒温培养箱中培养。

2）脏器　采集疑似病鸡的脾脏、肝脏、肾脏、按脏器质量的1～2倍加入灭菌生理盐水（含青霉素和链霉素各1000IU/ml）研磨，直至成匀浆液，将悬液移至离心管中充分摇振后，4℃ 1000r/min离心5min，收集上清液。

3）疫苗样品　疫苗样品处理后接种CEF培养扩增病毒。但为了鉴别是否是外源性ALV，接种DF1细胞或其他抗E亚群白血病鸡细胞（C/E）。

4）咽喉、泄殖腔拭子　取咽喉棉拭子时，将棉拭子深入喉头口及上颚裂来回刮3～5次取咽喉分泌液；取泄殖腔棉拭子时，将棉拭子深入泄殖腔转3圈并沾取少量粪便；将棉拭子头一并放入盛有1.5ml磷酸盐缓冲液的无菌离心管中（含青霉素和链霉素各1000IU/ml），盖上管盖并编号，10000r/min离心5min后取上清备用。

（4）病毒的分离培养与鉴定

1）病毒的分离培养

① 接种培养：病料接种细胞单层后，置于37℃培养箱中培养2h。然后吸去细胞生长液，换入细胞维持液，培养5～7d。

② 细胞传代：将①培养的细胞传代于加有盖玻片的平皿中，培养5～7d。

2）病毒的鉴定

① 间接免疫荧光抗体反应（IFA）

a.固定：将盖玻片上的单层细胞，在自然干燥后滴加丙酮-乙醇（6∶4）混合液室温固定5min，待其自然干燥，用于IFA，或静置于－20℃保存备用。设未感染的细胞单层为阴性对照。

b.加第一抗体：用0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）将单克隆抗体（如抗ALV-J亚群特异性单克隆抗体）或抗ALV单因子鸡血清（抗ALV单因子鸡血清的制备见附录D）稀释到工作浓度，在37℃水浴箱作用40min，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次。

c.加FITC标记二抗：按商品说明书用磷酸盐缓冲液稀释FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体或山羊抗鸡IgY抗体（当第一抗体为ALV特异性单克隆抗体，选用FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体作为第二抗体；当第一抗体为鸡抗ALV单因子血清，则选用FITC标记的山羊鸡IgY抗体作为第二抗体），37℃水浴箱作用40min，用磷酸盐缓冲液洗涤3次。

d.加甘油：滴加少量50%甘油磷酸缓冲液于载玻片上，将盖玻片上的样品倒扣其上。在荧光显微镜下观察。

e.结果观察与判定：被感染的CEF细胞内呈现亮绿色荧光，周围未被感染的细胞不被着色或颜色很淡，在放大200～400倍时，可见被感染细胞质着色，判为ALV阳性，无亮绿色荧光者判为阴性。

② ALV-p27抗原ELISA检测

a.抗原样本制备：将病料同1）、①和1）、②所述方法接种细胞，培养7～14d后取上清液直接检测；也可取细胞培养物冻融后检测；或用从泄殖腔采集的棉拭子。

b.P27抗原ELISA检测：ALV-p27抗原可用商品试剂盒检测，对不同来源的样品，按厂家的说明书操作。当样本在DF1细胞或CEF上检出ALV-p27抗原时，判为外源性ALV阳性，否则判为阴性。直接用泄殖腔棉拭子样品检出p27，说明有ALV，但不能严格区分外源性或内源性。

（5）ALV亚群鉴定

1）利用J亚群ALV特异性单克隆抗体进行IFA检测，可以鉴定J亚群ALV，但不能鉴别其他ALV亚群如A亚群、B亚群、C亚群、D亚群。

2）对分离到的病毒用RT-PCR（上清液中的游离病毒）或PCR（细胞中的前病毒cDNA）扩增和克隆囊膜蛋白gp85基因，测序后与基因序列数据库中的已知A亚群、B亚群、C亚群、D亚群的gp85基因序列做同源性比较，即可对病毒进行分群。ALV病毒分群方法见附录E。

（6）荧光定量PCR扩增ALV-J　该方法适用于鸡群的检疫或ALV-J感染的净化，可在较短时间内完成大量样品的特异性检测，血浆或泄殖腔棉拭子样品可直接用于检测。

3.血清特异性试验

（1）仪器和试剂

1）试剂　磷酸盐缓冲液、禽白血病抗体ELISA检测试剂盒、FITC标记的山羊抗鸡IgY抗体、甘油。

2）仪器　酶标仪、荧光显微镜、37℃恒温培养箱。

（2）样品的采集　样品的采集见2.、（3）。

（3）抗体检测

1）ELISA检测　可选用禽白血病A亚群、B亚群及J亚群抗体ELISA检测试剂盒。

2）IFA检测

① 抗原：抗原制备方法见附录F。

② 操作步骤：在相应的盖玻片上或抗原孔中加入用磷酸盐缓冲液（1∶50）稀释的待检鸡血清，在37℃下作用40min，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，再加入工作浓度的FITC标记的山羊抗鸡IgY抗体（第二抗体），在37℃作用40min，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，再加少量50%甘油磷酸盐缓冲液后在荧光显微镜下观察。

③ 结果的判定：结果的判定方法同2.、（4）、2）、①、e，不论是商品鸡群还是SPF鸡群，只要检出A亚群、B亚群及J亚群抗体阳性的鸡，就表明该群体曾经有过外源性ALV感染。

附录A

（规范性附录）

试剂的配制

A.1　磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol pH7.4）

氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　8g

氯化钾　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.2g

磷酸二氢钾　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.2g

十二水磷酸二氢钾　　　　　　　　　　　　　　　2.83g

蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　加至1000ml

A.2　包被液（0.05mol/L pH9.6）

碳酸钠　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.59g

碳酸氢钠　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.93g

蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　加至1000ml

A.3　洗涤液

PBS　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1000ml

吐温-20　　　　　　　　　　　　　　　　   　　　　0.5ml

A.4　样品稀释液

含体积分数10%的新生牛血清的洗涤液。

A.5　磷酸盐-柠檬酸缓冲液（pH5.0）

柠檬酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　3.26g

十二水磷酸氢二钠　　　　　　　　　　　　　　　　12.9g

蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　700ml

A.6　底物溶液

用二甲基亚砜将3’3’5’5’-四甲基联苯胺（TMB）配成1%的浓度，4℃保存，使用时按下列配方配制底物溶液。

磷酸盐-柠檬酸缓冲液　　　　　　　　　　　　   　　　　9.9ml

1% 3’3’5’5’-四甲基联苯胺　　　　　　　　           　　　　0.1ml

30%双氧水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1μl

A.7　终止液

硫酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　58ml

蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　442ml

附录B

（规范性附录）

SPF鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备

选择9～10日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉再用酒精棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出鸡胚，去头、四肢和内脏，放入灭菌的玻璃器皿中，用无血清的DMEM液洗涤鸡胚。用灭菌的剪刀剪成米粒大的小组织块，再用无血清的DMEM洗涤2～3次，然后加0.25%胰酶溶液（每个样品约加1ml），在37.5～38.5℃水浴中消化10～15min，吸出胰酶溶液消化产生的悬液，再加入适量的营养液（用无血清的DMEM液，加青霉素、链霉素各200～500IU/ml）吹打，用4层纱布过滤。取少量过滤后的细胞悬液做细胞计数，其余在1000r/min下离心5min。将细胞沉淀再混悬于细胞培养液中，制成每毫升含活细胞数为100万～150万的细胞悬液，分装于培养皿中进行培养，形成单层后备用（一般在24h内应用）。

附录C

（规范性附录）

DF1细胞培养基配制

C.1　商品化的DMEM液，pH7.2，加5%胎牛血清。青霉素、链霉素各250IU/ml。

C.2　培养条件：37℃，5%二氧化碳。

附录D

（规范性附录）

抗ALV单因子鸡血清的制备

选择经鉴定无任何其他潜在病毒的ALV参考株作为种毒（如经ALV-J全基因组cDNA克隆质粒DNA传染SPF鸡的CEF所产生的分子克隆化ALV），接种C/E CEF后复制和扩增病毒。病毒接种CEF继续培养5d后，再传代一次，将传代长成单层的CEF换成含1%小牛血清的DMEM维持液，继续培养72～96h后收取上清液（通常可达最高病毒效价），分装在离心管中，每支1ml，于－70℃冰箱保存，2～3d后，取出一支，用细胞培养液作10倍系列稀释后，分别接种于含有新鲜配制的CEF单层96孔培养板上，每个稀释度8个孔，在37℃下培养6d后，弃上清液，用磷酸盐缓冲液洗一次后，加入预冷的丙酮-乙酸（6∶4）固定，待自然干燥后，用抗ALV-J的单克隆抗体进行IFA，以IFA的结果来判定病毒感染的终点，测定其中ALV的组织细胞半数感染量TCID50。

选用6周龄以上SPF鸡，SPF隔离器饲养。每只鸡皮下接种含104个TCID50的ALV悬液，4～6周后采集血清。IFA抗体滴度应≥1∶100。

附录E

（规范性附录）

ALV亚群鉴定程序

E.1　克隆载体和宿主菌

商品化的PCR产物克隆载体质粒，或其他类似载体质粒。可用多种大肠杆菌作为宿主菌，如TG1等。

E.2　病毒模板的制备

按照以下程序或商品化提取细胞DNA试剂盒的说明书提取细胞DNA。

（1）接种病毒细胞经磷酸盐缓冲液洗涤3次。加入适量0.25%胰酶，37℃湿箱中放置5～10min，将细胞消化吹打后收集于1.5ml离心管中。

（2）2000r/min离心收获细胞，然后加入500μl抽提缓冲液（100mmol/L氯化钠，10mmol/L Tris-HCl，pH8.0， 0.5%SDS）悬浮后，加入5μl蛋白酶K（100μl/ml），56℃水浴中消化5h。

（3）加入等体积的苯酚-三氯甲烷溶液（苯酚∶三氯甲烷∶异丙醇=25∶24∶1）约500μl抽提1次，将上层液体转移到另一1.5ml离心管中，加入1/10体积3mol/L的乙酸钠和2倍体积无水乙醇后，置于－20℃冷却2h或更长时间。

（4）取出后12000r/min离心10min，沉淀DNA，弃去上清液，再小心加入70%冷乙醇轻洗DNA沉淀，弃去上清液。

（5）经乙醇沉淀后的DNA，空气中室温自然干燥后，溶解于50μl双蒸水中，即为模板DNA。

E.3　囊膜蛋白env基因的扩增

E.3.1　引物

可根据已发表资料合成、扩增ALV-J的前病毒DNA特异性PCR引物，本例示范引物如下。

正向引物：5’-CTTGCTGCCATCGAGAGGTTACT-3’，相当于ALV-J原型毒株HPRS-103前病毒基因组DNA序列的第5394～第5416对碱基。

反向引物：5’-AGTTGTCAGGGAATCGAC-3’，相当于ALV-J原型毒株HPRS-103前病毒基因组DNA序列的第7811～7794对碱基。

引物用双蒸水稀释为25pmol/μl，－20℃保存备用。

E.3.2　PCR

以E.2中提取的细胞DNA为模板，扩增ALV-J的囊膜蛋白基因（env）特异性2.2kb条带，其PCR反应体系（50μl）见表1-9。

将上述成分分别加入灭菌的PCR管中，轻轻混合均匀，离心后置于PCR扩增仪，按照以下扩增程序进行反应。

首轮循环：95℃ 5min，50℃ 1min，72℃ 1min。

中间循环：95℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 90s，进行30个循环；

72℃延伸10min；4℃保存。

E.3.3　PCR产物DNA电泳

用微量移液器取4.5μl PCR产物加入0.5μl 10×进样缓冲液（0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯苯胺，15%聚蔗糖400），在浓度为0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳，同时在另一加样孔加入5μl DL2000 DNA Marker。在TAE电泳缓冲液中，90V电压，电泳5min后，于紫外光凝胶成像分析系统中观察并记录结果。

E.3.4　PCR产物的回收与定量

可采用商品化PCR产物回收试剂盒进行回收。

（1）将病毒env基因的PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳，90V电压，电泳50min。

（2）将目的条带切割下来，置于已经称重的1.5ml离心管中。

（3）再次称重，计算含目的条带的凝胶块质量。

（4）按每毫克加入100μl 碘化钠，在55～65℃水浴锅中使琼脂糖凝胶融化。

（5）加入5μl二氧化硅水溶液，混匀后室温静置5min。

（6）12000r/min离心，去掉上清液。

（7）加入1ml洗涤液洗涤沉淀。

（8）12000r/min离心，去掉上清液，再次离心，用微量移液器吸出剩余液体。

（9）干燥后，加入15μl双蒸水，用微量移液器吹打混匀后，室温下静置5min，2000r/min离心，将上清液转移至另一离心管中。

（10）取1μl回收产物在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳，另加5μl DL2000 DNA Marker，可以估计回收DNA的浓度。

E.4　PCR产物的克隆

E.4.1　链式反应

将载体与纯化回收的PCR产物于16℃下连接6～8h。

连接体系为：

载体　　　　　　　　　　　　　　　　25ng

纯化env基因PCR产物　　　　　　　　100ng

溶液I　　　　　　　　　　　　　　　　5μl

加双蒸水至10μl

E.4.2　质粒转化用感受态大肠杆菌的制备

用氯化钙法制备大肠杆菌TG1菌株的感受态细胞，步骤简述如下：

（1）一个盛约50ml LB液体培养基的锥形瓶，接种大肠杆菌TG1株，在37℃恒温振荡器中振荡培养至半混浊半透明状态。

（2）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的－20℃保存的50ml离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至1℃。

（3）4℃ 4000r/min离心10min，回收细菌细胞。

（4）倒出上清液，将管倒置1min，以使残余的培养液流尽。

（5）用10ml经冰预冷的0.1mol/L氯化钙重悬每份沉淀，冰浴上放置30min。

（6）4℃ 4000r/min离心10min，回收细菌细胞。

（7）倒出上清液，将管倒置1min，以使残余的培养液流尽。

（8）每50ml初始培养物用1ml经冰预冷的0.1mol/L氯化钙重悬每份沉淀，4℃保存备用。

附录F

（规范性附录）

IFA法抗体检测用ALV感染细胞的制备

在已铺满CEF（C/E）单层细胞的细胞瓶或培养皿中接种0.5ml含103TCID50的ALV（如ALV-J）悬液，37℃、5%二氧化恒温培养箱中培养，24h后换含1%小牛血清的DMEM培养基继续培养。继续培养5d后将细胞单层用胰酶溶液消化分散成悬液，经离心后，重新悬浮于含5%小牛血清的DMEM培养基中。将细胞浓度调至每毫升含5×105个细胞。在加入玻片的培养皿中加入5ml细胞悬液，或在96孔细胞培养板上每孔加入100μl细胞悬液，在37℃继续培养4d。将玻片从培养皿中取出或96孔细胞培养板弃去培养基，在磷酸盐缓冲液中漂洗一次后，滴加预冷的丙酮-乙醇（6∶4）固定液室温固定5min，自然干燥后，用塑料薄膜包裹后置－20℃保存。