七、鸡产蛋下降综合征

鸡产蛋下降综合征（Eggs drop syndrome’76， EDS76）又称为“减蛋综合征-76”，是由减蛋综合征病毒引起的鸡的一种以产蛋下降为主的传染病，主要临诊特征是鸡群产蛋量急剧下降，蛋壳色变浅，软壳蛋、无壳蛋、粗壳蛋数量增加。本病广泛流行于世界各地，对养鸡业危害极大，已成为蛋鸡和种鸡的主要传染病之一。OIE将本病列为B类动物疫病，我国把其列为二类动物疫病。

本病最早报道于1976年的荷兰，可能是因为鸡群接种了被减蛋综合征病毒污染了的马立克病疫苗所致，该疫苗用鸭胚成纤维细胞制备。随后在欧洲、美洲、澳大利亚及亚洲等许多地区均有发生。我国在1991年分离到病毒，证实有本病存在。目前，本病在我国流行范围广泛，给养禽业造成巨大的损失。

（一）病毒特征

减蛋综合征病毒（Eggs drop syndrome’76 virus， EDSV）属于腺病毒科（Admiridae）、禽类腺病毒属（Aviadenovirus）、禽腺病毒Ⅲ群（Avian adenovirus Group Ⅲ）。它与鸡的其他11个和火鸡的2个原型腺病毒在血清中和及血凝抑制试验中无相关性。有研究表明它实际上是一株鸭腺病毒，后来可能通过污染的疫苗而引入到鸡群中，并逐渐适应了鸡群。该病毒核酸型为双链DNA，病毒粒子为球形，无囊膜，直径76～80nm，表面有纤突，纤突上有与细胞结合的位点和血凝素，能凝集鸡、鸭、鹅、火鸡和鸽红细胞。

EDSV有3种基因型，第一种引起经典的EDS，许多国家均有发生；第二种仅发生于英国的鸭；第三种发生于澳大利亚的鸡。目前已知EDSV只有一个血清型，国际标准株为荷兰的127株（EDS76-127）。本病毒只对产蛋鸡有致病性，影响产蛋，存在于鸡的输卵管伞、蛋壳分泌腺、输卵管狭窄部及鼻黏膜等的上皮细胞中，在细胞核内复制，并可随卵子的形成进入蛋中。由于 EDSV来源特殊，所以尽管它可以引起鸡发病，但在10～12日龄鸭胚或鹅胚中生长良好。鸭胚培养是目前实验室分离和扩增病毒最常用的方法。也可在多种鸭源细胞、鹅源细胞及鸡胚肝细胞中生长，但在鸡胚、鸡胚肾细胞、鸡胚成纤维细胞及火鸡源细胞上生长不良，不能在哺乳动物细胞中生长。对分离株的鉴定，最常用、最简便的方法是血凝和血凝抑制试验，另外也可用琼脂扩散试验、荧光抗体检测和酶联免疫吸附试验等方法。

由于EDSV在鸡、鸭等家禽体内长期存活，不同毒株对家禽的致病力差异较大，选择某些对鸡无致病性的毒株，可作为理想的禽腺病毒载体，用于基因治疗和基因重组工程疫苗的研究。

EDSV对外界环境的抵抗力比较强，对乙醚、氯仿不敏感，对pH适应范围广（pH3～10）。对热有一定耐受性，56℃3h可存活，但70℃很快被灭活。0.3%福尔马林48h可使病毒完全灭活，强碱对其也有较好的消毒效果。

（二）临床症状

突出的症状就是产蛋变化，表现产蛋率突然下降，或停止上升，一般比正常要低20%左右，个别鸡群可下降50%。发病后2～3周产蛋率降至最低点，并持续3～10周以后逐渐恢复。但大多很难恢复到正常水平，且发病周龄越晚，恢复的可能性越小。在产蛋下降的同时，可见蛋壳颜色变浅或带有色素斑点，蛋壳变薄，出现破壳蛋、软壳蛋、无壳蛋和小型蛋（图1-28），还有畸形蛋及砂粒壳蛋等，不合格蛋可达10%～15%，甚至更高。蛋清的pH由正常的8.5～8.8降为7.2～8.0，且往往仅在蛋黄周围形成浓稠浑浊区，其余则呈水样，透明，无黏性（图1-29）。种鸡群发生EDS76时，种蛋的孵化率降低，弱雏数增加。若开产前感染，则开产期可推后5～8周。

（三）病理变化

本病一般不发生死亡，故无肉眼病变，剖检时个别鸡可见卵巢萎缩、子宫及输卵管有卡他性炎症，有时有出血（图1-30）。组织学变化主要是输卵管腺体水肿、单核细胞浸润、上皮细胞变性坏死、受感染细胞有核内包涵体（图1-31）。

（四）流行病学特点

（1）易感动物　鸡、鸭、均可感染本病毒，鸭、鹅为其天然宿主，但一般感染后不发病，可以成为病毒的长久宿主，但也有鸭发病的报道。本病只在产蛋鸡中出现，其发生与鸡的品种、年龄及性别有一定关系，一般褐壳蛋鸡最易感，26～32周龄的产蛋鸡感染后症状最明显，而幼龄鸡和35周龄以上的鸡感染后无症状。多种野禽和鸟类体内也能测到抗EDSV的抗体，证明本病毒在各种禽类和鸟类中感染普遍。

（2）传染源　病鸡、带毒鸡、鸭和鹅是本病的传染源。

（3）传播途径　EDSV既可经卵垂直传播，又可通过水平方式传播，其中垂直传播是主要方式。水平传播是通过带毒的粪便和破壳、无壳蛋污染饲料、饮水、用具、环境等再经消化道传播。健康鸡直接啄食带毒的鸡蛋也可感染。另有报道认为，EDS6的零星暴发是通过鸡与感染的野生或家养水禽直接接触而引起的。

（4）流行形式及因素　本病的发生无明显的季节性。当病毒侵入鸡体后，在性成熟前对鸡不表现致病性，在产蛋初期由于应激反应，致使病毒活化而使产蛋鸡发病。

（五）预防及治疗

本病应采取综合性防控措施。对本病尚无成功的治疗方法，发病后应加强环境消毒和带鸡消毒。

（1）防止病毒的传入　从非疫区鸡群中引种，引进的种鸡应严格隔离饲养，产蛋后经HI试验监测，确认HI抗体阴性，方可留做种用。严格执行兽医卫生措施，加强鸡场和孵化厅的消毒工作。饮水经氯处理，切断各种传播途径，另外应注意不要在同一场内同时饲养鸡和鸭，防止鸡与其他禽类尤其是水禽接触。

（2）免疫接种　控制本病主要通过对种鸡群和产蛋群实行免疫接种。一般在开产前3～4周用EDS76油乳剂灭活苗免疫，每只鸡皮下或肌内注射0.5ml，免疫后在整个产蛋期内可获得较好的保护，这些抗体也可以通过卵黄囊传递给雏鸡。

（六）实验室检测

参照标准：NY/T 551—2017。

1.病毒分离和鉴定

（1）试剂

1）pH7.2 0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），配制方法见附录A。

2）产蛋下降综合征抗原（EDS-76）

3）EDS-76阳性血清

（2）样品的采集和处理　酌情采取下列一种或数种方法：

① 扑杀疑似EDSV感染鸡，取适量输卵管和卵泡膜样品，研磨。加PBS制成1∶5混悬液后冻融3次，3000r/min离心20min，取上清液，加入青霉素（使最终浓度为1000IU/ml）、链霉素（使最终浓度为1000μg/ml），37℃作用1h。

② 采集劣质蛋清，加等量PBS，并加入青霉素（使最终浓度为1000IU/ml）、链霉素（使最终浓度为1000μg/ml），37℃作用1h。

（3）鸭胚接种及尿囊液收获　取孵育10～12日龄SPF鸭胚或来自产蛋下降综合征病毒抗体阴性鸭场的非免疫鸭胚，将0.2ml样品［来自（2）］经尿囊腔接种鸭胚，另设接种PBS的鸭胚做对照，37℃孵育。弃掉48h内死亡的鸭胚，收获48～120h死亡和存活的鸭胚尿囊液。

（4）分离物血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验鉴定

1）血凝试验

① 材料　96孔V形血凝反应板、微量移液器。

② 试剂　EDSV标准抗原、磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L），配制方法见附录A。1%鸡红细胞悬液，配制方法见附录B。

③ 血凝试验操作步骤

a.取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1～12孔每孔加入25μl。

b.吸取25μl标准抗原或者待检尿囊液的混悬液加入第1孔中，吹打3～5次，充分混匀。

c.从第一孔中吸取25μl混匀后的标准抗原或者待检尿囊液加到第2孔，混匀后吸取25μl加入第3孔，依次进行系列倍比稀释到第11孔，最后从第11孔吸取25μl弃之，设第12孔为PBS对照。

d.每孔再加入25μl PBS。

e.每孔加入25μl 1%的鸡红细胞悬液。

f.振荡混匀反应混合液，20～25℃下静置40min后观察结果，或4℃静置60min，PBS对照孔的红细胞呈明显的纽扣状沉到孔底时判定结果。

④ 结果判定　结果判定细则如下：

a.在PBS对照孔出现红细胞完全沉淀的情况下，将反应板倾斜，观察各检测孔红细胞的凝集情况。以红细胞完全凝集的病毒尿囊液最大稀释倍数为该抗原的血凝滴度，以使红细胞完全凝集的病毒尿囊液的最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）。

b.如果尿囊液没有血凝活性或血凝效价小于4log2，则用初代分离的尿囊液在SPF鸭胚或非免疫鸭胚中继续传代两代。若血凝试验检测仍为阴性，则判定产蛋下降综合征病毒分离结果为阴性。

c.对于血凝试验呈阳性的样品，应采用EDSV标准阳性血清做血凝抑制试验，并与NDV和HIV阳性血清（H7亚型和H9亚型AIV阳性血清）进行鉴别诊断。

2）血凝抑制试验

① 材料：96孔V形板、微量移液器。

② 试剂

标准抗原：EDSV抗原。

标准阳性血清：EDSV标准阳性血清。

其他阳性血清：新城疫病毒阳性血清，禽流感病毒（H7亚型和H9亚型）阳性血清。

阴性血清：SPF鸡血清。

磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L pH7.2），配制方法见附录A，1%鸡红细胞悬液，配制方法见附录B。

③ 4个血凝单位（4HAU）的EDSV抗原制备：根据血凝试验测定的病毒尿囊液的HA效价，推定4HAU抗原的稀释倍数，配制抗原工作浓度。按下列方法计算：如尿囊液中病毒抗原的HA效价为9log2，其4HAU为7log2，则将尿囊液稀释128倍即可。稀释后，应将制备的4HAU进行HA效价测定以复核验证。

④ 血凝抑制试验操作步骤

a.取96孔V形微量反应板，用移液器在第1～第11孔各加入25μl PBS，第12孔加入50μl PBS。

b.在第1孔加入25μl EDSV标准阳性血清，充分混匀后移出25μl至第2孔，倍比稀释至第10孔，第10孔弃去25μl，第11孔为阳性血清，第12孔为PBS对照。

c.在第1～第11孔各加入25μl含4HAU的EDSV抗原，轻晃反应板，使反应物混合均匀，室温下（20～25℃）静置不少于30min，4℃不少于60min。

d.每孔加入25μl 1%鸡红细胞悬液，轻晃混匀后，室温静置40min，或4℃静置60min。当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果。

e.若血凝抑制效价高于10log2时，可继续增加稀释的孔数。

⑤ 与新城疫和禽流感鉴别诊断　应以NDV和AIV阳性血清对分离物做鉴别诊断，用NDV阳性血清或AIV阳性血清代替EDSV标准阳性血清，进行血凝抑制试验，NDV阳性血清和AIV阳性血清应不能对分离物产生血凝抑制，表1-7中示例结果表示EDSV分离结果阳性。

⑥ 结果判定　结果判定细则如下：

a.在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，判定HI滴度。HI滴度是使红细胞完全不凝集（红细胞完全流下）的阳性血清最高稀释倍数。当阴性血清对标准抗原的HI滴度不大于2log2，阳性血清对标准抗原的HI滴度与已知滴度相差在1个稀释度范围内，并且所用阴、阳性血清都不自凝的情况下，HI试验结果方判定有效。

b.尿囊液血凝效价≥4log2，且EDSV标准阳性血清对其血凝抑制效价≥4log2时判产蛋下降综合征病毒分离结果为阳性。

c.NDV阳性血清和AIV阳性血清应不能对分离物产生血凝抑制。

2.聚合酶链式反应（PCR）检测

（1）试剂和材料　去离子水（dH2O）、PCR扩增用DNA聚合酶、琼脂糖凝胶（配制方法见附录A）、病毒基因组DNA提取试剂盒。

（2）仪器　PCR仪、微量移液器、小型离心机、凝胶成像仪。

（3）病毒基因组DNA提取　样品的采集和处理应选择下列1种或2种：

a.取接种样品后48～120h死亡或存活的鸭胚尿囊液于微量离心管中，3000g离心5min，取上清200μl，备用。

b.采集鸡输卵管组织，匀浆，将混悬液冻融3次，3000g离心5min，取上清200μl，备用。

阳性对照为含有EDSV的尿囊液，阴性对照为SPF鸭胚尿囊液或非免疫鸭胚尿囊液。应用商品化的DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书方法提取上述a./b.样品病毒基因组以及阳性对照和阴性对照样品基因组DNA。

（4）PCR检测

1）PCR检测用引物序列如下。

EPF：5’-TAATTTTCTCGCGACTTTCG-3’（上游引物）。

EPR：5’-ACAGATGAGGTTTGGAAGGA-3’（下游引物）。

2）在样品制备区内，按表1-8配制PCR反应体系于PCR反应管中。

3）同时设检验样品的模板空白对照，平行加样，模板用dH2O 5.0μl代替。

4）设EDSV基因组为阳性对照，阴性尿囊液提取的DNA为阴性对照，平行加样，模板采用已知EDSV基因组DNA或阴性尿囊液提取的基因组DNA 5.0μl。

5）将PCR反应管放入热循环仪（PCR仪），按下列程序设置，进行PCR反应。

1个循环：94℃　　　　　　　　　5min

40个循环：94℃　　　　　  　　　50s

　　　　　55℃　　　　　  　　　45s

　　　　　72℃　　　　　  　　　30s

1个循环：72℃　　　　　　　　　7min

　　　　 12℃　　　　　　 　　　保存PCR产物

6）PCR反应结束后，PCR反应管在电泳鉴定前可置2～8℃冰箱中保存。

（5）琼糖凝胶电泳分析PCR产物

1）配制1×TAE缓冲液（见附录A），制备2%琼脂糖凝胶（见附录A）。

2）取10μl PCR产物，根据加样缓冲液浓度标识按比例与加样缓冲液混合，进行电泳，加入DNA Marker作为分子标准。

3）连接电源，进行电冰，80～100V（按电泳槽装置设定，电压3～5V/cm）恒压电泳20～30min（Loading Buffer指示电泳至大约凝胶的一半时），使用凝胶成像仪进行凝胶成像，拍照，记录结果。

（6）结果判定　EDSV阳性对照应有大小约0.43kb（431bp）扩增条带，阴性对照和模板空白对照应无扩增条带，说明PCR反应体系成立。

实验成立的条件

① 检测样品中若有大小约0.43kb的扩增条带，说明样品中有EDSV基因组DNA存在，判定为阳性。

② 检测样品中若无0.43kb的扩增条带，说明样品中没有EDSV基因组DNA存在，判为阴性。

附录A

（规范性附录）

试剂配制

A.1　磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH7.2）的配制

A.1.1　成分

磷酸氢二钠　　　　　　　　2.62g

磷酸二氢钾　　                　　0.37g

氯化钠　　                        　　8.5g

A.1.2　配制

将A.1.1成分加入定量容器内，加800ml去离子水，充分搅拌溶解，用NaOH或HCl调pH至7.2，定容至1000ml，分装，112kPa灭菌20min，2～8℃保存备用。

A.2　50×TAE缓冲液的配制（pH8.0）

A.2.1　成分

Tris　　                             　　242g

Na2EDTA·2H2O　　        　　37.2g

A.2.2　配制

将A.2.1成分加入定量容器内，加入800ml去离子水，充分搅拌溶解，加入57.1ml的冰醋酸充分混匀，用NaOH或HCl调pH至8.0，加去离子水定容至1000ml，室温保存。

A.3　2%琼脂糖凝胶的配制

A.3.1　成分

琼脂糖　　　                        　2g

1×TAE缓冲液　　　       　　100ml

A.3.2　配制

取50×TAE缓冲液2ml，加入98ml去离子水，配成100ml 1×TAE缓冲液，加入三角烧瓶。加热充分溶解，当温度降低至约50℃，加入3～5μl EB或EB替代物，混匀后倒入制胶模具内，插入齿梳，等待胶固。

附录B

（规范性附录）

1%鸡红细胞悬液制备

采集至少3只SPF公鸡或无产蛋下降综合征病毒、禽流感病毒和新城疫病毒抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放入离心管中，加入3～4倍体积的PBS混匀，以2000r/min离心5～10min。去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，反复洗涤3次（洗净血浆和白细胞），最后，吸取压积红细胞，用PBS配成体积分数为1%的悬液，于4℃保存备用。