六、基因工程技术
（一）基因工程介绍和基本原理
基因工程是现代生物学研究的重要手段，它是综合运用多项现代生物技术，实现DNA分子人工定向改造的一种技术方法。主要原理是在体外将目的DNA分子利用各种DNA修饰酶，主要是DNA限制性核酸内切酶和DNA连接酶，进行修饰改造后，重新生成具有新的性状的重组DNA分子。基因工程除了可以构建各种重组质粒外，还可以对基因组DNA进行改造，在基因组的特定位置点删除、替换、插入外源基因序列，构建各种基因工程菌。
基因工程技术涉及以下步骤：
（1）从生物体的基因组中分离目的DNA序列（基因）。这通常包括DNA的纯化技术、酶促消化或机械切割等。
（2）建立人工的重组DNA分子（有时称为rDNA），即将目的基因插入一能在宿主细胞中复制的DNA分子，即克隆载体。对细菌细胞来说，合适的克隆载体有质粒和细菌噬菌体。
（3）将重组DNA分子转到合适的宿主中，如大肠杆菌。当利用质粒时，对一个重组的病菌载体来说，此过程又称为转化或转染。
（4）利用细胞培养技术，培养筛选转化的细胞。一个转化的宿主细胞能生长并产生遗传上相同的克隆细胞，每个细胞都携带着转化的目的基因，此技术就是常指的“基因克隆”或“分子克隆”。
（二）质粒D NA的提取与纯化
从细菌中分离纯化质粒DNA的主要步骤：
（1）细胞壁的消化，将细菌温育在裂解液中去除细胞壁中的肽聚糖。通常在等渗的情况下进行，以防止细胞涨破释放出染色体DNA分子。注意，革兰阳性菌对裂解酶相对不敏感，需要额外的处理以使酶到达细胞壁层，例如，可采用渗透压休克或保温在螯合剂中，如EDTA。EDTA也能使一些细菌的脱氧核糖核酸酶失活，以防止在提取过程中质粒DNA降解。
（2）利用强碱（NaOH）和其他试剂，如十二烷基硫酸钠溶解细胞膜并使蛋白质部分变性。再中和此溶液使不溶性染色体DNA沉淀，质粒DNA存于溶液中。
（3）移去其他的大分子物质，特别是RN A和蛋白质，这可利用核糖核酸酶和蛋白酶进行酶促消化。另一些化学纯化步骤可增加质粒DNA的纯度，例如，可将提取物同水饱和酚或酚/氯仿混合物混合，以除去蛋白质。再离心，DNA留在上面的水层，蛋白质则分离在下面的有机溶剂层。重复酚/氯仿提纯的循环可降低样品中这些大分子蛋白的含量到最少。还可通过等密度的CsCl梯度离心法得到纯化的DNA。
（4）利用体积分数为70%左右的乙醇沉淀DNA，离心，得到的DNA沉淀再用体积分数为70%的乙醇洗，其中的水将除去先前阶段的盐污染。经过提纯的DNA，可冷冻保存备用，或重新溶解在缓冲液中。
（三）琼脂糖凝胶电泳分离D NA
DNA分子带负电，从琼脂糖凝胶的负极向正极泳动，速度依赖于其相对分子质量——小的紧密的DNA分子的较大伸展片段容易穿过琼脂糖介质。依据所要分离的DNA分子的大小来选择琼脂糖的浓度（图2-15），分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2%～1.5%，分离大于10kb的DNA片段所需胶浓度为0.3%～0.7%，大小介于两者之间的片段所需胶浓度为0.8%～1.0%。要注意以下几点：
图2-15 DNA的琼脂糖凝胶电泳
（1）用移液枪将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25μL，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。
（2）常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。
（3）在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝），用以看出样品移动的距离。
（4）在一个或几个孔中加入标准相对分子质量样品，电泳结束后，根据已知相对分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。
（5）电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。
（6）电泳结束后，将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭（EB）中，5min后即可看到DNA带，EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。另一种方法是电泳时，在胶中加入EB。
（7）在紫外灯下，由于EB发出强烈的橘红色的荧光，所以可以看到DNA带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng DNA。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样，利用特制的照相机和调焦器，也可以对凝胶拍照。
如果要对某一条带（如质粒）进一步分析，可用小刀将含该带的凝胶切割下来，从带中回收DNA。
（四）Southern印迹法鉴定特定DNA
利用经典的琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段后，可将DNA变性，通过Southern技术（根据E.M.Southern命名）转移到滤膜上。此过程主要步骤是：
（1）将胶浸在碱性环境下，使双链DNA变形为单链DNA。
（2）将一含氮纤维素膜直接放在凝胶上，然后放几层吸水纸。当缓冲液通过毛细作用进入吸水纸时，DNA即被转移到滤膜上。
（3）通过放射性标记的互补单链DNA探针温育，特定DNA序列的某些片段与探针杂交，通过放射自显影技术即可鉴定DNA。
（五）利用聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA
PCR一般包括变性、退火和延伸三个阶段。
（1）DNA变性 加热DNA（如94℃，1min），将两条链分开。
（2）引物退火 加入寡聚核苷酸引物，它们同目的片段的一部分互补，并且当温度降低时（如55℃，2min）可以在恰当的位置上与目的片段杂交（退火）。
（3）引物延伸 借助一种耐热的DNA聚合酶［如Taq酶，来源于耐热细菌（Thermus aquation）］延伸引物。在这一过程中（如72℃，2min）每一条初始链上可以产生一条与之互补的链，使目的片段倍增。
重复DNA链的分离、退火和引物的延伸这一循环，会使所需要的DNA序列以指数速度扩增。
（六）DNA浓度检测
在水溶液中判定核酸量的最简单方法是利用分光光度计测量溶液在230nm下的吸光值。注意A260值适用于纯化的DNA，而利用上述方法提纯的质粒DNA会含一定量的RNA污染，RNA同DNA具有相似的光吸收特性。纯化的核酸其A260/A280的值应在1.8～2.0之间，当蛋白质污染时，此值会偏小。蛋白质的检测可在280nm下，测量溶液的光吸收值。如果纯化后得到的溶液A260/A280比值比1.8～2.0小，应该重复酚/氯仿纯化这一步。
（七）DNA的酶切与连接
限制性内切酶（常称限制酶）可识别双链DNA的特定序列（通常为4～6个核苷酸）并将其切断，此位点即限制性位点。每种酶的命名都是从分离出来该种酶的细菌的名字衍生而来，如Hind Ⅲ是从流感嗜血杆菌株Rd中得到的第三种限制酶（图2-16）。大多数的限制酶在DNA不同的位置切开两条单链，产生一个短的单链区域，即所谓黏性末端。也有一些限制性酶切割DNA会产生平末端。可以切除黏性末端的限制内切酶被广泛应用于基因工程中，只是因为用同一种限制性内切酶酶切的两种DNA会产生一个单链互补区域。这样，由于该区域内单个碱基间氢键的形成，DNA连接酶可以把两个DNA分子之间被切割的片段连接起来。
图2-16 限制性酶HildⅢ的识别位点
（图中纵向箭头所指为每条链的切割位点）
限制性内切酶在分子遗传学上的两个重要用途是：
（1）构建内切酶图谱 一个DNA分子能被切成几个限制性片段，这些DNA片段的数量和大小可以通过琼脂糖凝胶电泳来确定。限制性酶切位点的位置可用于构建某种特殊分子（如质粒，见图2-17）的限制性酶切鉴定图谱。
图2-17 质粒pBR322 的限制性酶切谱图
［图中阴影部分表示限制性酶切位点氨苄青霉素抗性基因（amp）和四环素抗性基因（tet）］
（2）基因工程 用同一种酶酶切（图2-18），并且由互补碱基配对退火的两个限制性内切片段可以利用另一种细菌酶（DNA连接酶）最终连在一起，构成重组分子（图2-19），其中DNA连接酶所起的作用是在退火的DNA链之间形成磷酸二酯键。若上述两个DNA分子一个是载体，另一个是目的DNA，则重组质粒的大小是可以估算的（如一个有4500个碱基对的质粒加上一个2500个碱基对大小的目的DNA片段可以形成一个具有7000个碱基对的重组分子），并通过电泳将其分离出来。基因工程中使用的大多数质粒编码有两个或两个以上易检测的标记基因（如抗生素抗性基因），且每个质粒上有单一的限制性位点（图2-19）。
图2-18 质粒酶切示意图
图2-19 质粒与目的DNA退火、连接，形成只有氨苄青霉素抗性的重组质粒
（八）合适的宿主细胞的转化
一旦在体外已形成重组的载体，它必须被转入一合适的宿主细胞（如大肠杆菌）。
1.大肠杆菌感受态细胞的制备
（1）从LB平板上挑取新鲜活化菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养12h左右，至对数生长后期。
（2）取2mL菌液接入50mL LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养2～3h，至OD=0.3～0.5。
（3）将培养液于冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10min。
（4）弃上清液，用10mL预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液中轻轻悬浮细胞。
（5）然后置于冰上放置15～30min后，4℃下3000g离心10min。
（6）弃上清液，加入4mL预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液中轻轻悬浮细胞。
（7）在冰上放置几分钟，即制成感受态细胞。
（8）将得到的感受态细胞分装成200μL的小份，贮存于-70℃。
注意：所用的0.05mol/L CaCl2溶液、含15%（质量浓度）0.05mol/L的CaCl2溶液、移液枪、枪尖都要在4℃下预冷。
2.基因的转化方法
（1）低温下用CaCl2预处理 感受态细胞与DNA溶液混合后在4℃下放置30min左右，然后给一个短时间的热冲击（如42℃，2min）。低温培育使DNA黏附在细胞上，热冲击促进DNA的吸收。为了最大限度地提高热冲击/CaCl2处理对大肠杆菌（E.coli）的转化效率，要使用薄壁玻璃试管并尽量减少溶液的体积，这样可以使细胞经历一个迅速的温度改变过程。
（2）电击法 细胞或原生质体经过非常短时间的电击（通常＞1kV/cm，＜10ms），可以进入细胞。
（3）对植物和动物细胞来说，可以利用许多技术，例如原生质体的电击或各种微量注射处理。
这些处理可造成膜通透性的暂时增加，从而使宿主细胞从外部介质中吸收质粒DNA。这类系统经常是低效的，只有少于0.1%的细胞表现出稳定的转化结果。但这一问题并不重要，因为应用标准的微生物平板技术，一个有用的转化体可以生长并产生出大量的相同细胞。
（九）转化子的筛选与检测
用于基因工程的许多质粒载体含有编码抗生素抗性的基因，如pBR322携带有氨苄青霉素抗性基因（amp）和四环素抗性基因（tet）。这些基因作为载体的标记，其中一个（如amp）可以用来选择转化子，因为转化子能在含有抗生素的琼脂糖培养基上形成菌落，而非转化的细胞被杀死。另一个基因（如tet）可以用作重组的质粒载体的标记，因为目标序列插入此基因导致插入失活。因此，用重组质粒转化的细胞仅对amp有抗性，而环状（天然）质粒转化的细胞对amp和tet都有抗性。
区分这两类转化体的一种方法是使用复制平板：
（1）转化体首先放在含氨苄青霉素的琼脂培养基的培养皿上生长，过夜培养后，两种类型的细菌均会产生单一的菌落。
（2）将一张无菌茸板轻轻压在培养皿表面，使一些细胞转移到板上。
（3）将板上的细菌接种在含有四环素的琼脂培养基上（即一个复制平板），任何仅能在第一个平板上生长的菌落一定来源于包含有重组质粒的细胞。这些菌落可用于筛选特定的目的DNA（如使用免疫技术）。
PUC系列质粒比pBR322系列质粒的应用更广泛，这种质粒具有以下优点：
（1）拷贝数 每个细菌细胞中存在着几千个相同拷贝的质粒，提高了质粒DNA的产量。
（2）重组子的“一步选择” 这种质粒携带有氨苄青霉素抗性基因，并在β-半乳糖核苷酶的基因中含有一个多克隆位点。β-半乳糖核苷酶基因的插入失活可以被包含有一种合适的酶诱导物（如异丙醇基硫代半乳糖苷）和生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）的琼脂培养基检测到。来源于有质粒的细胞的菌落呈蓝色，而含有重组分子的菌落呈白色。
另有一些质粒使用不同的标记物，如荧光素酶基因可以在荧光素底物的存在下通过生物发光检测阳性重组子。
（十）最新克隆技术介绍
传统的基因克隆必须经过限制性酶切和DNA连接两步反应。除了操作烦琐外，是否能够找到合适的限制性酶切位点是基因克隆能否顺利进行的最大限制因素。现在开发了一些不依赖于限制性内切酶和DNA连接酶的基因克隆技术。这些不依赖于连接酶的基因克隆技术大大地方便了插入位点的选择（原则上可以在任意位点插入任意DNA序列），扩大了操作通量，连接酶非依赖性克隆的关键是生成长的单链黏性末端，插入片段和克隆载体的黏性末端彼此配对，形成双链DNA（带有两个nick缺口），由于黏性末端长于10核苷酸，因此该带nick缺口的双链DNA在常温下足够稳定，可以有效转化到大肠杆菌宿主细胞内，在细胞内DNA修复系统可以修复好nick缺口，形成完整闭环的重组DNA分子。生成长单链黏性末端的方法有很多种，T4DNA聚合酶，在某种dNTP存在下，处理DNA片段是一种方法，T4DNA聚合酶从3′端降解DNA直到遇到的核苷酸与溶液中的dNPT相同，此时消化反应与dNTP导致的聚合反应达到平衡，消化反应停止下来，形成长的黏性末端。产生长片段黏性末端的方法如下：
另外，给予重组酶的克隆技术也比传统的限制性酶切连接方法有很大的优势，其操作通量大，阳性克隆百分比高。基于重组酶的克隆技术主要有基于Cre重组酶和lambda噬菌体重组系统与Gateway克隆系统。这两个系统分别由Clontech和Invirtrigen公司生产。它们能够在克隆载体与DNA插入片段间的特定碱基序列间发生DNA重组反应，将DNA片段插入克隆载体中。基于非连接酶反应的克隆技术操作通量大，可以在96孔板中进行，因此在现代功能基因组和结构基因组学中有着重要应用。