五、免疫化学技术

（一）免疫化学技术简介

现代免疫化学是研究抗原与抗体的组成、结构以及抗原和抗体反应的机制的学科。此外，还研究体内其他免疫活性物质，如补体分子的组成、结构及其功能。目前，免疫化学已经应用于免疫性疾病发病机制的基础研究和临床检测等。

随着免疫化学、细胞生物学及分子生物学的进展，免疫学实验技术也迅猛发展，并已成为当今生命科学研究的重要手段，尤其是在医学基础研究和临床实践中得到广泛应用。

免疫学检测方法可分为体液免疫测定及细胞免疫测定。前者主要是根据抗原与相应抗体能在体外发生特异性结合，并在一些辅助因子的参与下出现沉淀、凝集及溶解等反应，从而采用已知抗原检测未知抗体，或用已知抗体检测未知抗原。此外，还包括检测体液中各种可溶性免疫分子，如补体、各类免疫球蛋白、循环免疫复合物、溶菌酶、各种细胞因子等。

细胞免疫测定则是根据各种免疫细胞（T细胞、B细胞、K细胞、NK细胞及巨噬细胞等）表面所具有的独特标志及其各自的特殊功能，在体外（有时也可在体内）测定上述各种细胞及其亚群的数量和功能，以帮助了解机体的细胞免疫水平。

（二）免疫化学基本原理

1.抗原的免疫原性和专一性

（1）抗原与免疫原 抗原（antigen，Ag）是一类能刺激机体免疫系统发生免疫应答，并能与相应免疫应答产物（抗体和致敏淋巴细胞）在体内或体外发生特异性结合的物质，也称免疫原（immunogen）。前一种性能称为免疫原性（immunogenicity）或抗原性（antigenicity），后一种性能称为反应原性（reactogenicity）或免疫反应性（immunoreactivity）。

（2）抗原的分类 根据抗原物质所具备的性能，可将其分为完全抗原（complete antigen）和半抗原（hapten）两类。同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原，如细菌、病毒、异物动物血清等。仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质称为半抗原，如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合形成复合物，便获得免疫原性，这种与半抗原结合并赋予它免疫原性的蛋白质大分子称为载体（carrier）。根据抗原的来源不同分为外源性抗原和内源性抗原。外源性抗原是从外界引入体内而刺激机体发生免疫应答的。内源性抗原是指体内的自身成分，如机体的组织或细胞因理化因素作用或病毒感染使这些成分发生改变或修饰，成为一种自身抗原或新生抗原，使机体免疫反应。而根据抗原的化学成分组成可分为蛋白质、糖类、脂类与核酸等抗原。

（3）异物性 免疫活性细胞在正常情况下具有高度精确的识别能力，能识别“自己”和“非己”，将非己物质加以排斥。免疫应答就其本质来说，就是识别异物和排斥异物的应答，故激发免疫应答的抗原一般是异物，具有异物性的物质可分为以下几种：①异种物质，马血清、异种蛋白质、各种微生物及其代谢物，对人体来说是异种物质，均为良好抗原。②同种异体物质，高等动物同种不同个体之间，由于遗传基因不同，其组织成分的化学结构也有差异。因此，同种异体物质也可以是抗原物质。例如人体红细胞A、B、O血型物质和人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）即属此类。③自身抗原，自身组织成分通常无抗原性，但在某种异常情况下，自身成分也可成为抗原物质。

抗原一般为大分子物质，其相对分子质量在10000以上。在一定范围内，相对分子质量越大，其抗原性越强。相对分子质量在5000以下的肽类，一般无抗原性；相对分子质量为5000～10000的肽类为弱抗原。抗原须是大分子物质的原因为：①相对分子质量越大，表面的抗原决定簇越多，而淋巴细胞要求一定数量的抗原决定簇的刺激才能活化；②大分子胶体物质的化学结构稳定，不易被破坏和清除，在体内停留时间较长，能持续刺激淋巴具备上述性状的物质必经过非消化道途径进入机体（包括注射、吸入、混入伤口等），并接触免疫活性细胞，才能成为良好抗原。

（4）抗原决定簇（antigenic determinant，AD）抗原决定簇是存在于抗原表面的特殊基团，又称表位（epitope）。抗原可通过表面抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也借此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。一个抗原分子可具有一种或多种不同的抗原决定簇，每种决定簇只有一种抗原特异性。抗原决定簇的大小相当于相应抗体的抗原结合部位。一般蛋白质的决定簇由5～6个氨基酸残基组成，一个多糖决定簇由5～7个葡萄糖残基组成，一个核酸半抗原的决定簇包含6～8个核苷酸。

抗原结合价（antigenic valence）指能与抗体分子结合的决定簇的总数，包括抗原表面功能价及其内部非功能价。

2.抗体的结构与功能

抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称免疫球蛋白（immunoglobulin）。在免疫应答过程中，抗体主要由分化的B淋巴细胞产生，但有时也需要其他类型的细胞，如T淋巴细胞和巨噬细胞的协同作用。抗体主要分布在体内血清中或外分泌液中，对体液免疫应答起主要作用。目前已发现的人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。免疫球蛋白最显著的特点是与抗原特异性结合以及其分子的不均一性。

各种不同类别的免疫球蛋白分子都含有由四条多肽链组成的基本结构单位，即由两条重链（heavy chain，H链）和两条轻链（light chain，L链）通过不同数目的二硫键结成Y形。在抗体分子的N端，不同抗体分子的氨基酸组成和顺序都是不同的，此区为“多变区”（variable region，V区），它是抗体分子与抗原决定簇的结合部位。由于抗体多变区这一结构特点，决定了它对抗原分子“识别功能”的多样性。不同抗体分子的C端结构基本恒定，称为“稳定区”（constant region，C区）。当抗原与抗体结合时，抗体分子发生变构效应和集聚作用，使稳定区的某些部位暴露出来，并立即发生一系列免疫生理效应，如固定补体，促进对抗原分子的吞噬、溶解和清除作用。

3.抗原与抗体的结合

抗原与抗体在体外结合时，可因抗原的物理性状不同或参与反应的成分不同而出现各种反应，例如凝集、沉淀、补体结合及中和反应等。在此基础上进行改进，又衍生出许多快速而灵敏的抗原抗体反应，例如从凝集反应衍生出间接凝集、反向间接凝集、凝集抑制试验、协同凝集试验等；从沉淀反应结合电泳，衍生出免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳等。此外，还有各种免疫标记技术，如免疫荧光、酶免疫测定、放射免疫、免疫电镜及发光免疫测定等。抗原抗体结合具有高度特异性，即一种抗原分子只能与由它刺激所产生的抗体结合而发生反应。抗原的特异性取决于抗原决定簇的数目、性质和空间构型，而抗体的特异性则取决于抗体Ig Fab段的可变区与相应抗原决定簇的结合能力。抗原与抗体不是通过共价键，而是通过很弱的短距引力而结合，如范德华引力（Van der waal’s attraction force）、静电引力（electrostatic force）、氢键（hydrogen bond）及疏水性作用（hydrophobic effect）等。

疏水性结合或疏水作用在各种抗原抗体相互反应中十分重要。抗原和抗体分子上的疏水决定簇在水中不形成氢键，因此倾向于彼此间相互吸引，而不与水发生作用，故称之为疏水性作用。疏水性作用虽不是引力，但它有助于抗原抗体的结合。例如，含有苯基的抗原决定簇倾向于被其他非极性基团围绕，因此该抗原决定簇从水环境中移动进入抗体分子的Fab段的裂缝中，与抗体结合。这说明结合的高能量归因于苯基的疏水性作用。

当pH和离子强度在生理条件下时，上述这些引力通常是最大的。pH低于3.0或高于10.5时，这些引力非常弱，所以抗原抗体复合物易解离。

抗原抗体的结合含有高度特异性，这种结合虽具有相当稳定性，但为可逆反应。因抗原与抗体两者为非共价键结合，犹如酶和底物的结合一样，两种分子间不形成稳定的共价键，因此在一定条件下可以解离。

抗原与抗体的结合，在一定浓度范围内，只有当两者分子比例合适时，才出现可见反应。以沉淀反应为例，分子比例合适，沉淀物产生既快又多，体积大。分子比例不合适时，沉淀物产生少，体积小，或不产生沉淀物。对参与沉淀反应的抗原-抗体系统可进行定量测定，即将抗体置于一系列的试管中，加入不同量的相应纯抗原，混合后，观察所发生的反应，对沉淀物可作精确定量。若抗体量固定不变，抗原量逐渐增加，可观察沉淀反应中抗原、抗体分子的比例关系。由图2-10可见有三个抗原抗体相互作用的区带：①抗体过剩区（antibody excess zone），加入抗原量少，则沉淀物少，上清液中有游离的抗体（free antibody）。②平衡区（equivalence zone），抗原量逐渐增加，沉淀物也逐渐增多，直到抗原、抗体比例最佳时，出现连续而稳定的抗原-抗体晶格（lattice）沉淀，此时沉淀物中抗原抗体复合物量最多，上清中测不到游离的抗原（free antigen）或抗体，此为平衡区或等价带。③抗原过剩区（antigen excess zone），抗原量继续增加，所有抗体均与抗原结合，此时上清液中可测出游离的抗原，在此区带中，由于抗原过剩，形成可溶性抗原抗体复合物，因而沉淀反应部分或完全被抑制。

抗体与抗原的结合是否出现可见反应，与抗原抗体的胶体特性及极性基吸附作用有关。抗体球蛋白和抗原（大多为蛋白质，也有为多糖、类脂或其他化合物的）在溶液中均属于胶体物质，带有电荷。胶体粒子又有许多强极性基（如蛋白质的羧基、氨基及肽链等），它们与水有很强的亲和力，在粒子外周构成水层，称为亲水胶体。

胶体粒子的稳定性即依赖于所带的水层及电荷，其中亲水胶体的稳定性较高。抗体和大多数抗原均属于亲水胶体。

抗原抗体反应一般分为两个阶段，第一阶段为抗原和抗体的特异性结合，此阶段需时很短，仅几秒到几分钟，但无可见现象出现。接着为第二阶段，即可见反应阶段，表现为凝集、沉淀、细胞溶解等。此阶段较长，历时数分钟、数小时甚至数天。此阶段反应现象的出现可受多种因素的影响。

抗原与抗体一般为蛋白质，它们在溶液中都具有胶体性质，当溶液的pH大于它们的等电点时，例如，在中性和弱碱性的水溶液中，它们大多表现为亲水性，且带有一定量的负电荷。特异性抗原和抗体有相对应的极性基，抗原和抗体的特异性结合，也就是这些极性基的相互吸附。抗原和抗体结合后就由亲水性变为疏水性，此时易受电解质影响。如有适当浓度的电解质存在，就会使它们失去一部分负电荷而相互凝聚，于是出现明显的凝聚或沉淀现象。若无电解质存在，则不发生可见反应。

抗原抗体反应，特别是第二阶段受温度的影响很大。在较高的温度中，由于抗原抗体复合物碰撞机会增多，复合物体积继续增大的机会也多，故反应现象加速出现。但温度过高（56℃以上），则抗原或抗体将变性或破坏。一般置于37℃的恒温水浴中，使反应迅速出现。

合适的pH是抗原抗体反应必要的条件之一。pH过高或过低可直接影响抗原和抗体的理化性质。

将可溶性抗原（如小牛血清）与相应抗体（如兔抗小牛血清的抗体）混合，当两者比例合适并有电解质（如氯化钠、磷酸盐等）存在时，即有抗原-抗体复合物的沉淀出现，此为沉淀反应（precipitin reaction）。如以琼脂凝胶为支持介质，则在凝胶中出现可见的沉淀线、沉淀弧或沉淀峰。根据沉淀出现与否及沉淀量的多寡，可定性、定量地检测出样品中抗原或抗体的存在及含量。免疫学的一些测定方法即基于此特性。

双向扩散法（double diffusion），最早由Ouchterlony创立，故又称Ouchterlony法。此法是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应（图2-11）。琼脂凝胶是多孔的网状结构，大分子物质可以自由通过，这种分子的扩散作用使分别处于两处的抗原和相应抗体相遇，形成抗原-抗体复合物，比例合适时出现沉淀。由于凝胶透明度高，可直接观察到复合物的沉淀线（弧）。沉淀线（弧）的特征与位置取决于抗原相对分子质量的大小、分子结构、扩散系数和浓度等因素。当抗原、抗体存在多种系统时，会出现多条沉淀线（弧）。依据沉淀线（弧）可以定性抗原。此类操作简便、灵敏度高，是最为常用的免疫学测定抗原和测定抗血清效价的方法。

免疫电泳法（immunoelectrophoresis）是在凝胶介质中将电泳法与扩散法相结合的一种免疫化学方法，用以研究抗原和抗体。免疫电泳是使血清在琼脂或琼脂糖中进行的电泳。在一定电场强度下，由于血清中各种免疫球蛋白分子大小以及荷电状态和荷电量状态均有差异，因而它们的泳动速度各不相同，加上电泳过程中电渗作用的影响，使各自组分分离（图2-12）。

在一定电场强度下，抗原与相应抗体在琼脂介质中加速扩散相遇而形成复合物沉淀，这种检测方法称作电免疫扩散法（electroimmunodiffusion）。由于操作方法不同，电免疫扩散法可分为对流免疫电泳（countercurrent mmunoelectrophoresis）（图2-13）、交叉免疫电泳和火箭免疫电泳（图2-14）。

酶免疫测定（enzyme innunoassay，EIA）或免疫酶技术是指用酶标记抗原或抗体进行的抗原抗体反应。它采用抗原与抗体的特异反应与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。目前常用的方法称为酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），其方法简单、方便迅速、特异性强。ELISA是有抗原（抗体）先结合在固相载体上，但保留其原免疫活性与酶活力，偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应后，再加上酶的相应底物，发生催化水解或氧化还原反应而呈现颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。

酶免疫测定技术还包括生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）、均相酶免疫测定法（homogeneous enzyme immunoassay，HEI）等。

免疫标记技术中还有免疫荧光技术（immunofluorescence technique）、放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）和发光免疫测定（luminescent immunoassay，LIA）等。

此外，免疫印迹或免疫转印技术（immunoblotting或Western blot）已广泛应用于分子生物学和医学领域，成为免疫学、微生物学及其他生命学科常用的一种重要研究方法。实际上它是由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质转印和固相免疫测定三项技术结合而成的。其基本原理是蛋白质样品经过SDS-PAGE分离后，通过转移电泳或直接印渍方式原位转印至固相介质上，并保持其原有的物质类型和生物学活性不变，然后应用抗原抗体反应进行特异性检测。此技术具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高度特异性和敏感性，方法简便，标本可长期保存，便于比较。