第二节 样品的制备和前处理技术
一、样品制备和前处理的定义和目的
样品的制备和前处理，两者间没有本质上的区别，有时统称为样品的处理，是指样品经一些准备性处理转化为最终分析试样的技术过程。其目的是去掉试验样品中不值得分析的部分和一部分杂质，保证分析试样十分均匀，通过浓缩试样以提高试样中的待检物的信号强度。样品的制备和前处理常常是整个分析或检验工作中最麻烦和误差较大的一部分，由于前处理方法不同和操作水平的差异导致分析结果出现较大差异的现象已屡见不鲜。分析工作中，完整的分析方法多包括对样品前处理的介绍，即使这样，由于食品样品的多样性，前处理方法还需操作者灵活掌握。因次，充分理解和掌握主要的处理技术具有重要意义。从处理技术的复杂性来看，样品制备是一些简单的处理，包括样品整理、清洗、匀化和缩分等，有些分析试样只需经过样品制备就已准备停当。那些还未就此准备停当的分析试样则需经过进一步处理才能最终作为分析试样，这些进一步的处理就是前处理，例如灰化、消解、提取、浓缩、富集、净化、层析纯化等。
二、样品制备
（1）面粉、淀粉、砂糖、乳粉、咖啡等粉末状和较细的颗粒状食品的样品制备 只需充分搅拌均匀就可作为一般检验项目分析样品。茶叶、烟叶、饼干等样品只需简单粉碎并充分混匀就可作为一般检验项目分析样品。
（2）谷物、豆子、坚果、花椒等天然颗粒状食品的样品制备 包括去杂和去壳，有些检验项目还要求去麸、皮、籽、小梗等。大的固体杂物一般凭手工或分选器捡出，尘土、小梗等细粒和粉末状杂质可经筛分法去除，硬壳一般凭手工破碎后剥去，麸皮的去除则需磨粉和筛分。这些过程中，去掉的物质要计量，加入的水分也要计量，以备分析结果计算时可能应用。
（3）饮料、油脂、炼乳、蜂蜜、酱油、糖浆等液态食品的样品制备 主要是充分混匀，如果这些样品中有结晶、结块或很稠时，可在不高于50℃的水浴中边加温边搅拌使其充分匀化。
（4）个体过大的固体食品的样品制备 如香肠、水果、面包、动物、瓜、薯类等，要设法减小个体体积才能进一步匀化，这就是此类样品制备时的缩分。此时缩分技术的基本要点是不断中分和间隔切分，每次留下具有代表性的一部分。例如，对于水果，应不断沿着果顶和果梗的轴线对角切分，每次留下对角的两部分，直到达到必要的缩分程度后混合；对于火腿肠，可沿着长轴均匀切分为若干小节，然后每隔几节从中取一节混合；对于去除内脏的动物，可沿身体的对称轴对分，取其一半最后混合。
（5）整鱼、贝、畜、禽、蛋及生鲜水果、瓜、蔬菜、薯类等食品的样品制备 要去除不可食部分，冻鱼表面的冰和干咸鱼表面的盐也要去除，盐水鱼罐头的盐水一般也弃去。有些还要把不同器官或不同部分分割后再匀化，去除部分不论是弃去还是单独分析，都要计量，以备分析结果计算时可能应用。
（6）罐头食品的样品制备 将罐头打开，固体和汤汁分别称重，小心去除固体中的不可食部分（如骨头）后再称重，按可食固体和液体的质量比各取一定量，混合后于捣碎机内捣碎匀化。
（7）水果、蔬菜、薯类等生鲜农产品的样品制备 分析前一般必经清洗和去皮，但分析农药残留时，原则上不宜清洗和去皮，须小心仔细地将泥土简单清除。
三、样品的前处理
（一）提取
提取是待测物质与样品分离的过程，目的是去除分析干扰物和富集待测物质。
使用无机或有机溶剂从样品中提取被测物，是常用的样品处理方法。如果样品为固体，该法被称为浸提，如果样品为液体，该法被称为萃取。
提取法的原理是溶质在互不相溶的介质中的扩散分配。将溶剂加入样品中，经过充分混合和一定时间的等待，溶质就会从样品中不断扩散进入溶剂，直到扩散分配平衡。平衡时，溶质在原介质和溶剂中的浓度比称为分配系数（K），它是一次提取所能达到的分离效果的主要影响因素之一。经过一次提取达到平衡并将溶剂分出后，又可另加新溶剂进行第二次提取。如此反复提取直到溶质都转移到溶剂中。
溶剂的选择：应该选择对被测物和干扰物有尽可能大的溶解度差异的溶剂，还应避免选择两介质难以分离、黏度高和易产生泡沫的溶剂。这就是要求：被测物在所选溶剂对原介质中分配系数高，所选溶剂和原介质密度差大，溶剂加入后体系的界面张力适中，溶剂黏度低，溶剂对体系来说化学惰性高。一般选择溶剂时，难溶于水的或相对非极性被测物用石油醚、乙醚、氯仿、二氯甲烷、苯、四氯化碳等作提取溶剂，易溶于水或相对极性的被测物质用水、酸性水溶液、碱性水溶液、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等作提取剂。例如，食品中的小分子碳水化合物、食盐、多数色素和水溶性着色剂、生物碱、山梨酸钾、苯甲酸钠、糖精钠、酚类、类黄酮、重金属等可在第一类溶剂中选出某种来提取，食品中的脂肪、脂溶性维生素、固醇类、类胡萝卜素、有机氯和有机磷农药残留、黄曲霉素、香气物质等可在第二类溶剂中选出某种来提取。
少量多次提取最常见的设备是索氏提取器。常用它提取固体样品中的油脂、脂溶性色素、脂溶性维生素等，常用低沸程石油醚、乙醚等作提取剂，样品受热温度低，提取效率高，操作方便，但是花费时间长。
少量多次萃取技术中最常见的设备是连续液－液萃取装置（如图1-2所示）。此设备所用溶剂应当比液体样品原来的介质密度大，且二者不相互溶。溶剂不断回流通过样品溶液，将待萃出物带入萃取溶剂收集器，萃取剂在这里受热气化，到冷却管再次回流。这种方法若改造一下管路，也适用于比液体样品原来的介质密度小的溶剂。
超临界CO2萃取技术和液态CO2提取技术在食品界得到了越来越多的应用。它们的应用范围主要在提取香精油、保健成分和其他天然有机成分。这两种提取方法使用的溶剂（CO2）对原介质和待提取物的化学惰性高，提取后CO2很易完全挥发，所以在最终样品中无残留。这两种方法提取效率高、样品不必过于破碎，因此是很高级的提取方法，也可用于分析工作。
图1-2 连续液—液萃取装置
1—萃取溶剂收集器2—气态溶剂3—萃取溶剂4—冷凝器5—萃取液6—溶剂返回管7—萃取溶剂返回到收集器
液态CO2提取技术除了要求有低温条件以保证CO2不大量挥发损失外，其他方面与一般的溶剂提取无任何差别。超临界CO2萃取技术则要求用专门的仪器，这种仪器既包括提取室和分离室，并有一套控温、加压系统。CO2在提取室内以超临界状态与样品接触，达到饱和提取后，转入分离室，在脱离超临界状态的同时CO2与提取的物质分离，此后，CO2重新被转入超临界状态重复使用，如此反复提取与分离，直到提取与分离彻底完成。
由于CO2属非极性溶剂，对极性化合物的萃取具有一定的局限性，如果在CO2中加入少量NH3、甲醇、NO2等极性化合物可以改善这一局限性。与传统的萃取法比较，超临界CO2萃取技术具有快速、简便、选择性好、有机溶剂使用量少等优点。
固相微萃取技术兴起于大约十年前，它使用表面涂有选择性吸附高分子材料的熔硅纤维作提取器，可以将其直接插入样液，也可将其插入样品瓶的顶空，通过一段时间的扩散达到分配平衡（或表观平衡），然后将熔硅纤维直接插入气相色谱或液相色谱的进样器，在那里解析下萃取到的待测物进行分析。这种方法使用的装置构造相对复杂，吸附高分子材料的选择要根据萃取物的特性进行选择。
（二）有机物破坏法
分析测定食品中重金属和其他矿物质时，尤其是进行微量元素分析时，由于这些成分可能与食品中的蛋白质或有机酸牢固结合，严重干扰分析结果的精密度和准确性。破除这种干扰的常用方法就是在不损失矿物质的前提下破坏有机物质，将这些元素成分从有机物中游离出来。有机物破坏法被分为以下两类：
1.干法（又称灰化法）
将洗净的坩埚用掺有FeSO4的墨水编号后，于高温电炉中烘至恒重，冷却后将称量后的样品置于坩埚中，于普通电炉上小心炭化（除去水分和黑烟）。转入高温炉于500～600℃灰化，如不能灰化彻底，取出放冷后，加入少许硝酸或双氧水润湿残渣，小心蒸干后再转入高温炉灰化，直至灰化完全。取出冷却后用稀盐酸溶解，过滤后滤液供测定用。
干法的优点在于破坏彻底、操作简便、使用试剂少，适用于除砷、汞、锑、铅等以外的金属元素的测定。
2.湿法（又称消化法）
在酸性溶液中，利用强氧化剂使有机质分解的方法叫湿法。湿法的优点是使用的分解温度低于干法，因此减少了金属元素挥散损失的机会，应用范围较为广泛。
按使用氧化剂的不同，湿法又被分为以下几类。
（1）硫酸－硝酸法 在盛有样品的凯氏烧瓶中加数毫升浓硫酸，小心混匀后，先用小火使样品溶化，再加浓硫酸适量，渐渐加强火力，保持微沸状态。如在继续加热微沸的过程中发现瓶内溶液的颜色变深或无棕色气体时，说明硝酸已不足和样品已炭化，此时必须立即停止加热，待瓶温稍降后再补加数毫升硝酸，继续加热保持微沸，如此反复操作直至瓶内溶液变为无色或微黄色时，继续加热至冒出三氧化硫的白烟。自然冷却至常温后，加水20mL，煮沸除去残留在溶液中的硝酸和氮氧化物，直至再次冒出三氧化硫的白烟。冷却后将消解液小心加水稀释，转入容量瓶中，凯氏烧瓶须用水洗涤几遍，洗涤液一并倒入容量瓶，加水定容后供测定用。
（2）高氯酸－硝酸－硫酸法 基本同硫酸－硝酸法操作，不同点在于：中途反复加入的是硝酸和高氯酸（3∶1）的混合液。
（3）高氯酸（或双氧水）－硫酸法 在盛有样品的凯氏烧瓶中加浓硫酸适量，加热消化至淡棕色时放冷，加入数毫升高氯酸（或双氧水），再加热消化。如此反复操作直至消解完全时，冷却到室温，用水无损失地转移到容量瓶中，用水定容后供测试用。
（4）硝酸－高氯酸法 在盛有样品的凯氏烧瓶中加数毫升浓硝酸，小心加热至剧烈反应停止后，继续加热至干，适当冷却后加入20mL硝酸和高氯酸（1∶1）的混合液缓缓加热，继续反复补加硝酸和高氯酸混合液，直至瓶中有机物完全消解时，小心继续加热至干。加入适量稀盐酸溶解，用水无损失地转移到容量瓶中，定容后供测试用。
为了消除试剂中含有的微量矿质元素带来的误差，湿法要求作空白消解样。
3.微波消解法
微波消解法需要微波消解仪、硝酸、过氧化氢、氢氟酸、硼氢化钾（测砷时）、硫脲及抗坏血酸等。取样品0.4g左右，置于聚四氟乙烯消解罐中，含酒精的样品先放水浴驱赶酒精，加浓硝酸1.0mL，放置15min，加30%过氧化氢溶液0.1～0.5mL浸泡15min，加水至6～10mL，轻轻摇动。装妥消解装置，连接好温度、压力探头，并将其放入微解，反应结束后消解罐自然冷却。容器内指示压力＜45psi（1psi=6.895kPa），消解罐温度低于55℃时，从防爆膜处缓缓打开，释放剩余压力，取出温度、压力探头，依次打开各消解罐，将消解的样品溶液定容至10.00～25.00mL，待测。
（三）沉析
在食品质量与安全检验中，沉析分离技术是要经常用到的。通常用沉析法去除溶液中的蛋白质、多糖等杂质。促进蛋白质沉析的方法常有以下三种：
（1）盐析 在存有蛋白质的液体分散系中加入一定量氯化钠或硫酸胺，就会使蛋白质沉析下来。盐析中的加盐可以是粉状盐，也可以是饱和盐溶液。调节适当的pH和温度，可达到更好的盐析效果。
（2）有机溶剂沉析法 这种方法可用于蛋白质和多糖的沉析。在含有蛋白质和（或）多糖的液体分散系中加入一定量乙醇或丙酮等有机溶剂，减低介质的极性和介电常数，从而降低蛋白质和（或）多糖的溶解度，就会使蛋白质和（或）多糖沉析下来。由于向多水分散系中加入有机溶剂是放热反应，这种沉析要在低温下进行。
（3）等电点沉析 蛋白质的荷电状况与介质的pH密切相关，当pH达到蛋白质的等电点时，蛋白质就可能因失去电荷而沉析。
用沉析法直接分离被测样品有时很方便，例如，分析食品中的草酸，可先将其转为草酸钙沉析出来，这样可使它与其他还原性物质分开。
（四）层析
层析作为前处理手段用途广泛，目的包括样品的净化、同类物质的分级、被测组分的富集。样品组分随流动相进入层析床，在床内与固定相接触，经吸附、离子交换、分子筛或在两相分配平衡等作用，分别在床内不同位置展成条带，再经随后的洗脱作用先后脱离床体，经分别收集，待测组分就得到净化，不同类甚至同类不同种的物质就得到分离。如果待测物和杂质组分洗脱条件不同，可先反复给床体进样，并把杂质组分一次次洗脱，直到被测物在床体中达到一定含量，再一起洗脱下来，这样就达到了富集。
1.柱层析
柱层析所用的柱子是有下口阀门和一个多孔瓷板的玻璃管。常用的固定相是硅胶或氧化铝细粉，离子交换树脂、多糖凝胶和改性纤维素也被较广泛的应用。将固定相放在水溶液中分散后，一次性加入柱子，在打开柱子阀门的条件下让水慢慢流过瓷板外流，瓷板阻挡住向下运动的固定相逐渐就形成柱床，注意调整下水速度和及时关闭阀门，保证柱床中始终充满水，以防止柱床与空气直接接触使以后床体中有空气，因为床内有空气时进行层析，流动相会发生短路，组分所在的条带会畸形，严重影响层析分离效果。
床体形成后，样品被溶解在一定的溶液中后，小心加到柱床上方，打开阀门让样品液进入床体，然后分别以一定的展开液、洗脱液及其适当的流速先层析后洗脱，利用分步收集器收集不同洗脱时间的流出液，将被测组分所在的流出液合并，就可用于测定。
柱层析的效果受很多因素影响，主要因素包括：选定的固定相、选定的展开液和洗脱液的极性或其pH和离子强度、相对于样品量的柱径和柱长、装柱和进样的操作水平及洗脱的速率。
2.薄层层析
薄层层析是将固定相铺在玻璃板或塑胶板上形成薄层，让展开剂（流动相）带动着样品由板的一端向另一端扩散。在扩散中，由于样品中的物质在两相间的分配情况不同，经过多次差别分配达到分离的目的。
薄层层析操作简单、设备便宜、速度快、使用样品少，但重复性不是很好，有时清晰显迹有较大难度、定量分析误差较大。
薄层层析的固定相常用硅胶和氧化铝。硅胶略带酸性，适用于酸性和中性物质分离，氧化铝略带碱性，适用于碱性和中性物质分离。它们的吸附活性又都可用活化处理和掺入不同比例的硅藻土来调节，以适应不同样品中物质最佳分离所需的吸附活性。
薄层层析的分析用板一般用10cm×10cm板，制备用板一般用20cm×20cm板，铺板厚度一般都在1mm左右。可用刻度毛细管或微量注射器点样。样点的直径一般不大于2mm，点与点之间的距离一般为1.5～2cm，样点与板一端的距离一般为1～1.5cm。展开剂的用量一般以浸没板的这一端0.3～0.5cm较适宜。
薄层层析展开剂极性大时，样品中极性大的组分跑得快，极性小的组分跑得慢；展开剂极性小时，样品中极性小的组分跑得快，极性大的组分跑得慢。为了使样品中各组分更好分开，常采用复合展开剂。
薄层层析的显迹方法主要有物理法、化学法和薄层色谱扫描仪法。物理法中最常用紫外灯照射法，有荧光的样品组分在此条件下显迹。化学法中又有两类方法。一类是蒸气显迹，例如用碘蒸气熏层析板后，样品中的多数有机组分便显黄棕色。另一类是喷雾显迹，例如用三氯化铝溶液喷在层析板后，样品中的多数黄酮便显黄色。双光束薄层扫描仪显迹法既可用于显迹，又可直接用于定量。该仪器同时用两个波长和强度相等的光束扫描薄层，其中一个光束扫描样迹，另一个光束扫描临近的空白薄层。这样同时获得样迹的吸光度和空白的吸光度，二者之差就是样迹中样品组分的净吸光度。以标准物质作对照，根据保留因子和净吸光度进行定性和定量分析。
显迹后，可将待分析的迹点挖下，用于进一步定性和定量分析。
（五）透析
透析膜是一种半透膜，如玻璃纸、肠衣和人造的商品透析袋，它们只允许一定分子质量的小分子物质透过。选择适当膜孔的透析袋装入样品，扎紧袋口悬于盛有适当溶液的烧杯中，不定期地摇动烧杯以促进透析，待小分子物质达到扩散平衡后，将透析袋转入另一份同样的溶液中继续透析，如此反复透析多遍，直到小分子物质全部转移到透析液中，合并透析液后浓缩至适当体积，就可用来分析。
（六）蒸馏法
利用物质间不同的挥发性，通过蒸馏将它们分离是一种应用相当广泛的方法。在挥发酸的测定中就应用此方法。如果所处理的物质耐高温，可采用简单蒸馏或分馏的方法；如果所处理的物质不耐高温，可采用减压蒸馏或水蒸气蒸馏的方法。
（七）浓缩干燥
由于提取、层析等前处理过程引入了许多溶剂，可能会降低待测组分的浓度或不适宜直接进样，后续分析有可能需要将这些溶剂部分或全部去除，此过程为浓缩或干燥。为了防止脱溶时使用高温引起样品变质，可以采用旋转蒸发器减压蒸干或浓缩，可以采用冷冻干燥，样品较少时还可采用氮气吹干法。旋转蒸发集受热均匀、薄膜蒸发和减压蒸发于一体，效率高、温度较低、操作简单，不利之处是干燥后不易直接去除干样。因此特别适用于浓缩和干后又转溶时采用。冷冻干燥集低温、升华干燥和减压于一体，且干燥物易于直接取出，特别适用于易变质的样品和大分子样品。
（八）固相萃取法
固相萃取技术就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，使其与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。该技术基于液－固色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程，也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。与液液萃取等传统的分离富集方法相比，该技术具有高的回收率和富集倍数，使用的有机溶剂量很少，易于收集分析物组分，操作简便、快速，易于实现自动化等优点。利用该方法时应注意选择合适的柱体和固定相材料，并避免含有胶体或固体小颗粒的样品会不同程度地堵塞固定相的微孔结构。
（九）顶空技术
样品中痕量高挥发性物质的分析测定可直接使用顶空技术。顶空技术可分为静态顶空和动态顶空，它们具有操作简便、灵敏度高和可自动化的特点。静态顶空操作时只需将样品填充到顶空瓶中，再密封保存直至平衡，就可吸取顶空气体进行色谱分析或气相色谱/质谱联用分析；动态顶空一般是将氮气鼓入样品，使带出可挥发的待分析成分进入顶空气体捕集器，在此富集待分析成分后，再瞬间释放待分析成分到色谱进样器进行分析。
（十）衍生化技术
衍生化技术就是通过化学反应将样品中难于分析检测的目标化合物定量转化成另一易于分析检测的化合物，通过后者的分析检测对可疑目标化合物进行定性或定量分析。衍生化的目的有以下几点：①将一些不适合某种分析技术的化合物转化成可以用该技术的衍生物；②提高检测灵敏度；③改变化合物的性能，改善灵敏度；④有助于化合物结构的鉴定。