反流性疾病主要包括胃食管反流病（gastro-esophageal reflux disease，GERD）与咽喉反流（laryngopharyngeal reflux，LPR），是指胃内容物反流至食管、咽喉部，甚至气道、肺、口腔、鼻腔、中耳等部位，造成局部组织的破坏，引起一系列症状和体征的总称。GERD作为最常见的胃肠道疾病，在欧美国家其发病率为10%～20%，在我国为5%～10%；而LPR与50%以上的嗓音疾患有关；大量研究亦表明反流性疾病与慢性鼻-鼻窦炎、分泌型中耳炎等耳鼻喉科疾病密切相关。既往认为胃内容物中的胃酸（hydrochloric acid，HCL）是引起反流性疾病相关症状与体征的主要因素，越来越多的证据表明胃内容物中的胃蛋白酶在疾病的发生发展过程中起重要作用。

胃蛋白酶原（pepsinogen，PG）是胃蛋白酶的无活性前体，主要是由泌酸腺的胃壁主细胞合成和分泌的。应用电泳技术可分离出7种胃蛋白酶同工酶原，其中PG1～5免疫原性近似称之为胃蛋白酶原Ⅰ（PGI/PGA），由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；PG6～7被称为胃蛋白酶原Ⅱ（PGII/PGC），主要来源于全胃腺，占胃黏膜合成PG总量的25%，十二指肠上段的Brunner腺、前列腺和胰腺也产生少量PGIⅡ。PG大部分进入胃腔转化为有活性的胃蛋白酶，仅有1%PG通过胃黏膜毛细血管进入血液循环通过肾排出。

在胃酸的作用下或酸性环境中，PG分离出1个含有44位氨基酸的多肽后形成有活性的胃蛋白酶。已被激活的胃蛋白酶对PG也有激活作用，即自我激活。胃蛋白酶只有在酸性环境中才能发挥作用，最适pH为2.0～3.5，在37℃、最适pH环境中胃蛋白酶可保持稳定状态达24小时以上，超过24小时在自催化作用下发生降解。

胃蛋白酶不是单一的分子，而是由一些结构类似的同工酶家族组成。Bardhan指出应用高效阴离子交换色谱法（HPAEC）可将胃蛋白酶分为1、2、3、5亚型，胃蛋白酶3又可进一步分为3A、3B、3C，其中胃蛋白酶3B分子量最大、所占比重最大（70%）。每种同工酶都有各自的最适pH值。

Yufera及其同事运用血清放射性碘方法发现胃液胃蛋白酶在pH2.0环境中活性最大，在pH6.5时呈失活状态但保持稳定，当pH再次下降时其活性可恢复。Tasker发现人胃蛋白酶在pH≥7.8时开始发生变性，在pH6.0～8.0环境中胃蛋白酶虽无活性但仍保持完整的稳定状态，当pH降至6.0以下时可被重新激活。Johnston等利用胃蛋白酶3B探究胃蛋白酶在LPR模型中的活性及稳定性，结果发现当pH2.0时胃蛋白酶活性最大；pH1.5时其可保持最大活性的80%；pH6.0时其保持最大活性的10%；pH≥6.5时活性消失。在37℃、pH2.0～8.0溶液中胃蛋白酶可保持稳定状态达24小时以上，在pH6.8人咽喉部胃蛋白酶虽无活性但仍保持结构的完整性，当pH再次降至3.0时其活性可恢复68%～90%。

关于质子泵抑制剂（proton pump inhibitors，PPIs）对HCL分泌影响的研究报道比较多见，但有关PPIs对胃蛋白酶影响的报道则相对较少。一项研究将大剂量奥美拉唑（60mg，qd）应用于8例健康志愿者，连续使用9天后检测发现HCL的平均分泌量由5.4mmol/h降至0.3mmol/h，胃液平均分泌量由132ml/h降至36ml/h，而胃蛋白酶平均分泌量只有轻微下降，由126mg/h降至101mg/h。由于胃液分泌量显著减少，胃蛋白酶的浓度由90mg/100ml升高至290mg/100ml。另有学者采用不同于以往鼻胃管取样的方法，利用MRI（magnetic resonance imaging）检测技术发现PPIs仅能减少胃液分泌量的12%，胃蛋白酶浓度有轻微的升高。常规剂量的PPIs（如奥美拉唑20mg，每天一次）将胃液pH升高至6.0以上只能维持很短的时间，24小时的大部分时间内胃液pH处于4.0～5.0之间，在此时间内胃蛋白酶处于激活或失活的稳定状态。高剂量的PPIs或新一代PPIs抑酸效果更强，可使胃蛋白酶处于失活状态的时间更长，但是仍不能使胃液达到令胃蛋白酶变性的pH水平。

总之，PPIs对胃蛋白酶的分泌影响不显著，同时可导致胃蛋白酶浓度的升高。临床使用剂量的PPIs并不能胃蛋白酶发生变性。PPIs不能减少反流次数，富含更高浓度胃蛋白酶的反流液对食管外组织或器官更具有损伤性。这些研究发现为以后研究胃蛋白酶在反流性疾病中的应用价值提供理论基础。

目前研究报道胃蛋白酶可存在于反流性疾病患者的食管、咽喉部、气道、口腔、鼻腔、鼻窦、咽鼓管、中耳及泪液等部位。检测胃蛋白酶的技术主要有蛋白印迹（western blot）、免疫测定（immunoassay）。Peptest是已经商业化的体液或分泌液（如唾液/痰液）胃蛋白酶检测技术，由免疫测定技术改造而成，利用两种单克隆抗体进行体外检测，检测方便，几分钟内即出结果。

目前诊断GERD与LPR的“金”标准分别为食管24小时多通道腔内阻抗联合pH监测（multichannel intraluminal impedance，MII）、24小时双探针pH监测，但两者敏感度低、具创伤性，很多患者难以耐受以致不能完成。关于胃蛋白酶对GERD诊断价值的研究颇多。国内学者刘鹏采用蛋白印迹技术检测80例疑似GERD患者的唾液胃蛋白酶，样本采集时间分别为睡前、症状发作时与晨起时，并与食管24小时pH监测相比较，发现53.8%的患者胃蛋白酶阳性，健康对照组均为阴性。以24小时pH监测为“金”标准，唾液胃蛋白酶诊断GERD的敏感度和阴性预测值较为理想（89%，95%），特异性和阳性预测值欠佳（68%，44%）；同时发现症状发作时胃蛋白酶阳性率最高。毛华等采用乳胶增强免疫比浊法检测GERD、慢性胃炎患者及健康对照者晨起空腹时唾液PGⅠ、PGⅡ浓度，结果显示GERD组PGⅠ浓度高于慢性胃炎组及健康对照组，GerdQ表评分与PGⅠ浓度存在正相关（ r=0.466， P=0.014）；ROC分析显示，PGⅠ临界值取2.5μg/L时，胃蛋白酶诊断GERD的敏感度70.4%、特异度71.4%。类似的是，外国学者Saritas等通过检测58例疑似GERD患者与51例健康对照者唾液胃蛋白酶发现胃蛋白酶阳性率在两组之间未见统计学差异（22% vs.12%， P=0.25），但进一步分析发现经胃镜确诊反流性食管炎患者、经食管48小时pH监测诊断GERD患者及仅有GERD症状患者的胃蛋白酶阳性率均高于对照组（分别为55%、43%、24%、22%）；以胃镜或48小时pH监测为诊断标准，唾液胃蛋白酶检测诊断GERD的阳性预测值、阴性预测值分别为81%、78%，故作者认为胃蛋白酶检测对GERD具有良好的诊断价值。之后亦有研究显示唾液胃蛋白酶检测可作为诊断GERD的一种无创、简易、方便的新手段，其与反流症状问卷相结合可进一步提高诊断价值，有望取代目前具有创伤性的诊断工具（胃镜或pH监测）。

Starosta对96例慢性肺疾病患者进行肺泡灌洗液胃蛋白酶检测与食管24小时pH监测，结果发现68%（65/96）患儿食管近端酸反流指数增加；与食管近端酸反流阴性者相比，阳性者肺泡灌洗液胃蛋白酶浓度更高；同时发现肺泡灌洗液中中性粒细胞、蛋白羰基和白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）的水平与食管近端反流事件相关。据此作者提出GERD是儿童慢性肺疾病的重要因素，肺泡灌洗液胃蛋白酶检测可作用一种重要的诊断方法。Timms等采用ELISA检测技术发现同时患有GERD的阻塞性肺疾病患者呼出气体冷凝液中胃蛋白酶浓度高于不伴有GERD的患者及健康对照组，指出呼出气体冷凝液胃蛋白酶检测可用于筛选伴有GERD的阻塞性肺疾病患者。

Knight等采用免疫分析法检测疑似LPR患者喉部痰液胃蛋白酶，并与24小时pH监测相比较，发现胃蛋白酶阳性患者食管与咽部pH显著低于阴性者，胃蛋白酶检测显示出理想的诊断价值，敏感度、特异度分别为100%、89%。李湘平等通过检测56例长期患有咽喉部不适症状患者的深咳咽喉部唾液胃蛋白酶，以反流症状指数（RSI）量表、反流检查计分（RFS）量表和PPI诊断性试验三者联合诊断结果为诊断标准，发现LPR组胃蛋白酶浓度高于慢性咽喉炎组和健康对照组，胃蛋白酶诊断LPR的敏感度、特异度、漏诊率及误诊率分别为93.8%、46.2%、6.2%、53.8%。同时，中国学者Jiang等采用免疫组化染色技术检测经24小时MII-pH监测诊断为LPR患者勺状软骨间黏膜胃蛋白酶浓度，与对照组相比，LPR组胃蛋白酶阳性率高于对照组（80%vs.14.3%， P<0.01），胃蛋白酶检测诊断LPR的敏感度、特异度分别为100%、47.6%，表明喉黏膜胃蛋白酶检测是诊断LPR的敏感方法。另有研究发现LPR患者唾液胃蛋白酶、胆汁酸浓度显著高于健康对照组（ P=0.005， P=0.023），相关性分析发现LPR患者RSI、RFS与唾液胃蛋白酶、胆汁酸浓度相关，据此作者提出唾液胃蛋白酶结合胆汁酸检测可用于LPR的诊断，尤其是胆汁性LPR。随后Komastsu提出喉咽部胃蛋白酶联合应激蛋白Sep70检测可提高LPR诊断的敏感度。

通过LPR患儿气道分泌物与喉部黏膜胃蛋白酶检测分析Blumin等发现LPR是特发性声门下狭窄的重要发病机制。Gill通过分析LPR患者喉部组织细胞内胃蛋白酶、E-钙黏蛋白（E-cadherin）及碳酸酐酶Ⅲ（CAⅢ）的表达情况发现LPR患者喉黏膜上皮细胞胞内存在胃蛋白酶，而健康对照组不存在；LPR患者喉黏膜E-钙黏蛋白、CAⅢ表达降低或缺失。因此，作者认为LPR与胃蛋白酶表达、E-钙黏蛋白及CAⅢ的下调相关，E-钙黏蛋白、CAⅢ表达降低导致喉黏膜防御功能降低，而胃蛋白酶可消化分解喉组织细胞引起损伤。

近几年国内外学者通过胃蛋白酶检测对反流性疾病与慢性鼻-鼻窦炎及分泌性中耳炎的相关性进行了研究。Ozmen以咽喉pH监测为诊断标准，发现与对照组相比，慢性鼻窦炎患者存在更高的LPR发生率（88% vs.55%， P<0.05），提示LPR可能是慢性鼻窦炎发生的重要机制；以咽喉24小时pH监测为“金”标准，慢性鼻窦炎患者鼻腔灌洗液胃蛋白酶诊断LPR的敏感度、特异度分别高达100%、92.5%。

有趣的是Iannella等利用ELISA技术检测LPR患儿泪液胃蛋白酶，发现4例（4/20）患儿胃蛋白酶呈阳性表达，与健康对照组相比虽无统计学差别，但该研究提示LPR可能在泪管狭窄或鼻-鼻窦炎发病机制中起重要作用。

相继有中国学者对鼻腔分泌物胃蛋白酶检测对LPR的诊断价值进行了研究报道。金日群团队采用ELISA技术检测50例慢性鼻窦炎患者鼻腔分泌物胃蛋白酶，根据RSI量表、RFS量表及PPI试验三联诊断将患者分为LPR组和非LPR组，结果发现LPR组胃蛋白酶阳性率高于非LPR组及健康对照组，且胃蛋白酶检测诊断LPR的敏感度高于三联诊断法。之后该团队及胡全福等报道鼻腔分泌物胃蛋白酶检测与咽喉24小时pH监测及三联诊断法均具有较好的一致性，是一种无创的、可行的诊断LPR的方法。

O’Reilly等对509例分泌性中耳炎患儿进行研究，发现20%患儿中耳渗液中可检出胃蛋白酶，显著高于对照组（20% vs.1.4%， P<0.05），提示胃蛋白酶很有可能是分泌性中耳炎的病因之一。2015年该团队又报道分泌性中耳炎患儿中耳渗出液胃蛋白酶与IL-8相关，并指出食管外反流与中耳炎性病变密切相关，但具体机制需要进一步研究。

Tasker等采用ELISA技术检测分泌性中耳炎患儿中耳渗出液和血清胃蛋白酶及胃蛋白酶原浓度，证实中耳渗出液胃蛋白酶是反流所致，并非局部血液渗出所致，表明分泌性中耳炎与反流性疾病相关，这与Toros、Abdel研究结果一致。另外Abdel对纳入研究的患儿行咽喉pH监测，发现LPR并发率为71%（22/31），相关性分析发现中耳渗出液胃蛋白酶浓度与咽喉部反流次数呈正相关。以上研究发现提示LPR是分泌性中耳炎的一个致病因素，中耳渗出液胃蛋白酶测定可作为诊断分泌性中耳炎患者是否存在LPR的可靠指标。

正常人每天可发生数十次胃食管反流而不出现食管症状，而咽喉部每周出现3次反流就可造成咽喉黏膜的损害引起咽喉部症状，表明LPR与GERD发生机制不同。美国学者Johnston及其同事针对胃蛋白酶与LPR的相关性进行了大量的研究报道。首先Johnston通过蛋白印迹分析LPR患者喉黏膜上皮胃蛋白酶表达与应激蛋白（Sep70，Sep53，Hsp70）的相关性，发现与健康对照组相比，LPR组喉黏膜Sep70表达减少（ P=0.027），Sep53表达有减少趋势（ P=0.056），且喉黏膜上皮胃蛋白酶存在量与Sep70呈负相关。猪喉组织培养发现单纯HCL可导致Sep70和Sep53增高，加入胃蛋白酶后Sep70、Sep53减少或消失。利用动物体外模型Johnston发现激活状态的胃蛋白酶可致猪喉部组织CAⅢ、Sep70表达下调，而失活状态的胃蛋白酶、HCL则不能。继之Johnston利用人体外组织培养及毒性分析等技术发现失活状态的胃蛋白酶具有细胞毒性作用，可致线粒体、高尔基体等细胞器损伤，并可改变多种应激基因及毒性基因的表达。在上述研究发现的基础上，Johnston发现并证实滞留在咽喉部胃蛋白酶可通过受体介导的胞吞作用被摄入细胞内。因此，作者指出胃蛋白酶可被再次发生的酸性反流所激活，或被胞吞的胃蛋白酶在酸性介质（高尔基体pH5.5）中活性恢复，通过改变应激蛋白的表达引起应激反应等途径造成细胞破坏，在LPR发生发展过程中起重要作用。

Ylitalo及Bulmer等将胃蛋白酶和HCL暴露于体外培养的喉部组织，发现不同部位的喉黏膜对胃蛋白酶、HCL有不同程度的耐受性，其中声门下黏膜最为敏感，且胃蛋白酶与HCL对喉黏膜的损害具有协同作用。Bathoorn将人气道上皮细胞暴露于胃蛋白酶、HCL溶液中，通过分析细胞增殖和细胞因子表达发现胃蛋白酶对细胞的细胞毒性和炎性作用呈浓度依赖性和pH依赖性，即胃蛋白酶浓度越高、pH越低有害作用越显著。

Adhami等利用犬动物模型探究胃反流物（胃蛋白酶、HCL）与十二指肠反流物（胆汁酸、胰蛋白酶）分别对喉黏膜的有害作用，结果显示酸性反流中胃蛋白酶是造成喉部组织损伤的主要因素，十二指肠反流物并无显著的有害作用。另外Ali报道胆汁酸（包括结合胆汁酸与未结合胆汁酸）对胃蛋白酶活性无影响。而Devehoglu报道称胃蛋白酶、胆汁酸均可致中耳黏膜发生炎性反应和上皮化生改变，尤其胆汁酸作用最为明显。关于胆汁酸与反流性疾病相关性的研究报道较少，研究发现不尽一致，尚需进一步研究。

Heavner等将含有胃蛋白酶、HCL的溶液经鼓膜穿刺途径缓慢滴注至大鼠咽鼓管，连续进行28天后观察到大鼠咽鼓管功能发生改变，该动物模型实验进一步证实反流物可经鼻咽部、咽鼓管及鼻腔等部位导致或参与中耳、鼻泪管等疾病的发生发展。

气道分泌物或肺泡灌洗液中胃蛋白酶的检出为GERD相关性肺疾病提供直接证据。Savarino等研究发现特发性肺纤维化患者肺泡灌洗液与唾液胃蛋白酶、胆汁酸浓度均高于间质性肺疾病患者和健康对照组，同时24小时MII-pH监测发现特发性肺纤维化患者异常酸暴露比例也高于间质性肺疾病患者和健康对照组，提示特发性肺纤维化与误吸密切相关。Meert等通过分析机械通气患儿气道分泌物胃蛋白酶和葡萄糖，发现与葡萄糖相比，胃蛋白酶检测对诊断误吸具有更高的敏感度。之后有学者提出GERD误吸是患儿咳嗽的重要原因，并再次证实肺泡灌洗液胃蛋白酶检测可成为诊断GERD误吸的一种敏感而又特异性的手段。

能够应用于反流性疾病且以胃蛋白酶为靶点的药物研究少，临床疗效尚不明确。胃蛋白酶抑制剂（antipepsin），如硫酸支链淀粉（amylopectin sulphate）、抑胃酶素（pepstatin），对消化性溃疡疗效不显著，用于治疗反流性疾病尚无报道。海藻酸盐（alginates），一种从海带中提取的天然多糖碳水化合物，广泛应用于食品、医药、纺织、印染、造纸、日用化工等产品将近40年，近几年体外研究发现该药对反流物胃蛋白酶与胆汁酸有强大的作用。目前有两项研究报道了将海藻酸盐对LPR的临床疗效，其中一项来自英国的随机对照试验结果显示海藻酸盐可以显著改善LPR患者的RSI和RFS。另一项美国研究发现海藻酸盐可显著改善LPR患者的RSI、RFS及嗓音相关生活质量指数（a voice-related quality of life index）。

大量研究显示胃蛋白酶检测对GERD、LPR等反流性疾病的诊断价值具有较好的前景，但不同研究之间取样时机、检测方法及“金”标准的选择不尽相同，研究结果参差不齐，尚需进一步规范化；在治疗方面的价值尚无研究报道。同时食管外器官或组织胃蛋白酶的检出为反流性疾病与肺部疾病、耳鼻喉科疾病的相关性提供了直接证据或线索。

HCL、胃蛋白酶及胆汁酸的协同作用是造成食管病变与GERD症状（如反酸、胃灼热）的主要因素，其中HCL是关键因素，PPIs类药物可以取得显著疗效；而食管外反流（如LPR）的主要致病因素是胃蛋白酶，故PPIs类药物疗效欠佳，而目前少量的研究显示海藻酸盐对LPR具有可喜的疗效，但仍需大量的前瞻性研究予以证实。对上述观点的认同对于加深临床医师对反流性疾病发生机制的认识及新靶向药物的研发至关重要。

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