第一章　实时定量PCR基本原理

传统的聚合酶链式反应（PCR）是指利用上下游引物对特定的核苷酸片段进行指数级的扩增。扩增结束后通过凝胶电泳的方法观察条带的大小可以判断是否存在目的片段，或者通过光密度扫描的方法来定量分析PCR产物。不过这样分析的都是PCR终产物，由于PCR扩增最终均进入平台期，因此PCR终产物的含量并不能代表起始模板量。实时定量PCR（RQPCR）技术始于1996年。与传统的PCR技术相比，RQ-PCR体系中除了上下游引物之外加入了荧光探针或染料，通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现真正的对起始模板的定量。RQ-PCR技术具有以下优势：①对相当宽泛的浓度范围内的模板分子均可以实现真正意义的定量；②探针的加入或熔解曲线的制作使得扩增的特异性更强，灵敏度更高；③扩增过程中闭管操作，实时收集数据，降低了污染机会，减少假阳性结果的出现；④无需PCR后的电泳过程，使操作时间缩短；⑤能够通过内参基因的定量评价样本的质量，减少假阴性结果的发生；⑥实现自动化，可以进行高通量分析。

在RQ-PCR技术的发展过程中，两个重要的发现起了关键的作用：①在90年代早期，Taq DNA聚合酶的5′外切酶活性被发现，它能够降解与模板特异性结合的荧光标记探针，使得间接检测PCR产物成为可能。②荧光双标记探针的运用使得在一个密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现以及相应的仪器和试剂的商品化发展实现了RQ-PCR的最终应用。PCR反应过程先是指数增长期，随着反应循环数的增加，逐渐进入平台期。在RQPCR的整个反应扩增过程是实时监测并连续分析扩增相关的荧光信号，监测到的荧光信号的变化绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别即所谓荧光背景信号阶段，而后荧光的产生进入指数期，此阶段PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，随后先后进入线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上（CT值）来检测PCR产物的量，并由此来推断模板最初的含量。

目前RQ-PCR所使用的荧光化学方法包括DNA结合染色、水解探针、分子信标、荧光标记引物和杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子，如SYBR green 1等荧光染料。在PCR反应体系中，加入的过量SYBR green 1荧光染料能够特异性地掺入DNA并发射荧光信号。荧光染料的优点在于简便，因为它可以检测任何双链DNA序列的扩增，而不需要设计特异性探针，这样同时也降低了检测的成本。缺点在于由于不识别序列而仅仅是与双链DNA结合，因此它的特异性差，容易产生假阳性信号，包括引物二聚体也能产生扩增曲线，不过通过扩增之后继续进行熔解曲线（melting curve）的过程，根据熔解温度有助于排除这种影响，因为熔解温度取决于序列的长度和组成。

扩增序列特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，例如目前RQ-PCR中应用最广泛的TaqMan探针。TaqMan探针是一条寡核苷酸，5′端和3′端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，这时5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给邻近的3′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET），因此在探针完整时，检测不到荧光。但在PCR扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与特异性的模板结合。在引物的介导下，Taq酶自模板5′端向3′端延伸，至探针与模板结合处时，发挥其5′-3′外切酶活性将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激而发出荧光信号。这样每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积完全反映了PCR产物的产生量。

MGB探针是美国Applied Biosystems公司开发的另一种TaqMan探针。它与常规TaqMan探针相比，一是探针3′端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，以取代常规可发光淬灭分子—TAMRA，这就使荧光本底降低，荧光光谱分辨率得以大大改善。另外探针3′端结合了MGB（minor groove binder）结合物，使得探针的Tm值提高，大大增加了探针的杂交稳定性，使结果更精确，分辨率更高。正是由于它的高分辨性，目前TaqMan MGB探针主要应用于等位基因的区分，甚至能够检测到仅有单个核苷酸差异的等位基因的表达水平。此外，由于MGB探针短于TaqMan探针，所以当适合用于设计探针位置的核苷酸序列较短时可以设计为MGB探针。