匹多莫德原料药中二氯甲烷残留量检测的中空纤维膜液相微萃取技术研究
赵健1*，常健1，王尹2
（1．辽宁省标准化体系建设工程技术研究中心辽宁省分析科学研究院，沈阳 110015；
2．锦州华光电子管有限公司，锦州 121001）
匹多莫德（pidotimod）是一种新型的化学合成免疫调节剂，可以促进机体的特异和非特异免疫反应，主要用于小儿反复呼吸道和泌尿系统感染、慢性支气管炎急性发作及肿瘤患者伴发感染的治疗和预防。与传统的免疫调节剂相比，匹多莫德具有安全、使用方便和耐受性好的优点。本方法采用中空纤维膜液相微萃取技术，对匹多莫德原料药在化学合成过程中二氯甲烷残留量进行检测，通过大量实验总结出一套可行的创新方法，并可以应用于2010年版《中国药典》二部附录E中规定的有机溶剂残留量进行检测。
单滴液相微萃取（Single Drop Microextraction，SDME）是近年来新发展起来的萃取技术[1-3]，一些实验已将它成功应用于水相标本中有机物的萃取。单滴液相微萃取（Single Drop Micr oextraction，SDME）是基于传统的液液萃取技术，但它只需要几微升有机溶剂为萃取剂。在该萃取系统中，有机溶剂微液滴（作为萃取剂）悬挂在普通微量注射器的针尖上，浸入到水性标本中进行萃取。尽管单液滴相微萃取技术简单、廉价、快速，但是它存在微液滴稳定性差、方法灵敏度低的问题。为了解决这些问题，有人使用多孔的聚丙烯中空纤维膜来保护有机溶剂微液滴，将水相和有机溶剂分隔开，避免了两厢直接混合，水中的待萃取物通过中空纤维膜空壁的微孔进入到有机溶剂中而实现萃取，它是液液萃取的微型化。中空纤维膜液相微萃取技术是单滴液相微萃取的发展，因为纤维膜结构把有机溶剂保护起来。中空纤维膜微萃取技术以其高校、简单、快速、低价、避免残留和交叉污染等优点，并可与气相色谱（GC）、毛细管电泳（EC）和高效液相色谱（HPLC）联用，是传统液液萃取方法的有力补充。同时，它集萃取、富集、进样与一步完成，使样品前处理更加快速、有效，从而加快样品分析速度。中空纤维膜液相微萃取技术在水性标本中有机物的萃取上有广阔的发展前景，在药物分析、毒物分析、水和土壤中杀虫剂的残留等领域都有广泛的应用。
1 仪器与试剂
（1）环境条件 温度20℃，相对湿度50%RH。
（2）仪器条件 Agilent7890A气相色谱仪（FID检测器），配有顶空瓶；AE-240电子天平；温控磁力搅拌器。
（3）色谱条件 色谱柱：HP-INNOWAX（30m×0.53mm×1.0μm）；氢火焰离子检测器（FID），检测器温度300℃，进样口温度200℃，柱温50℃。载气：N2；载气流速：3.5ml/min；最小峰面积：500；进样量1.0μl：理论塔板数按二氯甲烷峰计算应不低于1000。
（4）试剂 所用试剂均为分析纯。试验用水为电阻率为18.5MΩ·cm（25℃）的超纯水。中空纤维膜购自天津膜天膜科技有限公司，属于聚偏氟乙烯（PVDF）新材料，纤维内径/外径：0.6mm/1.3mm，膜壁平均孔径为0.2μm。
2 测定方法
2.1 对照品溶液的制备
精密称取色谱纯二氯甲烷60mg，置100ml容量瓶中，用不含有机杂质的二次水稀释至刻度，超声混匀；精密量取10ml置100ml量瓶中，用二次水二次稀释至刻度，超声混匀，即得即得储备液，浓度为60μg/ml；精密量取1.0ml置100ml量瓶中，用二次水稀释至刻度，超声混匀，即得对照品溶液，浓度为0.6μg/ml。储备于4℃冰箱中备用。
2.2 供试品溶液的制备
精密称取匹多莫德原料药0.1g置100ml容量瓶中，用不含有机杂质的二次水稀释至刻度，超声混匀，储备于4℃冰箱中备用。
2.3 萃取步骤
2.3.1 LPME-HFM萃取装置的制备
自制的LPME-HFM萃取装置是由微量进样器和中空纤维膜两部分组成。取2.0cm长度的纤维膜，在异辛烷中超声清洗1min以除去膜上污物，在自然条件下晾干，放入干净的玻璃瓶中保存。用微量注射器抽入6μl萃取液，将一段中空纤维膜的一端套在注射器针尖上，然后把萃取溶剂缓慢注入，注入完毕后，另一端热封口。萃取结束后剪开中空纤维膜封口端，抽取1μl萃取液直接进入GC分析。
2.3.2 供试品溶液二氯甲烷的萃取
精密吸取供试品溶液30ml置于30ml顶空瓶（安捷伦生产），在小瓶中放入磁性转子，插入LPME-HFM萃取装置，于室温下在磁力搅拌器上搅拌20min。萃取结束后剪开中空纤维膜封口端，抽取1μl萃取液直接进入GC分析。
2.3.3 对照品溶液二氯甲烷的萃取
精密吸取对照品溶液30ml置于30ml顶空瓶（安捷伦生产），在小瓶中放入磁性转子，插入LPME-HFM萃取装置，于室温下在磁力搅拌器上搅拌20min。萃取结束后剪开中空纤维膜封口端，抽取1μl萃取液直接进入GC分析。
3 萃取条件的优化
3.1 搅拌速度选择
增加溶液的搅拌速度，能缩短达到热力学平衡所需的时间。但超过一定速度，会产生气泡并增加萃取剂的损失[4]，使实验结果受到影响，因此，我们选择600r/min的搅拌速度。
3.2 萃取溶剂选择
萃取剂的选择本着“相似相溶”的原则，在中空纤维膜中理想的萃取剂应该是与纤维相容，在纤维壁中稳定存在，不溶于水，并且在萃取时间内保持足够的稳定[4]。我们选择环己烷、正辛醇、甲苯、二甲苯四种溶剂。在可待因浓度为5μg/ml、加入4ml饱和硼酸钠溶液、搅拌速度600r/min、萃取时间20min的特定条件下，考察萃取溶剂种类的结果如图1所示。其中，甲苯的萃取效率最高，依次为二甲苯、环己烷、正辛醇，因此本实验选取甲苯作为萃取溶剂。
图1 环己烷、1-辛醇、二甲苯和甲苯的萃取效果
3.3 萃取时间选择
在二氯甲烷浓度为0.6μg/ml，搅拌速度600r/min，以甲苯为萃取溶剂的条件下，分别搅拌15min、20min、25min、30min、45min。如图2所示，二氯甲烷的萃取效率随时间的增加而增加，30min后开始下降。有文献报道，而且随着时间的增加，萃取剂的损失也增加[4,5]，因此，我们从省时和萃取效率综合考虑，选择20min作为萃取时间。
图2 萃取效果和萃取时间的相关性
3.4 离子强度选择
分别考察0g/L、50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、360g/L NaCl溶液浓度下离子强度对萃取效果的影响。四氯化碳浓度为50μg/L，搅拌速率600r/min，以甲苯为萃取溶剂，萃取时间20min。最初萃取效率随盐浓度的增加而增加，NaCl溶液浓度在200g/ml时达到最大值，360g/L时萃取量反而下降[6,7]。因此，试验选择NaCl溶液浓度为200g/L。
图3 萃取效果与离子强度的相关性
图4 萃取效果与pH值的相关性
3.5 酸碱性
分别考察了pH值在9.5、11.5、12.5、13.5时对萃取效果的影响。四氯化碳质量浓度为50μg/L，搅拌速率600r/min，以甲苯为萃取溶剂，搅拌萃取20min。四氯化碳的萃取效率在pH值为11.5时最高，之后萃取效率随pH值升高而降低。因此，试验选择pH值为11.5。
4 结果
4.1 二氯甲烷色谱分离
图5是二氯甲烷对照品的色谱图，色谱峰附近没有杂质干扰。
图5 二氯甲烷对照品的色谱图
4.2 系统适用性试验
精密吸取供试品溶液二氯甲烷浓度为0.6μg/ml置于30ml顶空瓶，在小瓶中放入磁性转子，插入LPME-HFM萃取装置，于室温下在磁力搅拌器上搅拌20min。萃取结束后剪开中空纤维膜封口端，抽取1μl萃取液直接进入GC分析，进行系统适用性考查。由色谱图得到表1数据。
表1 系统适用性
4.3 精密度试验
精密吸取供试品溶液二氯甲烷浓度为0.6μg/ml置于30ml顶空瓶，在小瓶中放入磁性转子，插入LPME-HFM萃取装置，于室温下在磁力搅拌器上搅拌20min。萃取结束后剪开中空纤维膜封口端，抽取1μl萃取液直接进入GC分析，连续5次进样，考查仪器精密度。由色谱图得到表2数据。
表2 仪器精密度表
4.4 线性关系和检出限试验
称取二氯甲烷储备液适量，见表 3，按照对照品配制方法得到相对应浓度的标准溶液，分别进行萃取，记录色谱图，得出二氯甲烷线性回归方程：y = 13835x − 29957，R = 0.9885，方法的检出限（3S/N）为0.2μg/L。
表3 各组分线性标准溶液配制
4.5 稳定性试验
精密吸取供试品溶液30ml，按上述色谱条件，每隔1h进样一次，结果供试品溶液中二氯甲烷在5h内无明显变化，相对标准偏差RSD = 3.05%。
4.6 重现性试验
取批号150901样品6份，按供试品溶液的制备和上述色谱条件进行测定，测得二氯甲烷的平均含量为0.092%，RSD = 3.01%。
4.7 回收率试验
取已知含量的匹多莫德原料药，批号为150901，按2.2项下方法制备供试品溶液和测定，结果平均相对回收率为98.54%，RSD = 2.64%，n = 5。
4.8 样品测定
取150901、150902、150903三批匹多莫德原料药，按上述测定方法进行测定，结果见表4。
表4 三批匹多莫德原料药中二氯甲烷残留量
5 结论
中空纤维膜液相微萃取（LPME-HEM）是近年来发展的先进的样品前处理技术，它的优点是高效、简单、快速、低价、避免残留和交叉污染等，本实验中使用的中空纤维膜是一种聚偏氟乙烯的材料，它具有化学稳定性好、物理强度高、耐酸碱、抗氧化、抗污染、膜通透量高的特点。中空纤维膜萃取可与气相色谱、毛细管电泳和高效液相色谱联用，是传统液-液萃取的有力补充。
本文采用气相色谱的方法结合中空纤维膜液相微萃取前处理技术测定匹多莫德原料药中二氯甲烷残留量，该方法简单、灵敏，结果显示了良好的选择性、线性和重现性。因此该方法也可以用于原料药及药物中有机溶剂残留量的测定，为药物分析检测方法提供了新尝试。
参考文献
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[5] Lambropulou DA, Konstantinou LK, Albanis TA. Chromatogr A, 2000, 893(2): 143-156.
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[7] Peng JF, Liu JF, Jiang GB, et al. Chromatogr A, 2005, 1072(1): 3-6.
*通信作者：赵健，男，助理研究员，主要从事食品、药品、化妆品等的检测与研究。E-mail：65758802@qq.com