第二节　质谱技术在甲基丙二酸血症诊断中的应用

一、甲基丙二酸血症简介

甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia，MMA）是一种常见的有机酸血症，属于常染色体隐性遗传病，主要是由于甲基丙二酰辅酶A变位酶（methyl malonyl coenzyme A mutase，MCM）或其辅酶钴胺素（coenzyme cobalamin）代谢缺陷所致。甲基丙二酸是异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、胆固醇和奇数链脂肪酸分解代谢途径中甲基丙二酰辅酶A的代谢产物。正常情况下在MCM和维生素B12的作用下转化生成琥珀酸，参与三羧酸循环。MCM缺陷或维生素B12代谢障碍导致甲基丙二酸、丙酸、甲基枸橼酸等代谢物异常蓄积，从而引起神经、肝脏、肾脏、骨髓等多脏器损伤。钴酰胺（cobalamide，Cbl）和甲基钴胺素（methyl cobalamin，MeCbl）是甲基丙二酰辅酶A（methyl malonyl coenzyme A，CoA）线粒体异构化成为琥珀酰辅酶A和同型半胱氨酸的胞质甲基化成蛋氨酸的过程中的重要辅酶，缺乏这两种辅酶会导致甲基丙二酰辅酶、变位酶和蛋氨酸合成酶的活性减小，血浆和尿液中的甲基丙二酸和同型半胱氨酸浓度增加、蛋氨酸浓度降低。

二、目前临床诊断甲基丙二酸血症的方法

（一）临床诊断

甲基丙二酸血症患儿的临床表现各异，往往容易误诊，最常见的症状是反复呕吐、嗜睡、惊厥、运动障碍、智力及肌张力低下。根据维生素B12负荷试验，即连续3天肌内注射维生素B12，若症状好转、生化异常改善，则为维生素B12有效型，无改善则为无效型。维生素B12无效型是MMA新生儿期发病最常见的类型，多由变位酶缺陷引起。出生时可能是正常的，但会迅速发展为嗜睡、呕吐并伴有脱水，出现代谢性酸中毒、呼吸困难、肌张力低下等。此外，也有一些无症状的“良性”甲基丙二酸血症患者，尿中的甲基丙二酸排泄量轻度增加，但其一级临床表现还有待于进一步的研究。

（二）实验室诊断

1.实验

可见代谢性酸中毒、乳酸增加、电解质紊乱，白细胞、血红蛋白及血小板减少，血糖降低、血氨升高，尿酮体及尿酸升高，肝肾功能异常等。

2.酶学分析

可通过对成纤维细胞、外周血淋巴细胞或肝组织成纤维细胞的酶活性检测及互补试验等分析确定MMA酶缺陷类型。

3.基因检测

基因突变分析是MMA分型最可靠的依据。其中MCM编码基因为MUT，定位于6p21.1；cblA基因被定义为MMAA，位于4q31.1～q31.2；cblB基因定义为MMAB，定位于12q24；cblC编码基因命名为MMACHC，位于1p34.1。通过对以上几种类型的基因突变的检测，可以明确分型。

4.其他

辅助诊断方法包括影像学检查、病历活检、脑电图和产前诊断。

三、质谱技术在甲基丙二酸血症诊断中的应用

以往有机酸血症的诊断多依赖生化与分子生物学方法，随着人类疾病谱的改变和对天生性缺陷病的重视，串联质谱技术得到了迅速发展。该技术可高效、快速地分析干血滤纸片上的氨基酸谱和酰基肉碱谱，为临床诊断提供重要的技术支持，提高了遗传性代谢病筛查和检验的准确性。

通过气相色谱-质谱检测尿、血、脑脊液中的有机酸和串联质谱检测血中的C3含量是确诊本症的首选方法。MMA患儿尿液中的甲基丙二酸、甲基枸橼酸和3-羟基丙酸会显著增加，血液中的C3、C3/C0和C3/C2会升高。在单纯的甲基丙二酸血症患儿中，血液中的甲基丙二酸浓度为220～2900mmol/L（正常值<0.2mmol/L）。部分患儿的脑脊液中可检测到与血浆中等量的甲基丙二酸。在甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症的患儿中，显示血清和尿液中的同型半胱氨酸浓度增高，可与单纯甲基丙二酸血症患儿进行区别。

实例：

串联质谱技术在甲基丙二酸血症诊断中的初步应用

样品来源：

所有样品均来自于临床遗传性代谢病患儿，年龄为2天～14岁，共162例。

实验仪器：

API2000型串联质谱仪购自美国生物应用系统公司（Applied Biosystems），高效液相仪采用美国安捷伦公司（Agilent 1100）的产品，GC-MS分析为安捷伦5890/5973N型，96孔板加热吹干装置为Techne Dri-Block DB-30。

色谱及质谱条件：

（1）GC-MS：

GC-MS配备 7673型自动进样器，HP-5毛细管色谱柱，柱长 30m，直径0.32mm，膜厚0.25μm，无分流式进样，进样口温度250℃。氦气为载气（1ml/min），界面温度250℃。质谱检测采用电子离解模式总离子扫描方式（EI 70eV），质荷比（m/z）范围50～600，扫描周期0.4秒。色谱柱箱程序升温从60℃开始，20℃/min升温至90℃后停留4分钟，然后以8℃/min升温至300℃，样本分析时间为30分钟。

（2）LC-MS：

LC-MS分析的流动相采用80%乙腈，四元泵的流速设置为3μl/min，自动进样器设置为每次进样20μl。每次测定采用3种扫描方式进行检测。中性氨基酸采用中性丢失扫描方式（neutralloss scan），中性丢失片段的质荷比（m/z）为102，扫描范围为m/z 140～280，子离子为 m/z 85片段，扫描范围为 m/z 210～502；甘氨酸（glycine，Gly）、鸟氨酸（ornithine，Orn）、精氨酸（arginine，Arg）、瓜氨酸（citrulline，Cit）采用多反应监测（multiple reaction monitor，MRM），一个样品的测试时间约为2分钟。

样品前处理方法：

（1）GC-MS分析：

干燥滤纸尿样用小于2ml的去离子双蒸水分次离心洗脱测定肌酐含量。取相当于2.5μmol肌酐的原尿，洗脱尿样，加入50μg内标十五烷酸和2-酮己酸，与100μl盐酸羟胺、200μl0.25mol/L硫酸、500μl饱和氯化铵混合45分钟以完成α-酮酸的肟化反应，然后分别用3ml乙酸乙酯和乙醚两次萃取，合并有机溶剂相，并用无水硫酸钠去除残余水分，加入外标C24，用纯净氮气吹干后，加入100μl甲基硅烷化衍生剂，置于干燥加热器上60℃衍生60分钟，冷却后用正己烷稀释至500μl。取1μl上样，进行GC-MS分析。

（2）LC-MS分析：

将干血滤纸片用打孔器制成直径3mm的圆形滤纸血片（相当于3.2μl全血），置于96孔过滤板中，每孔加入含氨基酸和酰基肉碱同位素内标的无水甲醇100μl，室温放置20分钟，萃取血片中的氨基酸和酰基肉碱，然后离心至另一个96孔聚丙烯板中，50℃加热吹干，再加入60μl盐酸-正丁醇，用Teflon膜覆盖后置于65℃恒温箱内15分钟，50℃加热吹干，再加入80%乙腈100μl溶解，铝膜覆盖，即可上样检测。

数据处理：

定量分析采用软件ChemoView 1.2版本（美国生物应用系统公司），根据同位素内标和各种丁酯化的氨基酸与酰基肉碱的离子峰强度，自动计算出所测样品中氨基酸和酰基肉碱的浓度。

结果分析：

MMA患者与对照组的SIM色谱图如图2-2所示，儿童尿液气相色谱-质谱及血串联质谱检测结果见表2-2。MMA患者组尿中的甲基丙二酸、甲基枸橼酸水平及血中的C3、C3/C2水平均超出正常参考值上限，且显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01）。162例患者的尿甲基丙二酸水平均高于正常参考值上限，145例患者的尿甲基枸橼酸水平超出正常参考值范围。MMA组患者血液中的C0、C2、Met水平虽低于对照组（P<0.01，表2-2），但仍处于参考值范围内。162例MMA患者中15例血液中的C3水平正常，而C3/C2高于参考值上限及对照组，差异有统计学意义（Z=6.455，P<0.01）；气相色谱-质谱检测尿甲基丙二酸及甲基枸橼酸水平显著增高，与对照组相比差异均有统计学意义（分别为Z=8.533和5.896，P<0.01），经基因检测确诊。