第三节　质谱技术在丙酸血症诊断中的应用

一、丙酸血症简介

丙酸血症（propionic acidemia，PA）是一种较常见的支链氨基酸和偶数链脂肪酸代谢异常的有机酸血症，为常染色体隐性遗传病，原因是丙酰CoA酶羧化酶（propionyl-coenzyme A carboxylase，PCC）活性缺乏，导致体内的丙酸及其代谢产物异常蓄积而出现的一系列生化异常、神经系统和其他脏器损害的症状。PA的临床表现个体差异大，多数患儿在出生1个月内起病，临床表现为喂养困难、反复呕吐、嗜睡等。随着串联质谱和气相色谱-质谱技术的应用，越来越多的PA患儿得到诊断和早期治疗。

二、目前临床诊断丙酸血症的方法

由于PA的临床表现缺乏特异性，临床误诊率高，因此对于原因不明、反复发生呕吐、惊厥、难以纠正的酸中毒、昏迷和发育落后，尤其有类似家族史者应考虑到本病。应对患儿及早进行血尿常规、血气分析、血氨、血乳酸、血糖和心肌酶谱等一般生化检查，并尽快留取血滤纸片进行串联质谱酰基肉碱分析，留取尿液进行气相色谱-质谱有机酸分析。

1.特殊生化诊断

患者的串联质谱检测结果显示血样中的丙酰肉碱、丙酰肉碱与游离肉碱比值、丙酰肉碱与乙酰肉碱比值及甘氨酸水平均增高；若气相色谱-质谱检测结果显示尿样中有大量的甲基枸橼酸、3-羟基丙酸和丙酰甘氨酸时，即可诊断为丙酸血症。

2.基因诊断

随着丙酸血症分子遗传学的研究进展，快速的基因诊断和进一步的产前诊断已成为可能。丙酰CoA酶羧化酶为α和β亚单位组成十二聚体，编码基因分别为PCCA和PCCB，PCCA突变位点主要集中在外显子13、12、19和18，PCCB突变位点多发生于外显子 12、15、11 和 6。

3.产前诊断

测定培养的羊水细胞、绒毛膜组织酶活性、突变基因，或羊水中甲基枸橼酸的水平可直接进行产前诊断。对未受损的绒毛膜细胞或培养的羊水细胞进行酶活性和基因突变分析，在7～10天可得到结果，该产前诊断方法快速可靠。当胎儿丙酰CoA活性缺乏时，羊水中的甲基枸橼酸水平为正常水平的20～30倍。

三、质谱技术在丙酸血症诊断中的应用

PA早期或晚期发病可引起严重的永久性的神经损伤，神经损伤的程度与高血氨的水平相关。尿液气相色谱-质谱和质谱可以进行明确的诊断。

实例：

气相色谱-质谱仪检测丙酸血症

样品来源：

样品为来自于248例临床患者病理状态下的尿液，另外再取对照组250例，患儿的年龄为1～10天。

实验仪器：

岛津QP-5000 GC/MS仪，分析毛细管柱（30m×0.25mm，J&Wfused silica）。

色谱条件：

应用安捷伦5890/5973N型GC-MS进行样本分析，质谱检测采用电子离解模式总离子扫描方式（EI 70eV），质荷比（m/z）范围为50～600，扫描周期为0.4秒。分析毛细管柱的温度从125℃开始，以16℃/min升温到325℃。

样品前处理方法：

取病理状态下的患者尿液0.1ml加尿素酶1mg，温浴除去尿素，然后加入0.9ml乙醇，混合，离心除掉蛋白。取上清液蒸发，再经氮气完全吹干。最后按10∶1的比例加入0.1ml N-O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide（BSTFA）和trimethylchlorosilane（TMCS），在80℃30分钟条件下萃取后，取60μl装瓶进行GC/MS检测。

结果分析：

健康志愿者与患者尿液的色谱图如图2-3所示。丙酸血症发作时尿中出现大量3-羟丙酸、甲基枸橼酸、甘氨酸，尿中的乳酸含量也会增高。患者筛查结果（表2-3）显示还可出现微量的异常代谢产物，如3-羟基-3-甲基-3-戊二酸、2-甲基-丁酰甘氨酸、2-甲基-乙酰乙酸、2-甲基-3-羟丁酸、2-甲基-戊烯二酸、2-羟基-2-甲基-丁二酸、3-甲基-己二酸和戊二酸。尿中的3-羟丙酸和甲基枸橼酸在发作期和缓解期均可检出，这是本病化学诊断的最主要的指标。丙酸血症和甲基丙二酸血症患者的临床表现相似，且尿中均可测出甲基枸橼酸，鉴别诊断时必须注意，后者尿中还可检出甲基丙二酸。