第三章　免疫测定标记物

免疫测定是将抗体作为一种特殊的分析试剂，利用其能够特异结合抗原的特点，实现对待测物质的检测。传统免疫分析方法，如免疫比浊和免疫凝集试验等，可检测到样品中μg/ml至ng/ml含量的物质。但如果需要检测超微量变化的物质，则需要引入能够增强检测信号的标记分子，通过标记试剂的放大作用来提高检测方法的灵敏度。

放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是经典的免疫标记定量分析技术，具有完整的方法学体系和优良的检测性能，在科研和临床上至今仍被广泛应用。20世纪70年代末至80年代初，非放射性核素标记的免疫分析技术取得了迅速发展，主要归功于标记物制备方法的不断改进和新型标记材料的出现。本章主要介绍化学标记物制备方法，即通过化学手段将一种分子共价偶联到另一种分子上。化学标记的目的是使被标记物在保持自身性质（免疫活性）的基础上兼有标记物的某些性质（如发光特性）。

人工抗原制备技术可将小分子化合物（半抗原）与蛋白质载体大分子进行共价结合，其中的一些方法已证明很适合用于金属螯合剂、荧光剂和化学发光剂等小分子化合物与抗体或抗原的偶联。随着纳米颗粒、量子点等新材料在免疫测定领域中的广泛应用，蛋白质与固相载体表面的包被技术也取得了进步。通过化学方法先在固相载体表面包被一层具有众多功能基团的大分子，形成水凝胶体系，改善固相载体表面的刚性和疏水性，再与抗体或链霉亲合素等生物分子相结合，得到功能化的载体颗粒。这种包被方式既可保留传统共价结合法的优点，又可使生物分子具有高的活性和很强的实用性。这些技术的进步均为标记免疫测定技术提供了强有力的支撑。

放射性核素是指不稳定的原子核，能自发地放出射线（如α射线、β射线等），通过衰变形成稳定的核素。衰变时放出的能量称为衰变能。最常见的衰变有α衰变、β衰变、γ衰变。在放射免疫分析中，常用于标记抗体和抗原的放射性核素有 ³H、 ¹²⁵I。所有的有机化合物均含有氢，用 ³H来置换氢，不会改变原有化合物的结构和免疫学活性，特异性好。 ³H的半衰期长，标记化合物的保质期比较理想。 ³H标记的不足之处是标记操作比较繁琐，一般需由专门机构来承担，不易推广；难以获得高比放射性的标记物，进而限制了检测方法的灵敏度； ³H放出的是弱β射线，需要用较昂贵的液体闪烁计数器才能进行测量。因此，除非已有现成的 ³H标记物，否则不宜作为建立放射免疫检测方法的首选。

相比较而言， ¹²⁵I标记有较多的优点：一是 ¹²⁵I半衰期为60天，在标记物储存及废液处理方面都比较适宜；二是它只发射低能量的γ和X射线，而无β粒子，因而标记物辐射自分解少，有足够的稳定性，用一般晶体闪烁计数器就能进行精确的测量；三是含有酪氨酸、酪氨残基或组氨残基的蛋白质和多肽，以及小分子的甾类化合物、核苷酸等物质均可用 ¹²⁵I标记，操作简单，数小时就可完成标记和纯化，而且成本低廉，一般实验室都易做到。所以目前在放射免疫分析中，使用 ¹²⁵I标记物最多。

抗原和抗体的 ¹²⁵I标记可分为直接标记法和间接标记法两类。直接标记法是采用化学氧化反应直接将 ¹²⁵I结合于待标记物分子的酪氨酸、酪氨残基或组氨残基上。此法较多应用于大分子蛋白质如抗体及其片段的标记，因为抗体IgG分子含有多个所需的氨基酸残基，只要碘化反应条件合适，即可获得高比活度的标记物。不同抗体标记方法基本相同。对于标记抗原，由于其种类繁多，分子量大小、理化性质各不相同，应根据其理化性质和化学结构，设计合适的标记方法。尤其是小分子抗原，由于缺乏酪氨酸、酪氨残基或组胺残基，或者引入碘原子后导致分子空间构象、稳定性和免疫活性等发生不利的变化，此时宜采用间接法标记，即通过有机连接剂使抗原间接地与 ¹²⁵I形成稳定的结合物。

氯氨-T法（chloramine-T，ch-T法）是最常用的直接碘化标记法。ch-T是利用对甲苯磺基酰胺的N—氯衍生物钠盐在水中易分解成具氧化性的次氯酸，它可将放射性 ¹²⁵I ^-离子氧化成带正电荷的 ¹²⁵I ⁺，后者具有很强的亲电子性，可取代被标记物分子中酪氨酸苯环羟基邻位的一个或两个氢原子，使之成为含有碘化酪氨酸的多肽链。 ¹²⁵I ⁺的亲电取代反应很迅速，并且在加入还原剂15秒后就可被中止。常用的还原剂是偏重亚硫酸钠（Na ₂S ₂O ₅），它可以将没有反应的 ¹²⁵I ⁺转化成 ¹²⁵I ^-，并将残留的ch-T还原。 ¹²⁵I常用的是碘化钠溶液。

碘标记率的高低与被标记物分子中酪氨酸（或酪氨、组胺残基）的数量与暴露程度有关，当分子中上述基团多且暴露在外时，标记率高。为了最大限度提高放射性碘的利用率，以及便于放射性污染的后续处理，被标记物与 ¹²⁵I的摩尔数比可以提高到100︰1，这也有利于实现单碘标记，即每个被标记物分子中引入一个放射性碘原子。通常认为单碘标记物比双碘标记物稳定性好，免疫活性改变小。如果被标记物来源不充足，或者价格昂贵，则可考虑降低比例。被标记物水溶性不高时，则要提高其浓度，并可适当添加一些助溶剂和表面活性剂。标记过程中为避免氧化作用对被标记物造成分子结构的破坏和副产物的产生，应尽量将ch-T用量降到最小，同时，ch-T用量减少了，Na ₂S ₂O ₅用量也可随之减少。碘化反应时间一般不要超过1分钟，标记的反应体积要小，反应体系pH以弱碱性为宜，最佳pH为7.3～7.8。pH较高或较低，碘化位置都会发生变化，导致标记物降解或失活。反应温度对碘利用率影响不大，所以通常在室温下就可进行标记操作，但对标记试剂敏感的蛋白质或多肽，则可在0℃进行碘化反应。

ch-T法需注意如下事项：①氯胺-T不稳定，遇光或暴露在空气中易变质，需现配现用；Na ₂S ₂O ₅也需新鲜配制。②碘化钠溶液容易以蒸气形式挥发到空气中，所以要注意随时盖紧瓶塞，避免碘化钠溶液被冻结、接触强氧化剂或强酸。放射性碘具有穿透橡胶手套的能力，所以操作时至少要带双层橡胶手套，同时要穿工作服、戴口罩、帽子。必须在通风橱或通风超净台中操作。

Iodogen是一种与ch-T同属氯酞胺类化合物的碘化剂，氧化作用温和，它在水中溶解度极小，故可制成Iodogen涂管，将待标记物置于液相与固相（氧化剂）之间完成快速的碘化反应过程。反应结束后，只需将反应产物移出反应管，无需再加入还原剂，因此Iodogen法操作简便，反应温度和反应时间范围较大，易于控制，易于分离。对标记数万道尔顿的大分子蛋白质，尤其是对糖蛋白的标记效果比较稳定，但对某些多肽类小分子的标记效果可能不及ch-T法。所以，对于具体项目，选择哪一种碘标记方法，最好通过预实验确定标记方案。

Iodogen碘化法需注意如下事项：①Iodogen涂管直接影响标记效率，氧化剂应均匀分散在反应管底部且高度要适中。制备好的涂管在干燥条件下于室温或-20℃保存，至少可稳定6个月。②碘化反应时间以7～10分钟为宜，这样既可达到最佳标记效率，又可避免反应时间过长可能引起的标记物活性受损。pH为6.0～8.5时，标记率最高。

某些待标记物缺乏酪氨酸或酪氨残基或组胺残基，或者碘化反应损害免疫活性时可采用间接碘化方法。酰化试剂（Bolton和Hunter试剂）法是常用的一种间接碘化方法。该法由Bolton和Hunter于1973年建立。这个方法用酰化剂3-（4-羟苯基）丙酸-N琥珀酰胺酯（Bolton和Hunter试剂）为连接试剂，先用ch-T法将 ¹²⁵I标记在羟苯基的2，5位置上，用苯抽提碘化产物，干燥后与抗原混合反应1小时，碘化乙酰基以肽键与抗原的ɑ-NH ₂或ε-NH ₂连接，再将琥珀酰胺酯水解，通过一个酰氨键将3-（4-羟基-5- ¹²⁵I-苯基）连接在蛋白质或多肽的末端氨基上。凡在结构上含有伯氨基、仲氨基或羧基的蛋白质、肽类等抗原，可直接用此法进行标记。如不含上述基团时，可以对这些化合物的结构进行修饰，衍生出上述基团后再进行碘标记。

酰化试剂法需注意如下事项：①为确保氨基不被质子化，反应体系的pH应控制在碱性条件下，但考虑到琥珀酰胺酯水解在pH低的条件下更有利，故最适标记pH应保持在8.6左右，常用硼酸缓冲液。在此条件下，酰化反应能够快速进行，15分钟基本完成，碘标记率可达80%左右。延长反应时间反而会降低得率。②如果待标记物不宜用硼酸缓冲液，可使用1%的N-甲基吗啉溶液（pH为9.9）。③如果待标记物水溶性很差，或者不适合在水溶液中进行时，可采用极性强的溶剂如二甲基甲酰胺（DMF）作为反应介质。在无水环境中，Bolton和Hunter试剂更稳定，但酰化反应明显减慢，需要3小时才能完成反应。④被标记分子通过间接法引入一个有机分子后，有时会产生桥接识别，对免疫测定产生不利影响，因为抗体对连接桥结构亲和力特别强，而对待测小分子亲和力却很弱，如果标记分子不能从抗体上竞争置换出来，会导致检测灵敏度不佳。为避免发生这种情况，较为简单的方法是在制备免疫原时，采用与制备标记示踪剂不同的化学连接方法，例如，半抗原上如含有伯氨基，可以采用碳化二亚胺方法与载体蛋白偶联，同样部位的氨基用于标记放射性碘时可采用上述间接碘化法标记。

标记物的质量决定放射免疫分析方法的灵敏度和稳定性。首先要根据所需的灵敏度，选择合适的标记方法，制备适当比活度的标记物，使标记前后抗原的特异性改变不影响使用要求、抗体的免疫活性受损程度最低；其次是标记后必须采取适当的纯化步骤除去杂质，以获得高纯度、高特异性和稳定的标记物。为监测标记物的质量，每次碘标记后应鉴定放射化学纯度、免疫活性以及比放射活性。

单位化学量标记物中结合在被标记物上的放射性占总放射性的百分率为放射化学纯度。一般要求放射化学纯度大于95%。化学纯度偏低，表示标记物中含有聚合物或辐射降解碎片，导致非特异性结合增加，检测灵敏度下降。鉴定方法多采用三氯醋酸沉淀法。

免疫活性指碘标记过程中，抗原或抗体免疫活性的损伤程度。鉴定方法可以直接用放射免疫测定法测定，如标准曲线比较法、标记物的非特异性结合率和过量抗体结合率等。

比放射活性指单位化学量标记物中所含的放射性强度，以Ci/g、mCi/mg、Ci/mmol等单位表示。高比放射活性的标记物可提高检测方法的灵敏度，但是比放射活性过高，辐射自损伤增大，对标记物免疫损伤也更大，从而直接影响标记物的放射化学纯度和免疫活性，进而影响标记物的稳定性。因此，应根据测定方法所需的敏感度，制备适当比放射活性强度的标记物。通过改变碘的加入量和待标记蛋白质的浓度来调整标记物的比放射活性。

比放射活性测定方法有直接测定计算法和层析扫描面积计算法。直接测定计算法是将纯化后的标记物配成合适的溶液，测定每毫升的放射活性和含量，从而计算比放射活性。层析扫描面积计算法一般应用纸层析或薄层层析，将尚未纯化的反应液点样、层析，然后在扫描仪上描绘放射性分布图，根据面积计算标记率（图3-1）。

比放射活性=投入的总放射性强度/投入待标记物质量×标记率。

标记物的纯化主要是为了去除标记反应混合液中未被标记的抗体或抗原，同时去除标记反应副产物如聚合物、未反应的Na ¹²⁵I和磷酸盐等，以提高放射免疫分析的特异性和灵敏度。其次，纯化碘标记物能延长试剂贮存期。碘标记物在存放过程中会有部分放射性碘从标记物上脱落下来，或者自身辐射造成蛋白质损伤、变性成为聚合大分子或断键成小分子碎片，所以也需除去这些杂质后再使用，否则影响放射免疫分析的精确度。

常用的纯化方法有凝胶过滤法、离子交换层析法、离心超滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和高效液相层析法等。

适用于标记物的脱盐和进一步纯化，检测各个洗脱峰的放射性强度，还可以粗略估算标记率。

利用游离 ¹²⁵I与标记物分子极性差异进行吸附解离，适用于分离纯化小分子肽类标记物。

根据分子大小进行分离、浓缩和脱盐，操作快速、简便，蛋白质回收率高，适合于少量标记蛋白质的纯化。

利用分子所带电荷和直径不同，在电场作用下分子迁移速率也不同的原理进行分离纯化，可用来分离单碘化、多碘化和已受损变性的蛋白质。

最大优点是分离效果好、快速，但需特殊设备。