免疫动物的免疫原可以是天然的完全抗原，也可以是人工结合抗原、人工合成抗原、基因工程抗原。天然完全抗原的制备过程中会出现抗原纯度不够、活性降低、抗原分子降解，这些问题均可导致抗原质量降低。人工结合抗原是半抗原与载体结合的完全抗原，合适载体的选择至关重要，通常依据半抗原的提取与纯化方法来选择载体，有时为了避免半抗原的抗原决定簇被载体屏蔽，需在半抗原与载体间引入间隔臂。人工合成抗原的分离纯化较天然抗原简单，短肽的合成将直接决定免疫原属性。抗原修饰是基因工程抗原制备的重要步骤，经正确修饰的表达抗原才具有免疫原性。

高纯度抗原是制备特异性抗体的基础。抗原不纯会引起免疫动物后产生非特异性抗体。抗原决定簇是抗原活性的结构基础，在抗原制备中破坏抗原决定簇结构将使抗原活性降低或丧失。天然完全抗原在制备过程中还需防止被降解。

抗原纯度越高，免疫动物获得的抗体特异性越好。若抗原纯度降低，会显著增加抗体筛选的工作量。对抗原纯度的要求受多种因素的影响。首先，对抗原纯度的要求与制备抗体的类型有关，若制备单克隆抗体，一般抗原纯度达85%以上即可；若需制备多克隆抗体，抗原纯度最好达95%以上。其次，作为免疫原时，对抗原纯度的要求还受免疫原性强弱的影响，抗原的免疫原性不强时，制备抗原时要求纯度高；若抗原的免疫原性很强时，对抗原纯度的要求可略低一些。另外，制备抗原时，其纯度也受抗体用途的影响，如制备酶联免疫吸附试验所用抗体时，抗原成分里不要混有牛血清蛋白。最后，纯化抗原时，还需考虑杂质对动物的毒性，若杂质对被免疫动物有较强的毒性，需将毒性杂质完全去除。

绝大多数抗原本质为蛋白质，蛋白质活性可以是作为酶所具有的催化功能，也可以是作为结构蛋白所具备的构成特定组织的功能。蛋白活性需要保持其完整的空间结构，如果蛋白装配折叠错误，就不能发挥它应有功能，即蛋白失活。抗原活性是其激活免疫系统的能力，这种能力通常由抗原决定簇决定。抗原决定簇有两类：线性抗原决定簇和结构抗原决定簇。线性抗原决定簇由蛋白抗原的一级结构决定，若在抗原制备过程中即使蛋白完全变性，仍具有抗原活性，此类抗原纯化方法较多。一些抗原的抗原决定簇属结构抗原决定簇，此类抗原只有正确折叠装配才有抗原活性，若折叠装配错误将使抗原活性降低或丧失，有时可能产生新的抗原决定簇，免疫动物后获得的抗体对天然完全抗原没有反应。因此制备具有结构抗原决定簇的抗原时应选用温和的浓缩和纯化方法，避免使用有机溶剂沉淀法纯化抗原。

抗原作为蛋白在提取过程中，如破碎细胞时释放的蛋白酶可将抗原降解，使得抗原失去抗原活性或含量降低，因此在抗原提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶活性，防止抗原降解。常用的蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟、胃蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、亮抑蛋白酶肽等，它们对不同蛋白酶的敏感性各不相同，在提取抗原时依据材料中的主要蛋白酶选用。纯化后的抗原完整性需进行相对分子量及纯度鉴定，确定抗原在提取及纯化过程中是否被降解。

人工结合抗原是将半抗原与载体结合产生的完全抗原。可作为半抗原的物质有多糖、多肽、甾体激素、脂肪胺、类脂、核酸、药物、抗生素及一些化学物质等。半抗原的提取与纯化因分子性质不同而采取不同方法，如多肽采用蛋白质类物质的纯化方法，多糖纯化方法有季胺盐沉淀法、有机溶剂沉淀法、金属络合法、盐析、层析、电泳等，脂类半抗原一般采用相应溶剂系统抽提。人工结合抗原的另一重要组分为载体，载体的选择应依据半抗原的提取与纯化方法而定，若载体选择不当，会导致免疫失败。载体的选择应遵循4个原则：①载体表面应有与半抗原结合的化学活性基团，这是制备人工结合抗原的前提条件；②载体应具备一定的容量，可以偶联足够的半抗原；③载体应该是惰性材料，不影响偶联后人工结合抗原的功能；④载体应有足够的稳定性以确保人工结合抗原的稳定。

半抗原与载体偶联成人工结合抗原时，半抗原的抗原决定簇可能会被载体屏蔽而失去免疫原性，因此常常在半抗原与载体间引入间隔臂。间隔臂一般选择那些对半抗原结构影响小，且末端含有能与载体蛋白氨基或羧基偶联的活性基团，如氨基、羧基或羟基。间隔臂介入位点也很关键，最好远离特征性结构，这样可以最大限度地保证半抗原的分子极性。

人工合成抗原与人工结合抗原类似，均是小分子物质与载体蛋白连接构成的人工抗原，不同之处在于人工结合抗原是将天然存在的半抗原与载体蛋白结合；而人工合成抗原是先合成一段多肽，再将多肽与载体蛋白交联。人工合成抗原与人工结合抗原与载体蛋白的交联基本类似，人工合成抗原的关键是短肽设计，短肽需形成抗原决定簇才能产生免疫原性。短肽设计的基本原则应保证在免疫过程中，合成抗原既不会产生强烈的免疫反应，又能刺激动物产生对目标蛋白有结合力的高效价抗体。

蛋白构象影响抗原决定簇与抗体识别区之间的相互作用，若抗原决定簇不能暴露在蛋白质分子的表面，抗体将无法结合到抗原决定簇。天然蛋白的亲水区主要集中在蛋白分子的表面，疏水区则一般被包埋在蛋白分子内部。因此设计人工合成抗原的短肽时应将抗原决定簇置于分子的表面亲水区，使其能被抗体分子识别。为了避免抗原决定簇隐藏到蛋白分子内部，通常将抗原决定簇序列设计到短肽的两端，在蛋白分子中，靠近两端的氨基酸残基通常是暴露在蛋白分子的表面。若抗原决定簇所在区在结构上具有变形性，则可提高抗原与抗体的亲和力。抗原决定簇大多是由连续的氨基酸序列构成，但有时是由不连续的氨基酸序列构成，不连续的氨基酸通过蛋白折叠与装配在空间结构上接近，而构成抗原决定簇。因此设计不连续氨基酸构成的抗原决定簇时，一般先用软件对短肽进行空间结构的预测。短肽长度以10～20个氨基酸残基为宜，太短与抗体的亲和力不够，太长可能产生二级结构，且合成难度增加，也不易获得高纯度的抗原。

正确修饰的基因工程抗原才具有免疫原性。基因工程抗原是通过载体将基因片段导入受体细胞表达有免疫原性的融合蛋白，基因片段的设计与人工合成抗原相似，需使基因片段的表达产物具有免疫原性，同时保持抗原决定簇暴露在蛋白质分子的表面。受体细胞的选择对基因工程抗原的制备也很重要。常见的受体细胞有大肠埃希菌、酵母细胞及哺乳动物细胞等。大肠埃希菌表达系统是最早的基因工程表达系统，通过大肠埃希菌表达抗原成本低，表达量多，但它不能对表达的抗原进行修饰，同时容易形成包涵体。酵母细胞表达系统可以对表达的抗原进行折叠、装配，抗原的安全性高，表达系统简单，但酵母细胞内表达的抗原易过度糖基化，进而影响抗原稳定性。哺乳动物细胞表达系统有中国仓鼠卵巢细胞、小鼠乳瘤细胞等，哺乳动物细胞表达的抗原接近天然蛋白的构象，可对蛋白质进行各种修饰，但哺乳动物细胞表达系统操作繁琐，表达量低。制备基因工程抗原应依据抗原用途及用量选用合适的表达系统。

1890年德国学者Behring和日本学者北里在Koch研究所应用白喉外毒素给动物免疫，发现其血清中存在一种能中和外毒素的物质，称之为抗毒素，是被发现的第一个天然抗体。此后抗体研究迅速发展，从天然抗体分离、纯化到基因工程抗体制备，从多克隆抗体制备到单克隆抗体的出现，抗体在健康领域的应用越来越广泛，如疾病预防与治疗用的疫苗、免疫调节治疗的生物制品、诊断检测用的抗体、生命科学研究所用抗体等。随着科学进步，抗体制备技术日趋成熟，但制备过程也会出现一些问题，需认真处理。单克隆抗体的制备与多克隆抗体的制备有众多相同的原则，如动物选择、免疫原制备、免疫途径、抗体检测、抗体采集、抗体鉴定、病原体处理等，但单克隆抗体的制备另需建立杂交瘤细胞株，并对杂交瘤细胞进行筛选、克隆培养、冻存等处理。

选择具有良好免疫原性和反应原性的抗原免疫动物是抗体制备成功的基础。因此获得质量合格的免疫原是抗体制备的首要基本问题。免疫原的制备因抗原性质、免疫途径的不同而异。质量不合格的免疫原是抗体制备失败的常见原因。

制备单克隆抗体通常选择与小鼠骨髓瘤细胞同源的小鼠作为供脾动物，小鼠龄以4～8周为宜，杂交瘤细胞在此鼠龄期的腹腔可快速生长。近来有学者主张采用大鼠制备单克隆抗体，其血清和腹水比小鼠高多倍，适合于大量制备单克隆抗体。制备多克隆抗体选用的动物范围较大，可以是哺乳动物，也可以是禽类动物。动物的选择应把握3个原则：①被免疫动物应与抗原来源的动物保持较远的亲缘关系，以保持抗原的强免疫原性；②多克隆抗体的用量是选择免疫动物的重要考量因素，若需要较大量的抗体需选择马、牛等大动物，若抗体需求量小时，一般免疫兔、羊、鸡、鼠等动物；③动物的个体状态也需筛选，被免疫的动物必须是适龄、健康的个体。动物的免疫途径有多种，如皮下、皮内、腹腔、淋巴结、肌肉、脾脏及静脉接种等。采用免疫途径取决于免疫原吸收与代谢、免疫剂量、动物种类等因素。免疫途径不当会导致抗体获得量少，甚至得不到抗体。

动物接种免疫原后，在免疫反应时间内要留意动物饮食，测量动物体温，观察动物精神状态。为了避免动物在免疫过程中出现异常反应，应做到如下几点：①制定合理的免疫程序，接种部位准确，免疫原剂量适中；②保持动物居住环境的适宜温度、湿度、光线、通风等，并定期进行消毒，防止动物感染；③免疫动物前，提供动物均衡丰富的营养，提高其非特异性免疫力，避免转群、运输、惊吓动物，也可在免疫前喂食动物一定量的维生素；④免疫动物前，需对动物进行健康检查，对健康不佳、体质较弱、年龄不宜的动物暂缓接种。接种后，若动物出现异常反应时，如出现超敏反应、全身感染、过敏性休克等应及时进行救治。

免疫程序结束后应检测动物血清的抗体效价，若效价达到预期要求，视为免疫获得成功，就可及时采血。若血清效价低于规定要求，可增加免疫次数或免疫剂量，之后再达不到要求，视为免疫失败，该动物应被淘汰。血液采集方法已在本章第3节中详述，需要注意的是血液采集前动物应空腹1天，第2天上午动物空腹时进行，避免出现脂血。采血过程中应注意无菌操作，并防止溶血。血液容器需进行灭菌，分离后的血清加防腐剂后分装冻存，避免被病原体污染。

抗体的安全性是抗体应用的首要问题。血清病原体主要是病毒，处理病毒主要是排除病毒、去除病毒、灭活病毒。排除病毒是制备抗体过程中要遵循无菌操作规范，防止血清中出现高浓度病毒。去除病毒一般采用物理方法，如膜过滤法，不仅可减少病毒数量，同时可进一步纯化抗血清。灭活病毒是抗体安全的技术难点，病毒灭活需考虑如下几点：①灭活技术不能改变抗体的免疫性活性和理化性质；②灭活技术不能导致血清成分发生变性，不能产生新抗原，也不能导致人类或动物致病；③灭活技术也不能激活血清成分；④灭活方法简单经济。目前应用于抗血清病毒灭活的方法有γ线辐照法、流体力学高压法、核酸为靶点的光化学法等。

瘤细胞的选择以及瘤细胞与脾细胞混合比例等是影响瘤细胞与脾细胞融合的重要因素。为了避免瘤细胞与脾细胞融合失败，建立杂交瘤需选择合适生长期的骨髓瘤细胞，按比例正确混合瘤细胞与脾细胞，并增加两种细胞的接触面积。

骨髓瘤细胞在长期传代培养中会发生变异，进而影响其与脾细胞的融合，因此一般选择对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞，在进行融合前更换新的培养基，并将培养基血清浓度提升至15%～20%。

骨髓瘤细胞与脾细胞的混合比例一般设定在1︰2.5～1︰5，若脾细胞数量太高，会大量消耗培养基中的营养、次黄嘌呤、胸腺嘧啶，影响杂交瘤细胞的生长；若免疫小鼠的抗原的免疫性不强，可适当提高脾细胞的数量，但需增加培养液的更换频率。

骨髓瘤细胞与脾细胞混合后低速离心，吸弃上清液，加入聚乙二醇以增加两种细胞的接触面，不可用力吹打细胞，避免降低细胞的融合；也可加入聚乙二醇和二甲亚砜混合物来增加细胞融合的概率；在细胞培养时加入小鼠腹腔细胞作饲养细胞，也能提高细胞融合成功的概率。若抗原的免疫原性弱，融合率低，用24孔培养板培养可节约筛选时间，反之，用96孔培养板培养可节约筛选时间。

杂交瘤细胞在培养时容易失去分泌抗体的染色体，同时也受到不产生抗体的杂交瘤细胞的排挤，因此杂交瘤细胞的筛选应快速进行。筛选杂交瘤细胞的方法有酶联免疫吸附试验、免疫荧光试验、放射免疫分析、细胞毒试验等方法。方法选用时除考虑快速、简单、可靠外，还需考虑抗原性质、抗体类型、是否依赖补体等因素。目前筛选杂交瘤细胞最常用的方法是酶联免疫吸附试验。

杂交瘤细胞系是由骨髓瘤细胞与被免疫动物的脾细胞融合形成，不是严格的贴壁细胞，而是半悬浮细胞，为了避免培养过程中杂交瘤细胞死亡，在克隆培养时更换培养液只需每次更换培养液体积的3/4即可，剩余培养液中细胞可反复培养，减少培养环境改变对杂交瘤细胞的生理影响，漂浮细胞可继续单独培养。杂交瘤细胞的克隆培养也可采用软琼脂平板法培养。杂交瘤细胞不宜采用体内或体外传代培养，需通过冷冻保存。细胞冻存过程要经历液体溶液的固化和水分子通过细胞膜的渗透过程，冻存细胞溶液一旦形成冰晶，会导致细胞内外环境改变，增加防冻剂对细胞的毒性，造成细胞损伤。细胞冻存有程序性降温液氮冻存法和非程序性降温液氮冻存法。程序性降温液氮冻存法需专用设备，温度控制较好，对细胞损伤小，缺点是操作复杂费时，成本较高。非程序性降温液氮冻存法可用10%的DMSO作保护剂，血清浓度为20%，先将细胞悬挂于液氮罐口和液氮之间，距液氮面大于15cm，2～3小时后，再将细胞放入液氮中冻存。冻存时间选择处于对数生长期细胞，在收集细胞前一天更换新鲜培养液，次日收集细胞冻存。

商用单克隆抗体通常需大量生产。杂交瘤细胞克隆培养到一定数量后就可进行单克隆抗体的大量制备，制备技术有体外培养、体内培养及微囊技术。体外培养过程中由于细胞爆发式生长，最终细胞死亡，因此获得的抗体效价较低。体内培养能从动物的血清或腹水中获得高效价抗体，其效价可达体外培养1000倍，是目前大量制备单克隆抗体的最常用方法。微囊技术是将杂交瘤细胞接种于一种由碳水化合物多孔膜组成的微球中进行培养，培养一段时间后，从培养液中分离出微囊，冲洗打开囊膜，离心后即可获得高浓度的单克隆抗体，抗体制备量较传统的体外培养法提高许多倍。

血清中含有上百种蛋白质，通过血清培养制备的单克隆抗体需要纯化，纯化过程中未被除去的异种蛋白若用于治疗时可能诱发超敏反应。不同批血清之间抗体质量差异较大，影响抗体批间的稳定性；另一方面，血清容易污染，来源有限，成本较高。采用无血清培养基培养杂交瘤细胞越来越受到广泛关注。无血清培养基是用不同添加剂来代替血清，进行杂交瘤细胞的培养。代替血清的添加剂有白蛋白、酪蛋白、大豆类脂、亚油酸和油酸、抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、亚硒酸钠、微量元素等。通过无血清培养基培养杂交瘤细胞制备的单克隆抗体容易纯化，易于大规模生产，细胞被污染的机会降低，且成本低廉。相对于动物体内培养，获得的抗体效价仍然偏低。随着研究深入，无血清培养基应有广泛的应用前景。