根据性质不同，抗原可分为完全抗原和不完全抗原。既有免疫原性，又有免疫反应性的抗原为完全抗原；只有免疫反应性，而无免疫原性的抗原为不完全抗原，也即半抗原。依据来源，抗原可分为天然抗原、人工抗原和合成抗原。

抗原制备的基本过程包含材料选取、提取、纯化、浓缩、保存等步骤。天然抗原一般为多种成分的混合物，只有将某一单一抗原成分分离纯化后，才可用来作为诊断试剂检测抗体，或用作抗体制备。依据抗原自身特性和来源差异，应采用不同纯化方法进行制备。

颗粒性抗原是一种天然抗原，主要有细胞、细菌和寄生虫三类。免疫测定常用的细胞抗原有绵羊红细胞和人红细胞。绵羊红细胞主要为制备溶血试验的抗原，制备过程如下：①采集健康绵羊静脉血，以玻璃珠除去纤维蛋白，获得抗凝全血；②以生理盐水洗涤红细胞3次以制备细胞沉淀；③将红细胞沉淀用生理盐水配成10 ⁶/ml个细胞悬液即成为溶血试验用的绵羊红细胞抗原。人红细胞主要用于血型反向鉴定，制备过程与绵羊红细胞类似，但需混合多份同型红细胞抗原。

细菌抗原的制备过程包括：①以液体培养基或固体培养基培养待制备的细菌；②依据细菌抗原性质用不同方法杀菌，如制备O抗原的细菌用100℃水浴2～2.5小时，制备H抗原的有鞭毛细菌用0.3%～0.5%甲醛处理，制备Vi抗原的细菌在杀菌后用0.5%～1%氯化钙溶液处理；③将处理后的细菌继续培养做无菌试验；④将杀菌后的细菌用生理盐水即可配成适当浓度菌液。

寄生虫的活虫、死虫、虫体碎片等可称为虫体抗原，虫体抗原对研究寄生虫的免疫机制、快速诊断、疫苗的研发都具有重要意义。如血吸虫虫卵抗原可用于诊断血吸虫病，其他寄生虫感染如疟原虫、猪带绦虫等都可用相关免疫学技术进行诊断。

可作为抗原的蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、多糖及核酸等可溶于水，因此这些抗原也称为可溶性抗原。可溶性抗原多以混合物形式存在于生物组织内，因此制备可溶性抗原常需纯化。以下以蛋白类可溶性抗原为例介绍可溶性抗原的制备。

用于制备抗原的组织多用新鲜组织，若组织不能立即处理，应将其置于-80℃冰箱保存。应先去除组织标本表面的包膜、血迹和污物等，再用生理盐水洗净，然后剪成小块，再将组织小块置于生理盐水中用组织捣碎机捣碎或用研钵磨碎，制备组织匀浆。也可采用胶原酶和蛋白酶消化组织，制备细胞悬液。

细胞破碎有物理、化学和生物学等方法，真核生物细胞较易破碎，原核生物细胞因有细胞壁而破碎相对较难，可依据细胞类型选取适当的破碎方法。

细胞破碎的物理方法主要有超声破碎和冻融破碎。超声破碎是利用超声波的机械振动破碎细胞的一种方法，超声波的使用频率为1～20kHz。超声破碎易产热，因此破碎细胞需间歇进行，以避免抗原因温度升高而变性。为了获得更好效果，可在冰浴中进行超声破碎。超声破碎方法简单，但对原核生物细胞的破碎效果不及真核生物细胞。冻融破碎的原理是利用低温使细胞内水分形成冰晶，反复地迅速改变细胞所处环境温度，冰晶和胞内外溶剂浓度突然改变，使得细胞破碎。冻融破碎细胞的方法是将待破碎细胞置于-20℃冰箱使其冻结，然后再在30～37℃环境中缓慢融化，重复2次冻结/融化过程可使大部分类型的细胞破碎。冻融破碎细胞的方法会对抗原活性造成一定程度破坏。

细胞破碎的化学方法主要是用表面活性剂处理，常用于破碎原核细胞。在适当的温度、离子强度和pH条件下，表面活性剂可与细胞膜中脂蛋白形成微泡，改变细胞膜的通透性，进而使细胞破裂。破碎细胞常用的表面活性剂有十二烷基磺酸钠、二乙氨基十六烷基溴、曲拉通X-100等。

细胞破碎的生物学方法主要有酶处理法和自溶法。酶处理法是利用溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶等水解酶消化原核生物的细胞壁，以释放胞内成分。溶菌酶一般用于消化细菌的细胞壁，蜗牛酶往往用于消化酵母细胞的细胞壁，纤维素酶则多用于消化植物细胞的细胞壁。酶处理法破碎细胞条件相对温和，可控制细胞壁的破碎程度，保护抗原活性不被破坏。

自溶法是在适当温度和pH的条件下，利用细胞内自身含有的水解酶水解细胞，释放细胞内成分。用自溶法破碎细胞需控制好自溶条件，否则细胞内水解酶会破坏待提取的抗原。真核生物组织细胞自溶时一般将温度设定在0～4℃，原核生物组织细胞自溶时一般将温度设定在室温。自溶时往往还需加入少量防腐剂。

细胞破碎后经离心并去除沉淀物后，便可从上清液中纯化抗原。纯化抗原方法主要有超速离心、层析、选择性沉淀以及电泳。

超速离心是利用颗粒或分子的沉降系数、质量、密度不同，通过离心力使物质达到分离、浓缩的一种方法。超速离心有差速离心和密度梯度离心两种。差速离心是利用不同的离心速度分别分离各不同组分，如先用低速沉降大颗粒物质，再用高速沉降中等颗粒物质，最后用超速离心沉降小颗粒物质，采用逐级提高离心力来分离不同大小的颗粒或大分子如抗原。

密度梯度离心是一种区带离心，它是将样品放在一个连续的密度梯度介质中，离心时大颗粒沉降快，小颗粒沉降慢，离心后大小相同的颗粒在同一密度梯度介质中形成一条带，从而把各种组分分离开来。常用的密度介质有蔗糖、甘油、氯化铯等，其中蔗糖是常用介质，一般配成5%～60%的密度梯度溶液。密度梯度离心适用于分离密度相似、而大小不同的物质，如密度类似、但分子量存在差异的抗原，用本法很容易将其分离。相反，对分子量类似、但密度不同的抗原物质，密度梯度离心难以达到分离效果。

层析是利用混合物中各组分的物理和化学性质如溶解度、分子大小和形状、极性、吸附力、亲合力等不同，使各组分在支持物上分布在不同区域而使得分离。层析分为固相层析和液相层析，前者由固相-液相/固相-气相构成，后者由液相-液相/液相-气相构成。因各组分的物理和化学性质的不同，它们在固定相和流动相中分配也不同，因此各组分随着流动相的前移速度不同而达到分离。

层析可用于有机物、氨基酸、金属离子等物质的分离，它对生物大分子如蛋白质和核酸等的分离有较好的效果。依据分离机制的不同，层析可分为离子交换层析、亲合层析、凝胶层析、吸附层析、分配层析等。常用于抗原分离的方法有离子交换层析、亲合层析和凝胶层析。

离子交换层析是利用交换剂与各组分的亲合力不同，进行层析分离的方法，常用的交换剂有纤维素、交联葡萄糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、凝胶合成的高强度交联树脂、细粉等。在特定pH条件下，待分离的目的抗原与其他蛋白质等电点不同，所带电量不同，因此与交换剂的结合力就存在差别。进行洗脱时，逐渐增加洗脱液的离子强度，洗脱液中的离子与蛋白质竞争交换剂上的带电位点，导致不同等电点的蛋白质分别解离。在纯化过程中，带电少、亲和力小的蛋白质分子先被洗脱下来，而带电多、亲和力大的蛋白质分子后被洗脱下来，目的抗原也因此与其他不同蛋白质分离开来，得以纯化。

亲合层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和作用，如抗原与抗体、激素与受体、酶与底物、酶与辅酶、酶与抑制物、维生素与其特异性结合蛋白、DNA与RNA间的特殊亲和力。在特定条件下，具有亲和作用的两种分子可紧密结合在一起形成复合物，若将其中的一种分子固定于固相载体上，就可从溶液中分离出另一种分子。亲和层析常用的支持物有纤维素、交联葡萄糖、多孔玻璃珠、琼脂糖、聚丙烯酰胺以及其他新型载体。亲和层析操作简单，分离效率高，纯化的蛋白质活性不易丧失，因此适合纯化抗原。

凝胶层析是利用凝胶的分子筛作用。当分子量不同的蛋白质经过一定孔径分子筛凝胶时，由于在凝胶中受到的阻滞作用存在差异，从而使分子量不同的蛋白质在凝胶分子筛中的迁移速度不同，即可达到被分离的目的。当混合物经过凝胶柱时，小分子蛋白质进入凝胶颗粒内被滞留，大分子蛋白质则被排阻在凝胶颗粒之外而能快速通过凝胶柱。凝胶层析分离条件比较温和，不易引起蛋白质变性，因此凝胶层析分离抗原具有优势，即不仅可以保留抗原活性，还可以进行较大量抗原的分离纯化。但凝胶层析技术本身也有局限性，即凝胶产生的分子筛孔径大小有限，能分离抗原的分子量范围较窄；而且凝胶颗粒对脂蛋白、芳香族化合物等具有吸附作用，会影响被分离抗原的纯度。

蛋白质的稳定性受一些理化因素的影响，改变某些条件或加入沉淀剂可使蛋白质沉淀，称之为选择性沉淀。通过选择性沉淀可纯化抗原，常用方法有盐析、有机溶剂沉淀、水溶性非离子型聚合物沉淀、核酸沉淀等，其中以盐析最常用。

盐析是一种经典的蛋白质纯化分离法。蛋白质分子借表面的亲水基团与水形成水化膜而溶于水中，形成溶液，蛋白质分子携带的电荷也有助于稳定蛋白质溶液的稳定性。若向蛋白质溶液中加入中性盐类，中性盐对水分子的亲和力大于对蛋白质分子的亲和力，这样就破坏了蛋白质分子周围的水化膜，同时中性盐改变了溶液的离子强度，蛋白质分子表面电荷被中和，使得蛋白质溶液溶解度降低而沉淀。由于不同蛋白质分子的溶解度与等电点不同，沉淀时所需的pH与离子强度也不相同，因此通过改变盐溶液的浓度与pH，可使混合液中的不同蛋白质先后沉淀。如先用30%以下浓度的硫酸铵溶液沉淀蛋白质溶液，再进行30%～60%硫酸铵溶液沉淀，最后用60%～80%硫酸铵溶液进行沉淀。用盐析法纯化蛋白质简便、有效、不损害蛋白质活性，至今仍被广泛应用于抗原的粗提和浓缩，但是盐析法获得的抗原纯度不高。

有机溶剂沉淀原理是基于有机溶剂可降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子间静电引力，使蛋白质分子聚集而沉淀。有机溶剂与中性盐一样，也可破坏蛋白质分子的水化膜，降低蛋白质溶液的稳定性，因此加入一定浓度的有机溶剂可使蛋白质沉淀下来。乙醇和丙酮的介电常数较低，是最常用的沉淀剂。有机溶剂与蛋白质溶液密度差异较大，沉淀后易挥发，因此沉淀出的蛋白质纯度较高。以有机溶剂沉淀抗原时，容易引起抗原变性，因此需严格控制操作条件，如沉淀前需先将抗原溶液冷却至接近0℃，还需要把有机溶剂预冷到更低温度，在充分搅拌抗原溶液条件下加入预冷的有机溶剂，以避免抗原变性。

水溶性非离子型聚合物如聚乙二醇、硫酸葡聚糖等能与蛋白质分子形成沉淀复合物。水溶性非离子型聚合物沉淀蛋白质的原理与有机溶剂类似，主要通过破坏蛋白质分子的水化膜。用此类水溶性非离子型聚合物沉淀蛋白质时，沉淀剂也与蛋白质一起沉淀，沉淀颗粒大而易于收集。聚乙二醇是常用的水溶性非离子型沉淀剂，性质随其相对分子量差异而不同，从无色、无气味、黏稠状液体至蜡状固体，分子量范围在2000～6000的聚乙二醇适合用于蛋白的沉淀。聚乙二醇浓度也影响蛋白质的分离效果，实验显示当聚乙二醇的浓度为3%～4%时沉淀免疫复合物效果较好，浓度调至6%～7%可沉淀IgM，继续提高至8%～12%可沉淀IgG；当聚乙二醇浓度提高至12%～15%时可沉淀其他类型球蛋白，25%聚乙二醇可沉淀白蛋白。

从组织或细胞中提取抗原时，溶液中通常含有大量核酸成分，除去核酸是纯化抗原的重要步骤。去除核酸主要用沉淀法，简单易行，常用沉淀剂有硫酸鱼精蛋白、氯化锰、聚乙烯亚胺、链霉素等。用核酸酶降解是去除蛋白质溶液中核酸成分的一种新方法，在蛋白质溶液中直接加入DNA酶和RNA酶即可降解DNA和RNA，应用这种方法去除核酸有取代沉淀法的趋势。

蛋白质为胶体分子，在电场介质中蛋白质分子所带电荷不同、分子形状及其大小均不同，因而可以被分离。分离蛋白质的电泳多用凝胶为支持物，包括聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶等，以聚丙烯酰胺凝胶最常用。在以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳中，依据电泳模式不同，又分为等电聚焦电泳、垂直电泳、梯度电泳、免疫电泳和盘状电泳等。

等电聚焦电泳是分辨率最高的电泳技术，适用于分离包括抗原在内的各种蛋白质分子。等电聚焦电泳的原理是在电泳介质中加入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度。由于不同蛋白质各自都有一个等电点，在一特定的pH环境（与其等电点相同区域）时，蛋白质分子呈电中性，在电场中便不会泳动。因此，当不同蛋白质移动到其等电点区域时，蛋白质分子不再带电而停止移动。此时不同蛋白质分别被聚焦在各自等电点对应的位置，形成分离的蛋白质区带。

经纯化获得的抗原需进行鉴定，鉴定包括抗原含量、抗原的相对分子量、抗原纯度以及其免疫活性。抗原含量测定方法有凯氏定氮法、双缩脲法、Folin酚试剂法、紫外吸收法、考马斯亮蓝法、二喹啉甲酸法等，其中以紫外吸收法较为常用。纯度分析一般用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱分析、高效液相色谱等技术，其中质谱分析和高效液相色谱设备比较昂贵，因此在一般实验室多用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行抗原纯度鉴定。抗原免疫活性测定的方法有免疫双扩散法、免疫电泳法、酶联免疫吸附法等。抗原的相对分子量的估测在标准蛋白质分子量标志物（marker）的存在下一般通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。

在适宜条件下，免疫球蛋白分子肽链的某些部位易被蛋白酶水解为相应片段，用免疫球蛋白的水解片段免疫动物，制备得到的抗体会具有更高的特异性。因此，一般需先将免疫球蛋白解离成不同片段如Fc片段、Fab片段、轻链等。轻链的制备需解离二硫键，肽链的解离可通过酶的水解或溴化氰裂解。

免疫球蛋白分子是免疫球蛋白单体通过二硫键将2条重链（H链）和2条轻链（L链）连接而成的，因此制备免疫球蛋白片段时，需先使二硫键解离。解离二硫键的方法有氧化法和还原法，以还原法更为常用。还原法是将二硫键还原成巯基，二硫键断裂后，再迅速去除还原剂，再及时用碘乙酸或碘代乙酰胺进行羧甲基化以封闭巯基，以防止疏基重新结合成二硫键。用氧化法解离肽链后，虽然肽链不能再重新形成二硫键，但肽链中的甲硫氨酸易被氧化成亚砜，色氨酸支链也易被破坏，因此这个方法较少使用。

免疫球蛋白分子解离成免疫球蛋白单体后，还需用温和条件分离免疫球蛋白亚单位之间的氢键、静电引力等非共价键。这些非共价键结合力较弱，将pH调至低于3或高于10时，非共价键便会被破坏。

裂解免疫球蛋白单体的肽键可用生物法和化学法。用生物法裂解肽键需要木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等参与。木瓜蛋白酶可将IgG裂解成1个Fc片段和2个Fab片段；胃蛋白酶可将IgG裂解成1个F（ab'） ₂片段和一些无免疫活性的pFc'小片段；胰蛋白酶则可将IgG裂解成不规则片段（图2-1）。在制备抗体试剂时，大多采用胃蛋白酶裂解IgG，获得F（ab'） ₂片段。化学法裂解一般用溴化氰，其原理是溴化氰与蛋白质分子中的甲硫氨酸支链的硫醚基产生反应，生成溴化亚氨内酯，此产物再与水反应，使肽链断裂。

半抗原是只具有抗原性而无免疫原性的物质，因此半抗原可与相应抗体结合产生抗原-抗体反应。半抗原只有免疫反应性，不能单独激发机体产生抗体，也称为不完全抗原。大多数多糖和类脂、一些多肽和核苷酸、某些药物和化学物质都属于半抗原。半抗原虽不具有免疫原性，但若把半抗原与某种蛋白质分子结合，就会获得新的免疫原性，并能刺激机体产生相应的抗体或致敏淋巴细胞。除蛋白质分子外，一些大分子聚合物和颗粒物质均可与半抗原结合，使其获得免疫原性，此类物质称为载体。载体类型、载体与半抗原偶联方式都会影响半抗原-载体诱导的免疫应答效果。半抗原一旦与载体结合就可形成一个或几个抗原决定簇，成为完全抗原，这种完全抗原可引起机体的超敏反应，通常体内B淋巴细胞识别半抗原决定簇，T淋巴细胞识别载体抗原决定簇。

用化学合成法制备的含已知化学结构决定簇的抗原，称为人工抗原，主要包括人工结合抗原、人工合成抗原。人工抗原的出现对免疫学研究和疫苗生产均有重要意义。

将半抗原与载体结合产生的完全抗原，称为人工结合抗原。半抗原多数为低分子量的物质，如多糖、多肽、甾体激素、脂肪胺、类脂、核酸、药物、抗生素，以及一些化学物质。半抗原需与载体结合才具有免疫原性。

常用载体有蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物三类。蛋白质是一类结构复杂的良好载体，以白蛋白最为普遍，因为白蛋白具有较高的溶解度，免疫原性强，来源丰富，常用的白蛋白有牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白等，以牛血清白蛋白常用。多肽聚合物是人工合成的载体，如多聚赖氨酸，分子量可达十几万到几十万道尔顿，它与半抗原结合后，可刺激动物产生高滴度、高亲和力的抗体。大分子聚合物如聚乙烯比咯烷酮、羧甲基纤维素可与半抗原结合，加入弗氏佐剂可诱导动物产生高效价抗体。

载体免疫原性的强弱直接影响产生半抗原相关抗体的水平。以蛋白质为载体时，通常选择带正电荷、免疫原性强的碱性蛋白质。以大分子聚合物为载体时，往往选择在体内容易被酶水解的大分子聚合物，因为大分子聚合物在体内需经水解后才能诱发免疫应答，不能被酶水解的大分子聚合物如阿拉伯胶等，不宜做载体。

半抗原与载体的连接可用物理法和化学法。大分子聚合物载体通过电荷和微孔，以物理法吸附在半抗原上。携带游离氨基或游离羧基的半抗原，可通过化学法直接连到蛋白质和多肽聚合物载体上。对那些没有游离氨基或游离羧基的半抗原，可加以适当的结构改造，使其成为带有游离氨基或游离羧基的衍生物，再与蛋白质和多肽聚合物载体相连。半抗原与载体的结合需要保持半抗原的原有免疫活性，同时还需要使载体依然具有可溶性。载体应结合在远离半抗原的抗原决定簇位点。

通过化学方法将氨基酸按一定顺序聚合成大分子多肽，使其具有抗原属性，即为人工合成抗原。人工合成抗原常用于抗原特性、抗原抗体反应机制以及实验诊断研究。人工合成抗原一般将目的基因的cDNA序列或蛋白质编码序列与载体连接后导入宿主菌内进行表达，并分离和纯化出蛋白质作为抗原，通过免疫动物即可获得相应抗体。要使人工合成抗原免疫动物获得的抗体能与天然抗原能起交叉反应，肽链氨基酸序列的选择是关键。

蛋白质上许多肽链氨基酸序列均有免疫原性，但不是所有肽链序列都能通过免疫应答产生抗相应天然蛋白质的抗体，并且它们产生抗体的反应强弱也有所不同。通常仅有50%左右的肽链序列可诱导机体产生抗相应天然蛋白质的抗体，原因在于不同肽链序列在天然蛋白质二级结构中所处位点不一。在选择肽链氨基酸序列之前，通常需用软件预测整个蛋白质分子的二级结构，软件预测抗原性的准确率可达70%。理想的肽链氨基酸序列一般选择其亲水区序列，这样既可保证合成抗原的水溶性，又比较容易合成。肽链合成的长度尽可能为10～20个氨基酸，多为15个氨基酸，太短不足以形成抗原表位，太长又容易形成特定的空间构象。

大多数多肽合成通过自动多肽合成仪合成，少数难以合成的则可用其他策略合成。合成后的多肽通过质谱或高效液相色谱分析进行鉴定。

人工合成抗原与载体蛋白的连接一般采用戊二醛作交联剂。

随着基因重组技术的出现，已可将编码免疫原性氨基酸序列的基因片段克隆到载体上，然后导入到受体细胞进行表达，如此可获得具免疫原性的融合蛋白，经纯化后的基因工程抗原可用于制备疫苗。