第二章　免疫测定的靶物质及其制备

尽管免疫测定技术多种多样，但其基本原理都是基于抗原抗体相互作用为基础的生化反应。免疫测定的对象主要为抗原、抗体，其他生物大分子如补体、细胞因子、细胞黏附分子、蛋白、酶、激素等同样可通过免疫学方法进行测定。体液中的小分子物质如药物等也可通过免疫学技术进行测定。免疫测定不仅可测定单一分子，也可测定复杂分子如抗原抗体复合物。免疫细胞是免疫系统的重要组成成分，通过免疫学技术还可分析免疫活性细胞的数量及功能。免疫测定在临床既可用于定性实验，也可进行定量分析。测定抗原需制备特异性抗体，而获得特异性抗体又需要高纯度的抗原，抗原的纯度决定了免疫测定的特异性。若免疫测定对象为抗体，则需要制备相应的特异性抗原。因此制备高质量的抗原和抗体是免疫测定的重要前提。

免疫测定是依据抗原与抗体反应原理，利用各种标记或免疫技术检测一些体液中的病理或生理物质，如抗体、抗原、补体、细胞因子、细胞黏附分子、蛋白、酶、激素、免疫复合物、免疫活性细胞等，免疫测定还可用于治疗药物浓度的监测。

抗体是免疫系统在抗原的刺激下，由B淋巴细胞增殖分化成浆细胞时产生的可与相应抗原结合，产生特异性反应的免疫球蛋白。抗体概念最早出现于1901年，它是免疫系统结合外来物质如非自身蛋白、微生物及毒素等，并与之中和的免疫分子。在病理状态下，机体可产生抗自身成分的自身抗体，并由此而引起自身免疫性疾病。抗体属于Y形蛋白大分子，主要分布在血液中，在组织液、外分泌液、黏膜及一些细胞表面也存在部分抗体。这些抗体均可作为免疫测定对象，为疾病的诊断和治疗提供重要依据。

依据理化性质和生物学功能，抗体可分为IgM、IgG、IgA、IgE及IgD五类。IgM是免疫应答中最早产生的抗体，微生物感染经过一段时间后，IgM抗体量一般会逐渐减少，甚至消失。IgM抗体主要存在于血液中，对防御微生物感染起主要作用，因此IgM抗体测定对近期感染有重要诊断价值。人感染细菌或病毒后，这些病原体会刺激免疫系统发生免疫应答，产生特异性IgM抗体。用细菌、病毒或相关特异性抗原检测病人血清中有无相应特异性IgM抗体及抗体效价的动态变化，可作为病原微生物感染的诊断依据。如检测HAV-IgM抗体是诊断甲型病毒性肝炎的重要指标。

IgG抗体是再次体液免疫应答产生的主要抗体，IgG抗体亲和力高，在体内广泛分布，在免疫应答中具有保护作用，能防御病原微生物的感染。IgG抗体是血清抗体的主要组分，它是唯一可以通过胎盘的免疫球蛋白抗体。检测特异性IgG抗体对病原微生物感染的诊断和流行病学调查有重要意义。如用梅毒螺旋体Nichol株作抗原，通过间接免疫荧光法检测病人血清特异性抗梅毒螺旋体IgG抗体，对梅毒诊断具有很高的特异性和敏感性。血清抗-HBc IgG抗体在血清中可持续存在数年，检测抗-HBc IgG抗体可作为人群乙型肝炎病毒感染的流行病学调查的依据之一。一些自身抗体也属于IgG型抗体，如检测血清冷凝集素有助于诊断自身免疫性溶血性贫血。引起Ⅱ型超敏反应的抗体主要为IgG抗体，如属IgG的抗Rh抗体，可通过胎盘引起新生儿溶血症。通过Coombs试验检测患儿红细胞表面的IgG型不完全抗体可诊断新生儿溶血症。

IgA抗体在血清中的含量仅次于IgG，按其功能可分为血清型IgA和分泌型IgA两种。血清型IgA抗体功能类似IgG抗体和IgM抗体，但在免疫防御中的作用不及IgG抗体和IgM抗体重要。分泌型IgA抗体存在于唾液、泪液、乳汁、鼻和支气管分泌液、胃肠液、尿液、汗液等分泌液中，是机体黏膜局部免疫防御的主要抗体。检测血清或分泌物中的IgA抗体对临床诊断均有参考意义，如检测血清EB病毒抗EA/D IgA抗体和抗VCA IgA抗体有助于鼻咽癌筛查，检测精浆IgA型抗精子抗体有助不孕症的诊断。

IgE抗体是血清中含量最少的免疫球蛋白，它可与嗜碱性细胞和肥大细胞的细胞膜结合，促使嗜碱性细胞与肥大细胞释放组胺类物质，引起I型超敏反应。血清总IgE和特异性IgE升高对I型超敏反应有重要的诊断价值。

IgD抗体主要出现在B淋巴细胞表面，可能与B细胞的分化或识别有关。IgD抗体在血清中的含量较低，但在一些疾病中病人的IgD抗体会升高，如血清IgD抗体测定（＞2g/L）在临床可作为多发性骨髓瘤的鉴别诊断试验。

抗原是指能刺激机体产生抗体、并能与相应抗体发生结合，或与T淋巴细胞抗原受体结合的物质。免疫原是指能刺激机体发生免疫应答，产生抗体或致敏T淋巴细胞的物质。抗原与免疫原两个概念有时互相混用，但本质上免疫原均是抗原，但抗原不一定是免疫原。抗原或免疫原一般是生物大分子如蛋白质、大分子多糖，少数脂类分子也可作为抗原或免疫原。外来物质之所以能被机体识别为抗原或免疫原，是因为它们的膜上或分子中有多种特殊结构，这些结构称之为抗原决定簇（antigenic determinant）或表位（epitope）。抗原决定簇决定抗原的特异性。

抗原检测在诊断学领域的应用主要有两方面：外来物质的检测和自身抗原的检测，测定外来抗原主要用于病毒、细菌、原虫和真菌感染的实验诊断。随着细菌和真菌培养技术的完善和PCR技术的普及，通过检测抗原诊断细菌和真菌的方法逐渐减少。少数原虫抗原检测在临床诊断还有一定优势，如通过胶体金探针检测疟原虫循环抗原（乳酸脱氢酶）诊断疟疾的阳性率可达90%以上，是诊断疟原虫感染的理想方法。

病毒形态微小，易进入血液，因此抗原检测是病毒感染的重要诊断方法。如人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的p24抗原检测可作为HIV-1抗体不确定个体或处于感染窗口期的辅助诊断方法。检测人白细胞内巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）pp65抗原可早期诊断CMV血症，敏感性高，特异性强。检测乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的表面抗原、核心抗原和e抗原对判断病人HBV感染、治疗及预后等具有重要临床意义。

补体是存在于人和脊椎动物血清、组织液和细胞膜表面的一种不耐热成分，可辅助和补充体内特异性抗体介导的溶菌、溶血等作用，故称为补体。补体并非单一成分，是由30多种可溶性蛋白和膜结合蛋白组成的多分子系统，故也称为补体系统。健康个体的补体含量基本稳定，但在一些疾病状态下，补体的含量和活性会发生改变，因此测定血清总补体活性、单一补体成分、补体裂解产物等均具有重要的临床意义。血清总补体活性的测定可了解补体的整体功能，临床常用的单一补体成分测定包括C3、C4、C2、B因子及C1抑制物等，这些测定可评价机体的免疫状态，一些疾病如组织损伤、感染性疾病、急性炎症、恶性肿瘤等会出现补体活性与含量增高，而一些免疫性疾病如系统性红斑狼疮、自身免疫性溶血性贫血等会出现补体活性与含量降低。Ⅲ型超敏反应如急性肾小球肾炎的发病机制与补体活化产生的C3a和C5a裂解产物有关，测定C3a和C5a有助了解疾病进展。

细胞因子是由巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞或基质细胞产生的小分子分泌蛋白，它可作用于分泌它的细胞，也可作用于旁细胞，还可以内分泌方式作用于远处细胞。依据作用效应，细胞因子可分为趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子等类，它们通过受体而发挥作用，参与抗感染、抗肿瘤、免疫反应、炎症反应等。随着检测技术的发展，细胞因子和受体的检测在临床的应用逐渐增加，如IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、sIL-2R等。一些自身免疫性疾病病人的血清IL-6和IL-8升高，器官移植者发生急性排斥反应时血清sIL-2R较稳定期明显升高。细胞因子的检测还可评估机体的免疫状态，过高或过低的细胞因子水平均预示机体免疫调节的异常。

细胞黏附分子是介导细胞间、细胞与细胞外基质间相互结合的一类糖蛋白分子。细胞黏附分子与受体结合，使细胞间、细胞与基质间发生黏附，参与细胞识别、信号传导，是免疫应答、炎症反应等生理和病理基础。细胞黏附分子水平的改变与自身免疫病、肝脏疾病、肾脏疾病等的发生相关，如系统性红斑狼疮病人血清E-选择素、血管细胞黏附分子-1、细胞间黏附分子-1等均可升高，这几种细胞黏附分子在慢性病毒性肝炎病人中也可升高。

随着化学发光技术、液态芯片技术的发展，许多蛋白质、酶和激素可通过免疫技术而被测定，如肌钙蛋白、肌红蛋白和肌酸激酶质量的测定作为评价心肌损伤的重要标志物，B型利钠肽是诊断心力衰竭的重要标志物。许多具有重要生理功能的激素如垂体激素、性激素、甲状腺激素、甲状旁腺激素、肾上腺激素等都可以通过免疫测定技术进行测定。

治疗性药物浓度和药物滥用的监测均可通过免疫学方法测定。药物的吸收、分布、代谢、排泄因个体而异，即使服用相同剂量的药物，病人血液中活性药物浓度仍存在较大差异，因此对那些毒性较大、又需要足够剂量的治疗药物需进行浓度监测。在临床治疗中需进行浓度监测的药物主要有强心苷类、苯妥英钠类、茶碱类、水杨酸类药物等，这些药物在血液中浓度的测定方法有放射免疫分析、荧光免疫分析、酶增强免疫测定、酶联免疫分析等。海洛因、可卡因、安非他明等非医疗目的的药物滥用是一个重要的社会问题，及时有效的检测对控制这类药物的滥用有重要意义。实际应用中，对海洛因、可卡因、安非他明等药物的检测通常采用胶体金方法，操作简便，能及时获得结果。

免疫复合物是指抗原抗体结合形成的产物，故也称抗原抗体复合物。机体内形成的免疫复合物有两种形式：沉淀于组织或器官的免疫复合物、溶于体液随血液循环至全身组织的免疫复合物。人体内免疫复合物一般会引起病理反应，如研究发现冠心病病人血清脂蛋白（a）、循环免疫复合物水平显著高于正常人群。因此检测可溶性免疫复合物对疾病的诊断和监测有重要意义。

免疫活性细胞指能受抗原刺激产生抗体，或参与细胞介导的免疫反应的细胞，主要包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，其他如K细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等也属于免疫活性细胞。免疫活性细胞的检测既包括细胞数量的检测，又包括细胞活性的检测。通常通过检测免疫细胞的表面标志来评估细胞数量，而免疫活性细胞功能的检测往往更有临床价值。免疫细胞功能的检测因细胞种类不同而异，B细胞功能检测一般是测定其产生的抗体；T细胞、粒细胞、巨噬细胞等细胞的功能测定则多采用体外实验，如植物血凝素刺激T细胞的淋巴母细胞转化试验检测T细胞功能；吞噬和杀菌功能试验检测粒细胞功能。