第三节　酶促反应动力学及影响因素

酶促反应动力学是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。影响因素主要包括底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等。需要强调的是：①在研究某一因素对酶促反应速度的影响时，应该维持反应体系中其他因素不变，而只改变所要研究的因素；②酶促反应速度是采用酶促反应初始时的速度，以避免反应进行过程中因底物的减少或产物的增加等因素对反应速率产生影响。

一、酶浓度对酶促反应速度的影响

在一定的温度和pH条件下，当底物浓度足以使酶饱和的情况下，酶浓度［E］与酶促反应速度（V）成正比关系（图 4-8），其关系式为：V=k［E］。

二、底物浓度对酶促反应速度的影响

（一）米-曼方程式

1913年L.Michaelis和M.Menten在推导底物浓度与反应速度的关系时假设：①测定的反应速度为初速度（initial velocity），即反应刚刚开始，产物的生成量极少，逆反应可不予考虑；②底物浓度（［S］）超过酶的浓度（［E］），［S］的变化在测定初速度的过程中可以忽略不计。在此假设的基础上，他们推导出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米-曼方程式，简称米氏方程式（Michaelis equation）：

式中 Vmax为最大反应速度（maximum velocity）；Km为米氏常数（Michaelis constant），V是在不同［S］时的反应速度。

应用实验方法测得的酶促反应速度对相应的底物浓度作图，得出矩形双曲线（图4-9）与米氏方程式相一致。

从图4-9可知，当底物浓度很低时，增加底物浓度，反应速度随底物浓度的增加而增加，两者呈直线正比关系；当底物浓度较高时，反应速度虽然随着底物浓度的升高而加快，但不再呈正比关系；当底物浓度增高到一定程度时，继续加大底物浓度，反应速度则不再增加，说明酶已被底物所饱和。所有酶均有饱和现象，只是不同的酶达到饱和时所需要的底物浓度不同而已。

（二）Km与Vmax的意义

1.当反应速度为最大速度一半时，米氏方程可以变换如下：

因此，Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。

2.Km值是酶的特征性常数，只与酶的结构、酶所催化的底物和酶促反应条件有关，而与酶的浓度无关。不同的酶作用于同一底物时有不同的Km值；而同一种酶作用于不同底物时，Km值也不同，因此可用Km来判断酶的种类和选择酶的最适底物。

3.在米氏方程式的推导过程中，假设当k2＞＞k3时，即ES解离成E和S的速度大大超过分解成E和P的速度时，k3可以忽略不计，此时的Km值近似于ES的解离常数Ks，可用于表示酶对底物的亲和力。

Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；反之，Km值愈小，酶与底物的亲和力则愈大，此时不需很高的底物浓度便可容易地达到最大反应速度。但是并非在所有的酶促反应中，k3都远小于k2，所以Ks值和Km值的含义不同，不能相互替代使用。

4.最大反应速度Vmax是酶被底物完全饱和时的反应速度，此时反应速度与酶的浓度呈正比而与底物浓度无关。如果酶的总浓度已知，则可以从Vmax值计算出酶的转换数（turnover number）。例如，在1L溶液中，10-6mol的碳酸酐酶每秒钟内可催化生成0.6mol的H2CO3，即平均每1分子酶催化生成6×105个H2CO3分子。

产物生成的速度常数k3称作酶的转换数，即在酶被底物饱和的情况下，单位时间内每个酶分子催化底物转化为产物的分子数。对于生理性底物，大多数酶的转换数在1～104/s。

（三）Km值与Vmax值的求法

底物浓度对酶促反应速度作图的曲线求Km值和Vmax值，只能近似的求出Vmax和Km。因此人们将米氏方程式进行转换，其中应用最多的是将双曲线作图转换为直线的双倒数作图法，即林-贝作图（Lineweaver-Burk plot），将米氏方程式两边取倒数，就得到对应的双倒数方程：

若以1/V对1/［S］作图（图4-10），可得一直线，其纵轴上的截距为1/Vmax，横轴上的截距为-1/Km。此作图除可用于测定酶促反应的最大速度与Km值外，还可用于区分可逆性抑制作用的类型。

三、温度对酶促反应速度的影响

温度升高增加分子的热运动，从而提高反应速度。但由于酶是蛋白质，随着温度的升高，酶逐渐变性失活，使反应速度降低。在酶促反应过程中，温度对酶促反应的双重影响同时存在。在温度较低时，前一种影响较大，反应速度随温度升高而加快，每升高10℃，反应速度平均升高1～2倍；但温度超过一定范围后，酶受热变性的影响占主导地位，反应速度反而随温度上升而减慢。一般来说，温度升高到60℃以上时，大多数酶开始变性；80℃时，多数酶的变性已经不可逆转。酶在某一温度时，其酶促反应速度可达到最大，此时反应体系的温度称为酶的最适温度（optimum temperature）。以酶活性对温度作图，可得一条钟罩形曲线（图4-11）。酶最适温度不是酶的特征性常数，它与酶促反应时间有密切关系。酶可以在较短的时间内耐受较高的温度；相反，延长反应时间，酶最适温度则下降。

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温度在医学中的应用

温度对酶促反应速度的影响具有临床意义。虽然酶在低温下活性降低，但一般不引起酶的变性，温度回升后，酶可恢复其活性。临床上低温麻醉便是利用酶的这一原理，减慢组织细胞的代谢速率，提高机体对氧和营养物质缺乏的耐受力。低温保存菌种也是基于这一原理。酶制剂应在低温下保存，从冰箱取出后应立即应用，以防其因温度升高而变性失活。生化检验测定酶活性时，应严格控制酶促反应溶液的温度，以避免因温度的差异造成测定的误差。临床上进行高温灭菌消毒利用的就是加热使酶变性失活的原理。

四、pH对酶促反应速度的影响

酶、辅酶与底物分子（如ATP、NAD+、辅酶A、氨基酸等）都常含有一些极性基团，在不同的pH条件下其所带的电荷各不相同，呈现出不同的带电状态。酶活性中心的必需基团与辅酶、底物的可解离基团往往仅在某一解离状态时才最容易相互结合，表现出最大的反应活性。因此，环境pH的改变可以通过影响其解离状态来影响酶促反应的速度。酶促反应速度达最大时的环境pH值称作酶的最适pH（optimum pH）（图4-12）。人体内酶的最适pH往往与其所处的环境密切相关，如体液中多数酶的最适pH值接近中性，而胃蛋白酶的最适pH约为1.8，肝精氨酸酶最适pH约为9.8。

最适pH不是酶的特征性常数，它受底物浓度、缓冲液的种类与浓度、酶的纯度等因素的影响。溶液的pH低于或高于酶的最适pH时，酶的活性均降低，远离最适pH时酶可能变性失活。因此，在测定酶的活性时应选择最适pH和具有一定缓冲容量的缓冲液，以保持酶的高活性和相对稳定性。在提取和纯化酶时，应避免应用pH过高或过低的溶液，以防止酶的变性。

五、抑制剂对反应速度的影响

凡能使酶的活性降低或丧失而不引起酶蛋白变性的物质统称酶的抑制剂（inhibitor）。但引起酶蛋白变性使酶活性丧失的化学因素不属于抑制剂的范畴。根据抑制剂与酶作用的机制不同，通常将抑制作用分为不可逆性抑制和可逆性抑制两大类。

（一）不可逆性抑制作用

这类抑制剂与酶分子上的化学基团以共价键的方式结合，其抑制作用不能用透析、超滤等物理的方法解除，这种抑制称为不可逆抑制作用（irreversible inhibition）。在临床上这种抑制作用可以通过特异性的化学药物解除抑制，使酶恢复活性。

按抑制剂对酶必需基团选择程度不同，不可逆性抑制作用又可分为专一性和非专一性抑制两种。

1.专一性抑制

抑制剂专一性地作用于酶活性中心的必需基团而使酶活性受到抑制。例如，有机磷农药能特异性地与胆碱酯酶活性中心丝氨酸的羟基结合，使酶失活。当胆碱酯酶被有机磷农药抑制后，胆碱能神经末梢分泌的乙酰胆碱不能及时分解，过多的乙酰胆碱导致胆碱能神经过度兴奋，人体产生一系列中毒的症状。解磷定（PAM）可与有机磷化合物结合成稳定的复合物，从而解除有机磷化合物对羟基酶的抑制作用（图 4-13）。

2.非专一性抑制

抑制剂与酶分子上的某些基团结合而抑制酶的活性。与抑制剂结合的基团可位于活性中心内或活性中心外。如对氯汞苯甲酸、路易士气、重金属离子Ag+、Pb2+、Hg2+、Cu2+等均属于此类抑制剂。化学毒剂“路易士气”是一种含砷的化合物，它能非专一性地抑制巯基酶的活性，临床上对路易士气中毒可用二巯基丙醇（British anti-Lewisite，BAL）解救。

（二）可逆性抑制作用

抑制剂通过非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶活性受到抑制，这种抑制作用称为可逆性抑制作用（reversible inhibition）。由于抑制剂和酶或酶-底物复合物的结合较为疏松，可采用透析或超滤等物理方法将抑制剂除去，使酶的活性得以恢复。可逆性抑制作用常见以下三种类型：

1.竞争性抑制作用

抑制剂与酶作用的底物结构相似，可与底物共同竞争酶的活性中心，从而阻碍酶与底物的有效结合，这种抑制作用称为竞争性抑制作用（competitive inhibition）。由于底物、抑制剂与酶的结合均是可逆的，竞争性抑制的抑制强度取决于抑制剂与酶的相对亲和力，以及与底物相对的浓度比率。

丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用是竞争性抑制作用的典型代表，丙二酸对酶的亲和力远大于琥珀酸。当丙二酸的浓度仅为琥珀酸浓度的1/50时，酶的活性却被抑制50%。增大琥珀酸的浓度则抑制作用减弱。

从竞争性抑制作用的反应式可知，酶与抑制剂结合形成的复合物EI不能再与底物结合。ki是EI的解离常数，这里称为抑制常数。竞争性抑制作用的速度方程式是：

其双倒数方程式为：

有不同浓度抑制剂存在时，以1/V对1/ ［S］作图（图4-14），得出具有不同斜率的直线图形。从图中可见，有竞争性抑制剂存在时，横轴截距的“Km”值（称表观Km值）随抑制剂浓度的增加而增大；而在纵轴上截距均交于一点，与无抑制剂时一致，说明不同浓度的竞争性抑制剂并不改变酶促反应的最大速度。

竞争性抑制作用有以下特点：①抑制剂结构与底物相似；②抑制剂结合的部位是酶的活性中心；③抑制作用的大小取决于抑制剂与底物的相对浓度，在抑制剂浓度不变时，通过增加底物浓度可以减弱甚至解除竞争性抑制作用；④按米氏方程的推导，当有竞争性抑制剂存在时，Vmax不变，Km增大。

很多药物都是通过竞争性抑制作用的原理来发挥作用的。磺胺类药物是典型的竞争性抑制剂。对磺胺类药物敏感的细菌在生长繁殖时，不能直接利用环境中的叶酸，而必须在二氢叶酸合成酶的作用下，利用对氨基苯甲酸、二氢蝶呤及谷氨酸合成二氢叶酸，后者再转变为四氢叶酸，四氢叶酸是一碳单位的载体，是细菌合成核酸所不可缺少的辅酶。磺胺药的化学结构与对氨基苯甲酸十分相似，故能与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶的活性中心，使该酶的活性受到抑制，进而减少四氢叶酸和核酸的合成，最终导致细菌生长繁殖停止。根据竞争性抑制作用的特点，在临床上使用磺胺类药物时，首次剂量要加倍并必须保持血液中较高的药物浓度，以发挥有效的抑菌作用。

另外，许多抗癌药物，如甲氨蝶呤（MTX）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、6-巯基嘌呤（6-MP）等抗代谢物也是利用酶竞争性抑制作用来达到抑制肿瘤生长的目的。

2.非竞争性抑制作用

非竞争性抑制剂（I）与酶活性中心以外的部位结合，改变酶的空间构象，导致酶催化活性下降。抑制剂可以和酶结合形成EI，也可以和ES复合物结合形成ESI，酶、底物的结合与酶、抑制剂的结合互不影响，无竞争关系。然而，生成的酶-底物-抑制剂复合物不能解离出产物从而使酶催化作用受到抑制，这种抑制作用称为非竞争性抑制作用（non-competitive inhibition）。其反应式如下：

按米氏方程式的推导方法，非竞争性抑制剂作用的双倒数方程式如下：

若在不同抑制剂浓度的情况下，以1/V对1/［S］作图，也得到斜率不同的直线图形（见图4-14）。从纵轴截距看，反应的最大速度随抑制剂浓度的增加而减小。而横轴截距表示，非竞争性抑制作用的抑制剂不改变酶促反应的表观Km值，即不影响酶对底物的亲和力。

非竞争性抑制作用的特点是：①抑制剂与底物结构不相似；②抑制剂结合的部位是酶活性中心外；③抑制作用的强弱只取决于抑制剂的浓度，此种抑制不能通过增加底物浓度而减弱或消除；④按米氏方程的推导，当有非竞争性抑制剂存在时，Vmax下降，Km不变。

3.反竞争性抑制作用

有的抑制剂仅能可逆地与酶-底物复合物相结合，所生成的三元复合物不能分解出产物。这样，抑制剂既减少从中间产物转化为产物的量，也减少从中间产物解离出游离酶和底物的量，从而发挥抑制酶活性的作用。这种抑制作用称为反竞争性抑制作用（uncompetitive inhibition）。其反应式如下：

其双倒数方程式是：

从1/V对1/［S］作图（见图4-14）可知，不同浓度的抑制剂均不改变直线的斜率，但其表观Km和Vmax均降低。

反竞争性抑制作用的特点是：①抑制剂与底物结构不相似；②抑制剂只能与酶-底物复合物（ES）结合；③抑制作用的强弱取决于抑制剂的浓度，此种抑制不能通过增加底物浓度而减弱或消除；④按米氏方程的推导，当有反竞争性抑制剂存在时，Vmax下降，Km减小。

现将三类可逆性抑制作用的主要特点归纳如表4-4。

六、激活剂对反应速度的影响

凡能使酶从无活性变为有活性或使酶从低活性变为高活性的物质统称为酶的激活剂（activator）。从化学本质看，酶的激活剂包括无机离子和小分子有机物。如Mg2+、Mn2+、K+、Cl-及胆汁酸盐等。按激活剂对酶的影响程度不同，可将酶的激活剂分为必需激活剂和非必需激活剂两大类。大多数金属离子激活剂对酶促反应不可缺少，称必需激活剂，如Mg2+是己糖激酶等多种激酶的必需激活剂，Mg2+与底物ATP结合成Mg2+-ATP复合物，后者作为酶的真正底物参加反应，缺乏Mg2+时，酶将不表现出活性。有些激活剂不存在时，酶仍有一定活性，这类激活剂称非必需激活剂，如Cl-是唾液淀粉酶的非必需激活剂。