第三节　真菌感染性疾病的实验诊断方法

真菌（fungus）是真核细胞型微生物。约有20多万种，其中仅有约150种左右对人和动物致病，可分为病原性真菌、条件致病性真菌、产毒真菌和致癌真菌等。近年来条件致病性真菌感染更为常见，与滥用抗生素、激素和免疫抑制剂大量使用、机体免疫缺陷有关。

根据真菌的形态可分为单细胞和多细胞真菌两大类。单细胞真菌呈圆形或卵圆形，以出芽方式繁殖，如酵母菌和类酵母菌，对人致病的主要有新型隐球菌和白假丝酵母菌。多细胞真菌有菌丝和孢子，又称霉菌，对人致病的主要有皮肤癣菌。还有一些真菌随着环境条件的变化可在酵母型和霉菌型之间进行转变，称为二相性真菌。

一、标本的采集

1.无菌采集，在采集局部进行消毒处理，采集的标本应放入无菌容器中。

2.使用抗真菌药物前采集。采集后立即送检。

3.根据不同真菌感染采集不同标本。怀疑为深部真菌感染时应采集血液、脑脊液、痰液、脓液等标本。浅部感染如体癣，应刮取病变边缘的皮屑、痂等。头癣应取病变头发等。活组织检查应采集双份，一份送病理检查，一份做培养检查。

二、直接检查

是最简单而重要方法，浅部感染真菌的病变标本如毛发、皮屑、甲屑置玻片上，滴加10%KOH，覆盖玻片并微微加热熔化角质层，使标本组织透明，在显微镜下观察，可见皮屑、甲屑中有菌丝，或毛发内部或外部有成串孢子，即可初步诊断为癣菌感染，但不能确定菌种。深部感染真菌标本如痰、脑脊液涂片用革兰染色或墨汁负染色观察形态特征，可以诊断真菌感染。常用的染色方法包括乳酸酚棉蓝染色、革兰染色、瑞氏染色、荧光染色及墨汁负染等。

三、培养检查

通常用葡萄糖蛋白胨琼脂（沙保弱，Sabourand）培养基，深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37℃培养，或根据不同菌种运用不同培养基，如孢子丝菌可用胱氨酸血液葡萄糖琼脂。为了有效抑制细菌的生长，在培养基中加入一些抗生素。培养的方法有平皿培养法、大试管培养法和玻片培养法（小培养）等方法，大多数真菌的培养温度为28℃，深部真菌为37℃。菌种的鉴定需运用鉴别培养基和生化反应，同化试验以及分子生物学技术等进行鉴定。

四、免疫学试验

近年来有许多方法用于检测深部感染真菌的抗体，作辅助诊断荚膜组织胞浆菌、假丝酵母菌、曲霉菌。但系统性感染患者常因免疫功能降低不出现抗体；而且许多真菌间抗原性有交叉反应；有的产生抗体后维持时间较长，正常人群中有一定比例的阳性率，则必须结合临床情况分析结果才能作出恰当的诊断。用免疫学方法检测血清或其他部位真菌抗原，对早期诊断具有重要意义。如乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原，ELISA法检测白假丝酵母菌感染者的甘露聚糖抗原及免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶性抗原等。

五、动物实验

其些真菌对实验动物有致病性，如皮炎芽生菌，球孢子菌可在小白鼠、豚鼠体内生长，白假丝酵母菌接种家兔小白鼠可发生肾脏脓肿致死。常用的实验动物有家兔、豚鼠、小白鼠、大白鼠等。常用的接种途径有皮肤、皮下、腹腔、静脉、睾丸、颅内接种等方式，不同的真菌接种方式不同，如隐球菌做小白鼠颅内接种，白假丝酵母菌作家兔耳静脉接种等。荚膜组织胞浆菌和皮炎芽生菌必须在生物安全Ⅲ级以上实验室才能进行。