第二节　病毒感染性疾病的实验诊断方法

病毒性疾病实验诊断应首先根据临床特征和流行病学资料，初步判断可能感染的病毒。然后根据可疑病毒的生物学特点、机体免疫应答和临床过程，结合患者当前所处的时机，确定实验诊断的方法。有些病毒感染潜伏期较短，发病时机体免疫系统应答尚未完全，没有抗体产生，因此可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或病毒核酸。对于潜伏期超过10天的病毒感染，可检测特异性的IgM抗体来进行早期快速诊断、区别初次和再次感染。对可在机体内形成持续感染或潜伏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG抗体滴度有无4倍以上升高，或直接检测病毒核酸。对原因不明，可能有新病毒感染时，应采集相应部位的标本进行病毒分离，同时应采取双份血清以确认分离的病毒为病原病毒。对同一症状可由多种病毒引起的情况，应同时检测几种相关病毒的病毒颗粒、抗原或抗体，对由多个型别组成的病毒可测定它们的共同抗原。病毒感染的实验室检查包括病毒分离与鉴定、病毒核酸与抗原的直接检出以及特异性抗体的检测。

一、标本的采集与送检

临床医师根据流行病学资料，疾病的症状与体征综合判断可能为何种病毒感染，留取适宜的标本送检。实验结果对诊断病毒感染的价值，很大程度上取决于标本的采集和处理的方式是否恰当合理。正确采取标本，及时运送和处理，是极为重要的。

尽可能在发病的初期，急性期或患者入院的当天进行。疾病后期由于机体产生免疫力，开始清除病毒，使病毒数量减少或消失，不易检出。

根据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感染病毒种类，选择相应部位采取标本。处理标本时要考虑病毒的生物学特性，如有包膜病毒冻融易被灭活。某些病毒如麻疹病毒吸附在白细胞上，为了有效分离病毒，血液标本应加抗凝剂。

可采取咽拭子、粪便、心脏组织或心包液标本。分离相关的肠道病毒，包括埃可病毒、柯萨奇A组和B组病毒，也可采取血液标本进行血清学诊断。

可采取咽拭子、粪便标本、脑脊液标本进行肠道病毒的分离；采取咽拭子、脑膜组织分离单纯疱疹病毒，亦可采取脑脊液进行PCR检查；采取咽拭子，尿液、脑脊液或唾液标本用于分离腮腺炎病毒。另外，虫媒病毒、人类免疫缺陷病毒、麻疹病毒、狂犬病毒等也可引起中枢神经系统的感染，可通过血清学或测定抗原、核酸来诊断。应在入院时采取第1次血标本5～10ml，第2次在2～3周后或出院前采取，用于双份血清学诊断。

采取喉拭子、尿液分离人类巨细胞病毒，血清学方法测定IgM有助于诊断；采取喉拭子、皮肤、尿液、脑脊液、粪便或直肠拭子分离肠道病毒；采用喉拭子、皮损、尿液标本分离HSV，脑脊液标本用于PCR测定，皮损标本亦可用直接荧光抗体测定，测定血清中IgM有助于诊断。采集喉拭子、皮损等标本用于分离带状疱疹病毒。HBV、HIV和微小病毒B19也可引起宫内感染，可以进行血清学诊断。

采取粪便标本或直肠拭子用于腺病毒40/41和轮状病毒的分离。

采取咽、喉拭子，分离腺病毒、肠道病毒、流行性感冒病毒、副流感病毒、呼吸道病毒、鼻病毒等。

以无菌手续抽取抗凝血10ml，抗凝剂可选用100U/ml肝素钠。常用于分离CMV和HSV，亦可用于虫媒病毒、EBV、HIV-1及新生儿肠道病毒的分离。为了血清学检查的需要，应抽取另一管5ml血液，不抗凝送检。

以无菌手续抽取脑脊液1～2ml，置无菌试管内，置冰浴中立即送检，在4℃可存放72小时。常用于分离柯萨奇病毒、ECHO病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒等。

采取病灶部位分泌物，将拭子置运送液中；如无病损部位，则清理宫颈口黏液，将拭子伸入宫颈约1cm处停留5秒以上取出，置运送液中4℃冰浴立即送检。常用于HSV、CMV的分离。

取2～4克粪便标本在无菌的容器中，加8～10ml运送液立即送检，常用于腺病毒、肠道病毒的分离，亦用于轮状病毒的分离及抗原检测。

可用无菌生理盐水，让患者含漱几次取得，与运送液等量混合。用于分离流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV等。

使用压舌板充分暴露，避免唾液污染，用生理盐水湿润的拭子采取咽喉部表面，置运送液中。常用于分离腺病毒、CMV、肠道病毒、HSV、流感病毒等。

尿道拭子伸入尿道4cm轻轻转动2～3次，以获得较多的上皮细胞，取出后置运送液中送检，常用于分离CMV和HSV。

应在死亡后尽早采取，采集各种器官时要分开使用器械和容器。已用甲醛溶液固定或石蜡已包埋的组织块可用于免疫组化、核酸杂交和PCR检测。

病毒的抵抗力通常较弱，在室温中容易灭活，因此用于分离培养病毒的标本要尽快送到实验室处理和接种。如不能及送检，可在4℃环境下冷藏数小时。如需较长时间保存则应置-70℃。放置-20℃，病毒容易灭活，在冻存液中需加入甘油或二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）等作保护，防止反复冻融使病毒灭活。

为了预防标本在运送过程中干涸，保持病毒的原始特征，防止标本中污染的细菌过速生长，通常使用病毒传送培养基。许多病毒传送培养基（virus transport media，VTM）配方都以Eagles液或Hanks盐平衡溶液为基础添加灭活的小牛血清或牛血清白蛋白。为了有效抑制细菌生长通常在VTM中加入抗生素如青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml，为了抑制真菌的生长加入2.5μg/ml两性霉素B或40μg/ml制霉菌素。

检测特异性抗体需要采取急性期与恢复期双份血清，第一份尽可能在发病后立即采取，-20℃保存，第二份在发病后2～3周采取。试验前血清标本以56℃30分钟处理去除非特异性物质及补体。无菌性脑膜炎患者也可取脑脊液检测特异性IgM。

二、病毒的分离与鉴定

病毒分离的一般程序是：采集标本→杀灭杂菌（青、链霉素）→接种易感的动物或鸡胚、细胞培养→出现病变或死亡→鉴定病毒种型（血清学方法）。

无菌标本（脑脊液、血液、血浆、血清）可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗涤后制成10%～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿液、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。

用分散的活细胞培养称细胞培养（cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养包括原代细胞培养、二倍体细胞培养和传代细胞培养等。

用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1～2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞即原代细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。因原代细胞不能持续传代培养，故通常不用于实验诊断。

原代细胞大多只能传2～3代细胞就退化了，但少数细胞能继续传代并保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细胞生长迅速，并可传40～50代。通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗，也用于病毒的实验室诊断工作。

通常是由癌细胞或二倍体细胞突变而来（如HeLa、HEp-2、Vero细胞系等），染色体数为非整倍体，细胞生长迅速，可无限传代，在液氮中能长期保存。目前广泛用于病毒的实验室诊断工作，根据病毒对细胞的亲嗜性，选择敏感的细胞系使用。

此外，淋巴细胞培养也应用在病毒的研究和诊断中，如HIV病毒的研究。

这是最原始的病毒分离培养方法。常用小白鼠、豚鼠、家兔、猴及猩猩等。根据各病毒对组织的亲嗜性选择接种途径，可接种鼻内、皮内、脑内、皮下、腹腔或静脉等，例如嗜神经病毒（脑炎病毒）接种鼠脑内，柯萨奇病毒接种乳鼠（1周龄）腹腔或脑内。接种后逐日观察实验动物发病情况，如有死亡，则取病变组织剪碎，研磨均匀，制成悬液，接种细胞培养或继续接种动物传代，并作鉴定。动物接种可受到动物机体的影响，如动物已受到过某种病原体的感染已经出现抵抗力，导致接种的病原体不出现阳性反应。

受精孵化的活鸡胚是一个完整的动物体。培养病毒比用动物更加经济简便。根据病毒的特性可分别接种在鸡胚绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黄囊，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分离培养。但很多病毒不适合在鸡胚中生长。

病毒在细胞内增殖引起细胞退行性变，表现为细胞皱缩、变圆、出现空泡、死亡和脱落的现象称为细胞致病作用（cytopathogenic effect，CPE）。某些病毒在普通光学倒置显微镜下可观察到特征性的CPE，结合临床表现可作出预测性诊断。结合特异性抗体免疫荧光（IF）法在荧光显微镜下可见细胞内的病毒或抗原可被荧光素标记的特异性抗体着色呈现斑点状黄绿色荧光。用于鉴定病毒具有快速、特异的优点。

某些病毒如流感病毒和某些副黏病毒感染细胞后24～48小时，在细胞膜上出现病毒的血凝素，能吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细胞，出现红细胞吸附现象（Hemadsorption phenomenon）。若加入相应的抗血清，中和病毒血凝素后，再加入红细胞则不出现红细胞吸附现象，称为红细胞吸附抑制试验。这一现象不仅可作为这类病毒增殖的指征，还可作为初步鉴定。

当两种病毒同时或先后感染同一细胞时，可发生一种病毒干扰另一种病毒在该细胞中的增殖，这种现象叫干扰现象（interference phenomenon）。前者为不产生CPE的病毒（如风疹病毒）但能干扰以后进入的病毒（如ECHO病毒）增殖，使后者进入宿主细胞不再产生CPE。

这是一种测定病毒感染数量较为准确的方法。将适当浓度的病毒悬液接种到生长单层细胞的培养瓶中。当病毒在细胞内复制增殖后，每一个感染性病毒颗粒在单层细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大，若用中性红等活性染料着色，在红色的背景中可见没有着色的“空斑”。由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的滴度可以用每毫升空斑形成单位（plaque-forming unit，PFU）来表示。该方法仅适用于能产生CPE效应的病毒。

本法可估计所含病毒的感染量，是指病毒感染细胞或组织后引起50%发生死亡或病变的最小病毒量。该方法是将病毒悬液作10倍连续稀释，感染鸡胚、易感动物或组织细胞，经一定时间培养后，观察细胞或鸡胚病变，或易感动物发病而死亡等情况，经统计学方法计算出50%感染量或50%组织细胞感染量，可获得比较准确的病毒感染性滴度。

病毒悬液经高度浓缩和纯化后，借助磷钨酸负染及电子显微镜可直接观察到病毒颗粒，根据大小、形态可初步判断病毒属哪一科。还可用分子生物学技术分析病毒核酸组成、基因组织构成、序列同源性比较加以鉴定。

用已知的诊断血清来鉴定。补体结合试验可鉴定病毒科、属；中和试验或血凝抑制试验可鉴定病毒种、型及亚型。

三、病毒核酸及抗原的直接检出

病毒的核酸携带了病毒的全部遗传信息。无论病毒是以前病毒的形式，还是完整病毒体，在细胞内或游离于细胞外，只要有完整的特异基因核酸存在，检测病毒特异基因就可以确认有病毒的存在。常用的诊断技术有以下几种：

将待测的DNA或RNA直接点在杂交滤膜上，变性后，用地高辛、生物素等标记的核酸探针进行杂交。然后采用酶反应或酶免疫技术进行检测，已被越来越多的实验室广泛使用。固相杂交技术将核酸探针进行修饰后，包被在固相材料微孔板中，加入待测的核酸序列和标记的指示探针在微孔板的杂交液中，进行杂交，洗涤后，用酶免疫技术进行检测。或将核酸探针包被于微粒磁珠表面，悬浮于杂交液中。与待测的核酸序列及标记的指示探针进行杂交。用磁分离技术分离结合有杂交体的磁珠，进行检测。

将细胞固定后，在不破坏细胞结构的前提下，在细胞原位释放暴露DNA或RNA，加入标记的特异核酸探针，进行杂交显色后，可以显示特定的杂交探针在细胞内的位置和核酸的数量。直接观察待测核酸在细胞内的分布状态与细胞染色体的关系，是核酸杂交技术结合细胞学技术的一种特殊检测技术。

Southern印迹法用于DNA的杂交。将DNA提取后，直接或经限制性内切酶切割后，在琼脂糖电泳中使DNA按分子量大小分开，然后将琼脂糖凝胶中的DNA移至硝酸纤维膜上，用标记探针进行杂交。可以观察病毒DNA的片段大小及限制性内切酶长度多态性分析。Nothern印迹法用于RNA杂交分析。将琼脂糖电泳后的RNA移至DBM膜上，用标记探针进行杂交。

选择病毒的特异、保守片段作为靶基因进行引物设计和扩增可诊断病毒性感染。选择病毒的易变区，结合RFLP，测序等技术可以对病毒进行分型和突变的研究。DNA病毒可直接进行PCR扩增其特异片段。RNA病毒可通过RT-PCR技术，将RNA逆转录为cDNA，再进行PCR扩增，常结合巢式PCR（nest-PCR）技术进行二次扩增，提高了反应的灵敏度和特异性。

PCR技术是以指数方式对靶基因进行扩增。采用内标准对扩增的产物进行原始标本定量，对病毒感染的诊断起到了量化的作用，如对HBV-DNA的定量测定可以观察抗病毒治疗的效果；对HIV的定量测定可以指导抗病毒治疗方案的制订等。同时，对研究病毒和机体之间的关系提供了参考。采用磁珠法提取DNA，使定量PCR的敏感性和重复性得到了大幅度的提高，对含量较低的标本也能进行定量检测。

有些病毒如轮状病毒的核酸具有典型的分节段特点。可以从标本中直接提取轮状病毒的核酸。通过琼脂糖凝胶电泳，观察其特有的11个节段的存在分布情况，进行诊断。

根据标记的方式不同分为直接和间接免疫荧光技术。直接免疫荧光技术是用荧光素直接标记特异性抗体，检测病毒抗原；间接免疫荧光技术是先用特异性抗体与标本中抗原结合，再用荧光素标记的抗体与特异性抗体结合，从而间接识别抗原，具有放大作用。通过荧光抗体染色在荧光显微镜下检测咽喉脱落细胞中呼吸道合胞病毒、流感及副流感病毒抗原；取病灶刮片或脑活检标本，检测单纯疱疹病毒抗原；取尿沉渣检测巨细胞病毒抗原等。由于单克隆抗体的广泛使用，检测的灵敏度和准确性明显提高。

原理与应用范围与免疫荧光技术相同，用酶（通常是过氧化物酶）取代荧光素标记抗体，酶催化底物形成有色产物，不需荧光显微镜，在普通光学显微镜下清晰可见。

有竞争法和固相法2种方法。用于测定粪便中甲肝病毒、轮状病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原等。由于放射线的问题，目前已大部分被发光免疫分析技术所替代。

先将特异性抗体包被（吸附）到塑料微培板孔中以捕捉标本中相应抗原，然后加入酶标特异性抗体，相应抗原被夹在抗体之间，当加入酶的底物后显色，显色程度直接反映了标本中病毒抗原的存在。由于技术误差较大，不适用于定量分析。

此外，对难以分离培养，形态特殊且病毒数量较多的标本，可用电镜或免疫电镜法直接观察，是一种快速诊断与鉴定病毒的方法，如轮状病毒、乙肝病毒。

四、特异性抗体的检测

病毒感染后通常诱发针对病毒一种或多种抗原免疫应答，特异性抗体滴度升高或IgM抗体出现有辅助临床诊断的价值。可用补体结合试验测定补体结合抗体；中和试验测定血清的中和抗体。诊断病毒性疾病时，须取患者双份血清同时做对比试验，恢复期血清的抗体滴度必须超过病初血清抗体4倍以上，才能确诊。病毒中和抗体的特异性高，持续时间久，以往受显性或隐性感染后，血中可长期存在中和抗体，所以适用于流行病学调查或人群免疫水平研究，但因试验方法繁杂，一般不作常规使用。血凝抑制试验测定血凝素抗体，若双份血清有≥4倍以上滴度增高，也可用于诊断具有血凝素的病毒感染如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等。本法简便、快速、经济、特异性高，常用于流行病学调查等。

特异性IgM出现于病毒感染的早期或病毒感染的活动期，因此可从急性期患者单份血清中检出特异性IgM，这是病毒感染实验室早期诊断的可靠方法，现已广泛用于病毒病的早期诊断，如测定甲型肝炎病毒感染后的抗甲型肝炎病毒IgM抗体可以明确诊断。因IgM不能通过胎盘，新生儿血清中发现抗病毒IgM提示为宫内感染。

五、病毒检验的结果评价

通过实验手段，从标本中获得有关病毒感染的证据，从而确定病毒感染和临床疾病之间的因果关系，是病毒实验诊断的目标。通过分离和鉴定获得致病性病毒，发现病毒感染的特异性改变，如机体内产生特异性抗体、细胞内包涵体的形成等，即说明有病毒感染的存在。由于各种病毒感染在不同机体内导致的结局差别很大，因此感染病毒的临床意义必须结合流行病学资料、临床表现、病毒种类及机体的病理变化作综合分析才能判定。

对于一些引起急性感染性疾病的病毒而言，在疾病流行季节从人体内各种组织、脑脊液、血液、水疱液中分离到的病毒的致病特征，与患者的临床特征相符时，可作出病原学诊断；或患者急性期和恢复期双份血清中相应的特异性抗体滴度有4倍以上的升高，也可得出病原学诊断，如乙型流行性脑炎病毒、出血热病毒等。从呼吸道分离到的流行性感冒病毒，副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒和呼吸道合胞病毒等病毒，由于感染后通常都为急性发病，很少有无症状携带者和长期排毒现象，因而具有临床诊断意义。

巨细胞病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒等病毒，虽然分离到了病毒，但与临床症状并不一定密切相关，则需考虑健康带毒、隐性感染、混合感染和持续状态感染等情况。可寻求血清学特异性抗体滴度是否升高来帮助诊断。

临床上疑为病毒感染，而分离培养阴性，在确认标本采集正确、无污染，并采用了敏感的细胞株，而且通过可靠的识别方法确认无病毒存在。则可排除可疑病毒感染的可能性。如果可疑病毒为无法培养或难以分离的病毒，则不能排除感染的可能性，可采用血清学检查特异性抗体以助诊断。

急性期和恢复期双份血清的总抗体滴度如有4倍以上的升高，有助于明确诊断，但不适合于早期诊断。IgM抗体的测定有助于早期诊断，但在感染的早期机体产生IgM有明显的个体差异，如腮腺炎患者发病3日内有部分患者血清中无特异性IgM抗体；仅有45%的风疹患者在出疹后第一天特异性IgM抗体阳性。此外，有少数患者产生的特异性IgM抗体可持续1～2年。在评价IgM抗体检查的可靠性方面需引起注意。免疫缺陷的患者、局部感染、多种血清型病毒引起的感染，特异性抗体检查可能为阴性。

分子生物学诊断是通过测定病毒核酸而实现的，利用southern杂交可根据病毒核酸分子量的大小观察整合型和游离型病毒。PCR方法有极高的灵敏度，但仍然有假阳性。另外检出病毒核酸并不等于检出具有传染性的病毒颗粒，其临床意义有待进一步确认。