第三节　中药药动学研究

中药药动学作为中药药理学的分支学科，是在探索、实践的基础上经过不断积累和发展逐渐形成的。中药及其复方由于成分繁多或有效成分不明或缺乏定量检测手段，且干扰因素多，曾一度认为中药复方有效成分药代动力学研究难以进行。由于药效的变化取决于体内药量的变化，因此可以通过测定药效的经时过程来间接反映体内药量的动态变化。基于此原理，1970年后出现了通过测定生物效应进行药代动力学研究的方法。1985年后日本学者建立了测定方剂给药后体内有效成分浓度的方法。近年来这方面的研究十分活跃，有学者提出了“复方效应成分动力学”“中药复方指征药物代谢动力学”等概念。归纳起来，中药药动学研究主要有以下几种方法。

一、中药体内过程研究方法

1.吸收研究方法　中药大多经口服给药，胃肠道是主要的吸收途径，研究胃肠道吸收特性的方法有很多种，包括在体肠回流法、在体肠灌流法、外翻肠囊法、肠襻法、分离肠黏膜法、Caco-2细胞模型法等，这些方法的特点分述如下。

（1）在体肠回流法　主要用于中药有效成分单体的吸收研究。动物经麻醉后向肠腔插管，用泵循环构成回路，使药物在肠腔内循环灌流，定时测定流出液中药物浓度的变化，求出药物吸收量；同时通过肠系膜静脉取血样，测定吸收入血的药量。该方法可以在不同时间测定灌注液内药物的浓度变化，获得药物透过肠上皮细胞的情况。如对川芎嗪吸收特性的研究结果表明，其在结肠以上部位吸收良好，吸收窗较长，可以减少剂型设计的盲目性。但该方法容易将药物浓度变化误认为是药物吸收，且药物只能以液态进行实验，不适合于缓释、控释制剂的研究。

（2）在体肠灌流法　本方法和在体肠回流法相似，是目前运用最广泛的方法，国外采用最多的是单向灌流法，国内比较倾向于使用循环灌流法。该法是一种较好的研究肠吸收的方法。利用该方法不仅可以判断药物吸收的方式，还可以求出药物吸收的动力学参数。

（3）外翻肠囊法　动物麻醉后取出肠段并外翻，置于营养液中，定时在肠管内外两侧取样。本法是一种简单有效的初步研究肠吸收的方法，也是用于研究生物膜转运机制的方法。外翻肠囊法的优点是能观察药物透过肠壁的浓度，但无法计算较详尽的吸收动力学参数，并且肠囊在体外环境与体内环境有较大差异，因此不能仅以该方法判断药物的吸收情况。

（4）肠襻法　在体肠回流的基础上，增加肠系膜血管插管收集血样品。本方法操作简单，可分析药物吸收入血的情况，测定药物剩余量，但由于肠腔内容物存在，样品处理较复杂。所以不适合大规模的药物吸收评价。

（5）分离肠黏膜法　动物麻醉后取出肠管，分离肠黏膜并固定于扩散池上，用于分析药物透过上皮细胞的情况。该方法由于黏膜易破损，使分离操作困难。但此法干扰因素少，快速准确，精度高，适于进行吸收机制的分析。

（6）Caco-2细胞模型法　本法是1989年提出用于肠吸收研究的体外细胞模型，Caco-2细胞的结构和生化作用类似于人小肠上皮癌细胞，可作为研究小肠表皮细胞药物转运和代谢的体外模型，也是目前研究药物吸收最适合的模型。该方法具有快速、适于大量筛选、易于控制、干扰小、可持续检测、规律性强、接近肠道环境等优点。但对供试样品的要求较高，不能代替整体动物实验。

2.分布研究方法　通过在给药后的吸收相、平衡相、分布相和消除相测定动物各组织脏器的药物浓度，可以了解药物在体内的主要分布组织、浓集组织、蓄积时间长的组织和器官及在药效或毒性靶器官的分布情况，从而阐明药物的分布规律。如研究马钱子体内的分布实验中，对小白鼠采用灌胃和腹腔注射两种方法，取不同时间的血液、心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉等组织和器官，采用双波长紫外分光光度法检测士的宁的含量，结果表明，组织器官中士的宁的分布首位是心，其次为肾、肺、脑、肝、肌肉、脾，最后为血液。

3.代谢研究方法　中药在体内所发生的化学变化，常常使药物灭活，但也有部分是代谢活化或代谢物仍具药理活性。因此对药物代谢规律进行研究，有助于提高疗效，减少不良反应。研究方法包括体内代谢研究方法和体外代谢研究方法。

（1）体内代谢研究方法　中药给药后，可对整体动物的血、尿、粪或胆汁等体液或组织进行分析，一般先用HPLC法，在样品广泛的色谱峰中寻找可能的代谢物，再用紫外、红外、质谱、核磁共振等方法对有效成分的代谢物进行分析，阐明代谢物的结构，推断可能的代谢途径。

（2）体外代谢研究方法　与体内代谢研究相比，体外代谢研究有很多优点。一是可以排除体内研究时诸多因素的干扰，直接观察到代谢酶对底物的选择性代谢，为体内代谢研究提供依据。二是对于体内代谢转化率低，且缺乏灵敏检测方法的药物来说，体外代谢不失为一种很好的研究手段。三是具有快速简便的特点，适合于大批量中药化合物的药代动力学研究。四是不需要消耗大量的样品和实验动物，研究费用相对较低。但体外代谢研究也存在不足之处，如可能与体内代谢情况不完全一致，因此体外代谢研究无法代替体内代谢研究，两者相辅相成。肝脏是中药代谢的主要场所，涉及的代谢系统主要是细胞色素（cytochrome，Cyt）P450混合功能氧化酶系统。大多数药物的Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应都是在肝药酶系统的参与下发生的，因此药物的体外代谢模型主要是以肝脏为基础，并以其特有的优势和特点在药物代谢的研究中得到广泛应用。常用的体外肝代谢模型有以下几种。

肝微粒体体外温孵法：制备肝微粒体，辅以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）再生系统，在体外模拟生理环境条件进行代谢反应，经过一定时间反应后，采用HPLC、HPLC-MS和HPLC-MS/MS测定温孵液中原形药物和其代谢产物，并对代谢产物进行初步分析和鉴定。该方法主要用于药物代谢产物的结构鉴定和代谢途径研究，预测药物体内代谢清除率、药物代谢的种属和性别差异、对药酶的影响、药物代谢的相互作用等。与其他体外肝代谢方法相比，具有酶制备技术简单、代谢过程快、结果重现性好、易于大批量操作、便于收集和积累代谢样品等特点。但所得结果可能与体内代谢的不一致，一般仅用于预测体内代谢情况，尚需体内代谢研究的进一步证实。

重组P450酶体外温孵法：该法与肝微粒体体外温孵法的主要区别在于酶的制备和纯度。基因重组P450酶是利用基因工程及细胞工程技术制备得到的纯度较单一的P450同工酶。这一方法主要用于鉴别参与药物代谢的P450同工酶、药物代谢多态性和药物代谢的相互作用研究。其最大的特点是通过比较基因重组的人和实验动物肝脏P450酶对药物的代谢情况，了解药物代谢的种属差异性。

肝细胞体外温孵法：肝细胞体外温孵法与肝微粒体法相似，是以制备的肝细胞辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理环境条件下进行的代谢反应。在反应过程中定时从反应体系中取样，监测细胞的活性、药物及其代谢物的浓度，运用LC-MS和LC-MS/MS对代谢产物进行初步的结构鉴定。该法适用于研究蛋白及mRNA水平药物代谢酶的诱导和酶的活性，在药酶诱导研究中占据主导地位。主要不足之处是肝细胞制备技术复杂，且体外肝细胞活性仅能维持4小时，不利于储存和反复使用。

离体肝灌流法：与肝微粒体法、肝细胞体外温孵法比较，该法保留着完整细胞的天然屏障和营养液的供给，能在一段时间内保持肝脏的生理生化功能；同时具有离体系统的优点，能够排除其他器官组织的干扰，可控制受试物质的浓度，定量观察受试药物对肝脏的作用。适合于定量研究药物体外代谢的行为和特点，但其对实验设备和技术有一定要求，限制了其应用。目前肝灌流主要有两种形式：循环型和一过型。循环型在体系上更接近体内循环，灌流液需要量也少；一过型可以提供大量的灌流液样品，能直接评价外来物经肝脏后的损失及稳态下代谢物的生成，易于建立剂量－反应关系。

肝切片法：肝切片不仅完整地保留所有肝药酶及各种细胞器的活性，而且保留了细胞与细胞间的联系及一定的细胞间质，因此使用肝切片法比使用游离肝细胞孵育或培养更能反映药物在体内生理情况下的真实代谢过程，适合于比较不同组织器官的代谢差异和代谢的种属差异。因具有Ⅰ相和Ⅱ相代谢途径，故所得结果与体内较接近，且可以在较长的时间内保持代谢活性（可达8～24小时）。其不足之处是需要一些特殊的设备（如切片机）。

4.排泄研究方法　中药经吸收、分布、代谢后，最终以原形物或代谢物从肾、胆汁、胃肠道等途径排出体外。故研究内容及方法包括尿和粪便的排泄、胆汗排泄两部分。

（1）尿和粪便的排泄　中药肾排泄是体内排泄的最主要方式，粪便排泄是由胆汁排泄经肝肠循环后的剩余部分和经胃肠道排泄的总和。因此，收集一段时间的尿、粪便，测定其浓度，即可获得中药从尿、粪便的排泄情况。

（2）胆汁排泄　动物麻醉后做胆管插管引流，待动物清醒后以各种途径给药，并以合适的时间间隔分段收集胆汁，测定其中药原形物及代谢物，以此可获得中药从胆汁的排泄情况。

二、中药血药浓度研究方法

中药血药浓度研究方法分为直接血药浓度法、中药效应成分血药浓度法、群体血药浓度及毒代动力学血药浓度法等方法。

1.直接血药浓度法　适合于已分离提纯的中药活性成分的药代动力学研究，与通常的化学药物的药代动力学研究方法完全相同。所获得的资料只能说明活性成分本身的药代动力学特点，未必能够反映含有这种成分的中药及其复方的药代动力学特征。

2.中药效应成分血药浓度法　此法在中药药动学研究中应用较多。其方法是给予单味中药或中药复方，不同时间测定血中有效成分浓度，计算这些成分的药代动力学参数，用以说明中药单、复方的吸收、分布、代谢和排泄等特点。该法与直接血药浓度法比较，结果更接近于中药的临床实际情况。目前中药效应成分的药代动力学研究往往测定其中的几个成分。如茵陈五苓散以6，7-二甲基香豆素为指标，银黄制剂以黄芩苷和绿原酸为指标，小柴胡汤以甘草次酸和黄芩苷为指标，大黄煎液以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚为指标等。但中药及其复方可能是由多种成分共同发挥作用的，仅测定其中的几种有效成分来代表整个中药及其复方的药代动力学是不够全面的，还需研究其他成分的药代动力学特性，探索其中主要成分由于中药配伍而导致的变化规律与药效关系，才能较全面掌握中药作用的本质。近年来随着HPLCMS和HPLC-MS/MS等分析技术的应用，有望在不久的将来能揭示中药及其复方中多种活性成分和其他成分在体内的药动学与药效学之间的变化规律。

3.群体血药浓度法　此法是通过应用药代动力学基本原理结合统计学分析研究某一群体药代动力学（population pharmacokinetics，PPK）的方法。通常血药浓度采样只有几个点，利用其稀疏数据来研究群体的特征和变异性。其参数一般可通过统计学中的单纯集合法（naive pooled data，NPD）、标准二步法（STS）、迭代二步法（ITS）、非线性混和效应模型法（nonlinear mixed effect model，NONMEM）等进行求算，其中以NONMEM法最为常用。PPK可以将固定效应对基础药代动力学参数的影响模型化，从而发现新的定量关系，也可以估算出个体间变异，对于治疗药物监测给药方案的设计与优化有较大的参考价值，还可以估算产品的变异和测定方法的变异性等。目前有关中药PPK方面的研究有一些应用实例。如通过大鼠灌胃给予不同剂型的双黄连后，用HPLC法测定血浆中黄芩苷浓度，用WinNonlin和NONMEM统计方法分别计算非房室模型药代动力学参数和PPK参数。结果双黄连的剂型显著影响黄芩苷的药代动力学参数，其中微乳制剂给药后Cmax与AUC的值较大。再如将大鼠分别静脉注射和灌服芍药苷或阿魏酸提取物及其不同组成的复方冠心Ⅱ水煎液，HPLC法测定其血浆中芍药苷和阿魏酸浓度，以NONMEM法分别对芍药苷和阿魏酸的血药浓度数据进行PPK解析。结果表明，芍药苷、阿魏酸的体内过程均可用二室口服吸收模型进行表述。

4.中药毒代动力学血药浓度法　毒代动力学是涉及药代动力学和毒理学研究的边缘性分支学科。它运用药代动力学的原理和方法定量研究毒性剂量下药物在动物体内的过程和特点，探讨药物毒性发生和发展的规律性。毒代动力学有别于经典的药代动力学和毒理学，其主要区别在于毒代动力学所用剂量远远高于临床所用剂量，且多为重复多次给药，侧重点是阐明药物的致毒机制和毒性发生发展的变化规律，有助于了解药物的全身暴露情况，在临床给药剂量确定、毒性种属差异比较和药物安全性评价等多方面具有重要意义。

中药毒代动力学研究分为单剂量、多剂量和长期毒性、组织分布、致癌毒性、生殖毒性、遗传毒性等的毒代动力学研究。如应用HPLC-荧光分析方法研究了大黄酸的毒代动力学特征，采用与长期毒性试验相同的剂量，在灌胃给药第1天、连续给药26周和连续给药39周时进行毒代动力学试验，测定不同时间点的血浆大黄酸浓度，用统计矩方法估算大黄酸在犬体内的毒代动力学参数。结果表明，在研究的剂量范围内，大黄酸在犬体内的毒代动力学过程是基本一致的，各剂量间AUC及Cmax的比例均接近1∶2∶4。对于同一剂量，单次给药和多次给药后的AUC和Cmax没有显著性改变，说明大黄酸在犬体内蓄积程度较轻。

三、中药生物效应研究方法

中药生物效应研究方法主要有药理效应、毒理效应和微生物测定等研究方法。

1.药理效应法　药理效应法是以中药的效应强度，包括量效关系、时效关系为基础的药代动力学研究方法。与血药浓度法不同，药理效应法以效应为测定指标。目前，对于有效成分不明的中药及其复方的药代动力学研究，多倾向于使用药理效应法。常用方法有效量半衰期法、效应作用期法等。

（1）效量半衰期法　该法是以中药的药理效应为指标，先分别求出该中药的量-效关系（dose–effect relationship，D-E）和时-效（time-effect relationship，T-E）关系，再根据D-E关系将T-E中的E转化成效应相关的量，从而求出时-量（time-dose relationship，T-D）关系。求得的T-D关系，即可绘制T-D曲线，进行模型分析和计算药代动力学的相关参数。该方法的关键之一是能找出灵敏、定量反映中药药效的指标。若指标反应迅速且可逆，如血压、HR等，则可在同一对象上连续观察；若指标反应慢或不可逆，如发汗、抗感染等，则每个对象上只能观察一个实验点。其方法是：①建立D-E关系：剂量的选择一般应处于ED15～ED85之间。取对数剂量为横坐标，药效强度为纵坐标，可直接求测D-E关系。②建立T-E关系：选择较大剂量（ED85左右）给药，定时测定给药后效应经时变化。③建立T-D关系：将剂量（D）转化为对数剂量（lgD），用lgD对效应E做直线回归求得截距Ad及斜率Bd，则E=Ad+Bd×lgD，lgD=（E－Ad）/Bd。将T-E关系中各时间点的E以相应的D代替，则得出T-D关系。在T-D关系中，可按血药浓度法分析中药的房室模型和计算其相关的药代动力学参数。

（2）药效作用期法　量效半衰期法需要建立量效曲线和时效曲线，比较麻烦。如利用药效作用期法，则比较方便。该法系以药效作用期作为药理效应强度指标。其方法为在ED20～ED80范围内按一定比率确定3～5个不同剂量，分别给药，测定药效持续时间。以作用期为纵坐标，对数剂量为横坐标做图，并按线性回归拟合一条直线，直线斜率为bp，其参数效量半衰期［t1/2（ED）］=0.301bp。

2.毒理效应法　本法与药理效应法类似，同属于生物测定法，但观察指标为药物的毒性作用，最常用者为动物死亡。毒理效应法分为急性累计死亡率法及LD50补量法。

（1）急性累计死亡率法　其方法为：①建立D-P直线：按常规将小鼠分为5～7组（每组10只），通常采用腹腔注射给药，药后记录各组死亡率，得D-P直线（D为给药剂量，P为累计死亡概率单位），求出LD50及LD90。②确定剂量和给药间隔时间：剂量因D-P直线斜率而不同，通常用1/2LD90，两次给药剂量相同，这样两次给药理论上产生的最大死亡率应为0.9，可避免小鼠全部死亡。给药间隔一般取0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48、72小时中的6～8个时间点，必要时可增设5、10、15分钟时间组。③测定两次给药后的死亡率：按以上原则将小鼠分为5～8组，每组20～40只，均给药两次，首次腹腔注射LD90的一半，各组分别于预定间隔时间再重复给药一次，观察各组累计死亡率至不再出现死亡为止（中药大多为3～5天），记录死亡时间、死亡情况及雌雄小鼠死亡数。④确定T-Dt关系：先求出体存量Dt。Dt为各组第一次腹腔注射后经过用药间隔时间的体内含量，公式为Dt=Dc－D0（Dc为P的相当剂量，D0为腹腔注射剂量），体存量百分率（%）=（Dt /　D0）×100%。就各组间隔时间（横轴）和Dt或lgDt做图则得T-Dt曲线，据此可分析中药的消除动力学、房室模型，并计算药代动力学参数。

此外，可计算中药口服给药时的F值，F=LD50（po）/LD50（ip），通过雌雄小鼠死亡总数的比值可看出中药毒性有无性别差异。

（2）LD50补量法　本法是在急性累计死亡率法基础上改进而成。改进之处是将二次腹腔注射同量药物变为第一次腹腔注射某量基础上，不同时间后，求测降低的LD50（t），间隔时间越短，LD50（t）降低量越大。第一次用药后不同时间的体存量Dt=LD50－LD50（t）。以首次给药后间隔时间对对数体存量做图。由对数体存量-时间曲线拟合房室模型，计算药代动力学参数。本法优点是结果更精确，误差小，死亡指标在曲线中段。但使用动物数成倍增加，分组、给药及时间把握上更复杂。

急性死亡率法最大的优点是普适性。因以死亡为指标，具有非特异通用性质，只要能使动物急性致死的药物都可用本法估计药代动力学参数。该法简便易行，不需要特殊仪器；观察到的死亡前症状可以推测中药作用性质，死亡时间可反映中药起效快慢，并可判断毒效的性别差异。缺点是毒效与药效不相平行，毒效成分可能不是药效成分，故不能代表治疗剂量下的药代动力学规律，所测的参数具有一定的片面性。

3.微生物指标法　微生物法已广泛用于抗菌药物的效价测定，其原理主要是含有试验菌株的琼脂平板中抗菌药扩散产生的抑菌圈直径大小与抗菌药浓度的对数呈线性关系。故可利用这一原理选择适宜的敏感菌株测定体液中抗菌中药的浓度，然后按照药代动力学原理确定房室模型，并计算其参数。该法简便易行，但特异性不高，测定的结果包括具有抗菌活性的代谢物。

四、PK-PD结合研究方法

药代动力学（pharmacokinetics，PK）和药效动力学（pharmacodynamics，PD）是按时间同步进行的两个密切关联的动力学过程，各有侧重。但在相当长的时间内对两者的研究是分别进行的，两者之间的内在联系被忽视，使得PK-PD的研究存在一定局限性。随着PK和PD研究的不断深入，人们逐渐意识到这一问题，进而提出了PK-PD模型，用于综合研究体内药物动力学过程与药效量化指标的动力学过程，将两种不同形式过程整合为统一体，其本质是一种药量与效应之间的转换过程。利用这一模型有助于全面和准确地了解药物效应随剂量（或浓度）及时间的变化规律。

近年来，随着人工神经网络及微透析技术的发展，PK-PD模型的研究及其应用取得了较大进展，但仍然面临许多问题和挑战。首先是如何寻找和选择合适的药效指标来评价药物的疗效，因为许多药物的效应在体内是无法直接进行连续定量测定的，常常借助于生物标志物来反映药物的效应，因此必须要明确这些生物标志物的变化与疾病的状态和进程之间的关联性，以便使研究更契合临床实际；其次是如何解决具有多靶点和（或）多组分特性药物的PK-PD结合研究。有学者在研究血药浓度和效应的过程中发现，血药浓度和效应之间并非简单的一一对应关系，即效应峰值明显滞后于血药浓度峰值，若以效应对浓度做图可得到逆时针滞后环曲线。根据这一现象，1979年Sheiner等在经典的药代动力学模型理论基础上，提出一个假想的效应室，使之与血浆室（中央室）相联系，且结合传统的药效学，组合出一种新的PK-PD结合模型，成功地解释了筒箭毒碱药效滞后于血药浓度的现象。目前大多数药物的效应滞后环都可以通过这种模型得到满意解释，从而证实了效应室的存在。

在中药药动学研究中，由于化学成分非常复杂，以其中的一个或几个化学成分为检测指标，测得的药代动力学特征不一定能代表整个的体内过程。因此研究人员开始采用PK-PD模型进行中药药动学研究。如通过构建药动学网络和药效学网络在内的神经网络结构体系，以大鼠冠脉结扎引起的急性心肌缺血为病理模型，考察丹参素对肌钙蛋白T（troponin T，TnT）、高半胱氨酸（homocysteine，Hcy）和还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）等指标的影响，结果显示网络结构对心血管作用的贡献率有所不同，其中丹参素血药浓度对GSH的影响最大，然后依次是TnT和Hcy。通过神经网络的PK-PD结合模型来研究和评价丹参素的心血管活性，发现其具有多靶点的作用特征。

由于现有的PK-PD模型只适合于作用机制明确且成分单一的化学药物，而中药的作用常常具有多组分和多靶点的特点，这极大地限制了PK-PD模型在中药药物动力学研究中的应用。因此有必要开拓新的研究思路，提出并建立符合中药作用特点的PK-PD模型，这将有助于阐明中药作用的物质基础及其作用机制，为中药现代研究提供新理论和新方法。