模块一　光学分析法

项目一　紫外-可见分光光度法

【必备知识】

紫外-可见分光光度法（ultraviolet-visible spectrophotometry）是根据溶液中物质的分子或离子对200～760nm范围电磁辐射的吸收而建立起来的一种定性和定量方法。

一、光的基本特性

1.光的基本性质

光是一种电磁波，具有波粒二象性：波动性和粒子性。

光的波动性：光按波动形式传播。例如：光的折射、衍射、偏振和干涉现象，就明显地表现其波动性。光的波动性用波长λ、频率ν及波数σ等主要参数来描述。在真空中波长、频率或波数的相互关系为：

式中，λ为波长，cm；ν为频率，Hz；c为光速，c≈3×108m·s-1。

光的粒子性：光的吸收、发射以及光电效应等证明了光具有粒子性。光是由“光微粒子”（光量子或光子）所组成的。光量子的能量与波长的关系为：

式中，E为光量子的能量，erg（1erg=10-7J）；ν为频率，Hz；h为普朗克常数，h=6.6262×10-34J·s。

2.物质对光的选择吸收

人眼能感觉到的光称为可见光（其波长范围大约在400～760nm）。如果让一束白光（日光）通过棱镜，于是发生折射作用，便分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等颜色的光。每种颜色的光具有一定的波长范围，理论上将具有同一波长的光称为单色光，包含不同波长的光称为复合光。白光是复合光，它不仅可由上述七种颜色的光混合而成。如果把两种特定颜色的单色光按一定强度比例混合，也可以得到白光，我们便称这两种单色光为互补色光。如图1-1中处于对角线关系的两种特定颜色光互为互补色光，如蓝色光和黄色光互补。

物质的颜色就是因为物质对不同波长的光具有选择性吸收作用而产生的。对固体物质来说，当白光照射到物质上时，如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑色；如果完全反射，则呈现白色；如果对各种波长的光均匀吸收，则呈现灰色；如果选择地吸收某些波长的光，则呈现反射或透射光的颜色。对溶液来说，溶液呈现不同的颜色是由于溶液中的质点（离子或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。当白光通过某种溶液时，如果它选择性地吸收了白光中某种色光，则溶液呈现透射光的颜色，也就是说，溶液呈现的是它吸收光的互补色光的颜色。例如，硫酸铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈蓝色；高锰酸钾溶液因吸收了白光中的绿色光而呈现紫色。表1-1为物质呈现的颜色与吸收光的对应关系。

二、吸收光谱的产生

吸光物质具有吸光作用的质点是物质的分子或离子，当光照射到某物质后，该物质的分子就有可能吸收光子的能量而发生能级跃迁，这种现象叫作光的吸收。

分子具有电子能级、振动能级和转动能级，这些能级都是量子化的。在每一电子能级上有许多间距较小的振动能级，在每一振动能级上又有许多更小的转动能级。若用ΔE电子、ΔE振、ΔE转分别表示电子能级、振动能级、转动能级差，有ΔE电子>ΔE振>ΔE转，如图1-2所示。

图中S代表电子能级，ν代表振动能级，r代表转动能级，下标0、1、2……代表相应能级的基态、第一激发态、第二激发态……

分子吸收外来电磁辐射后，它的能量变化ΔE分子为其振动能量变化ΔE振、转动能量变化ΔE转以及电子能量变化ΔE电子的总和，即：

ΔE分子=ΔE振+ΔE转+ΔE电子　　（1-1）

当用波长为λ（或频率ν）的电磁辐射照射分子时，该分子的较高能级与较低能级之差ΔE恰好等于该电磁波能量hν时，即有：

　　（1-2）

则该波长（或频率）的光被该物质选择性地吸收，价电子从基态跃迁到激发态。此时，在微观上表现为分子由较低能级跃迁到较高能级。在宏观上则体现为物质吸收光。

若用连续的电磁辐射按波长大小顺序分别照射分子，记录物质分子对电磁辐射的吸收。物质分子对辐射的吸收程度随波长变化的关系，称为分子吸收曲线，又称分子吸收光谱。

分子中电子能级间能差约为1～20eV（相应的波长为1.25μm～60nm），相当于紫外线和可见光的能量。因此，由电子能级跃迁产生的吸收光谱，称为紫外-可见吸收光谱。

在电子能级跃迁过程中，还会伴随有振动能级和转动能级的跃迁，因而产生的一系列谱线连成谱带。因此，紫外-可见吸收光谱实际上是电子-振动-转动光谱。

三、 吸收定律

1.透光率和吸光度

当一束强度为I0的平行单色光通过一均匀、非散射的吸收介质时，由于吸光物质分子与光子作用，一部分光子被吸收；另一部分光子透过介质。如果吸收光的强度为Ia，透过光的强度为It，则它们之间的关系为：

I0=Ia+It　　（1-3）

透过光的强度It与入射光强度I0之比称为透射比或透光率（transmittance），用T表示。

　　（1-4）

从式（1-4）可看出，溶液的透光率越大，表示溶液对光的吸收越少；反之，透光率越小，表示溶液对光的吸收越多。

透光率的倒数反映了物质对光的吸收程度，取它的对数称为吸光度（absorbance），用A表示。

　　（1-5）

透光率T和吸光度A都是表示物质对光的吸收程度的一种量度。

2.朗伯定律

当一束某一波长的平行单色光通过液层（光吸收层）厚度为L的溶液后，由于溶液吸收了一部分光，光的强度就要减弱，它们之间的关系为：

　　（1-6）

式中，入射光的强度为I0；透过光的强度It；溶液厚度为L。式（1-6）反映的是在溶液浓度一定时，光吸收与液层厚度的关系，称为朗伯（Lambert）定律。式中的k2为比例常数，它与入射光的波长以及物质的性质和温度有关。

由朗伯定律可知，当入射光的波长、溶液的浓度和温度一定时，有色溶液吸收光的程度与液层的厚度成正比。

3.比尔定律

当一束波长一定的平行单色光，通过液层厚度一定的均匀有色溶液时，溶液中的有色质点吸收一部分光能，使光强度减弱。显然，溶液的浓度越大光被吸收的程度就越大。

如用It表示透过光的强度，则得：

　　（1-7）

式（1-7）反映的是在液层的厚度一定时，光吸收与溶液浓度的定量关系，称为比尔（Beer）定律。式中的k4为比例常数，它与入射光的波长、物质的性质和溶液温度有关。

比尔定律表明，当入射光的波长、液层厚度和溶液温度一定时，溶液对光的吸收程度与溶液的浓度成正比。

4.朗伯-比尔定律

如果同时考虑溶液浓度和液层厚度的变化影响物质对光的吸收，则上述两个定律可合并为朗伯-比尔定律，即将式（1-6）和式（1-7）合并，得到对数关系式：

　　（1-8）

式中，A为吸光度；L为吸光介质的厚度，亦称光程，实际测量中为吸收池厚度，cm；c为吸光物质的浓度，mol·L-1、g·L-1或g·（100mL）-1；K为比例常数。

式（1-8）为光吸收定律的数学表达式。它表明，当一束平行单色光通过均匀、无散射现象的溶液时，在单色光强度、溶液温度等条件不变的情况下，溶液吸光度与溶液浓度及液层厚度的乘积成正比。这是吸光光度法进行定量分析的理论基础。

5.吸光系数的表示

在朗伯-比尔定律A=KcL中，比例常数K也称为吸光系数。物理意义是吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸光度。为吸光物质的特征参数，与物质的性质、入射光波长、温度及溶剂等因素有关，其值随c的单位不同而不同，在一定条件下为常数。根据浓度单位不同，K值含义也不尽相同。常有摩尔吸光系数ε和百分吸光系数之分。

（1）摩尔吸光系数

当溶液的浓度c以物质的量浓度表示时，K称为摩尔吸光系数，用符号ε表示。它的物理意义是指样品浓度为1mol·L-1的溶液置于1cm样品池中，在一定波长下测得的吸光度值。单位为L·mol-1·cm-1。此时朗伯-比尔定律为：

A=εcL

ε值越大，表示吸光质点对某波长的光吸收能力越强，光度法测定的灵敏度就越高。

（2）百分吸光系数

百分吸光系数也称比吸光系数，它是指在波长一定时，溶液浓度为1%［g·（100mL）-1］，液层厚度为1cm时的吸光度，用表示，单位为100mL·g-1·cm-1。此时式（1-8）改为：

摩尔吸光系数与百分吸光系数的关系为：

　　（1-9）

式中，M为被测物质的摩尔质量。ε与均为吸光物质的特征参数。

四、有机化合物的紫外-可见吸收光谱

连续光谱中某些光子的能量被物质吸收后，就形成了分子吸收光谱。如果测量某物质对不同波长（400～760nm）单色光的吸收程度，以入射光波长λ（nm）为横坐标，以该物质对应波长光的吸光度A为纵坐标作图，可得到该物质的紫外-可见吸收曲线，也称为紫外-可见吸收光谱（absorption spectrum）。如图1-3所示。

吸收峰：曲线上吸收度最大的地方，它所对应的波长称为最大吸收波长（λmax）。

吸收谷：峰与峰之间吸收度最小的部分，该处的波长称为最小吸收波长。

肩峰：在一个吸收峰旁边产生的一个曲折。

末端吸收：在图谱短波端呈现强强吸收而不成峰形的部分。

吸收光谱描述了该物质对不同波长光的吸收能力。图1-4是KMnO4溶液的吸收曲线。

由图1-4可见，在可见光范围内，KMnO4溶液对波长525nm附近的绿色光有最大吸收，而对紫色和红色的吸收很弱，这是KMnO4溶液呈紫红色的原因。不同浓度的同一物质，吸收曲线形状相似，最大吸收波长相同，但吸光度值不同。在任一波长处，吸光度随溶液浓度的增加而增大。在一定条件下，一定浓度范围的稀溶液的吸光度与浓度成正比例，符合比尔定律，这是分光光度法定量分析的依据。

此外，不同物质的吸收曲线形状和最大吸收波长不同，说明物质对不同波长光的吸收与物质结构有关，这是分光光度法对物质进行定性分析的依据。

五、紫外-可见分光光度计的基本组成及类型

（一）紫外-可见分光光度计的基本组成

紫外-可见分光光度计的类型很多，但其基本是由辐射光源、单色器、吸收池、检测器、信号处理及显示系统五部分组成。

1.辐射光源

辐射光源能提供激发能，使待测分子产生吸收。对光源的要求：在较宽的波长范围内，能够提供足够强的连续光谱；有良好的稳定性、较长的使用寿命；辐射能量随波长无明显变化。

紫外-可见分光光度计常用的光源分为热辐射光源和气体放电光源两种。热辐射光源常用的有钨灯和卤钨灯，气体放电光源主要有氢灯和氘灯。

热辐射光源可发出波长为320～2500nm的连续可见光谱，可用作可见光区的光源。气体放电光源可发出波长为160～375nm的连续辐射，是紫外区的常见光源。在相同的条件下，玻璃对这段波长范围内的辐射有强吸收，故必须采用石英光窗。

由于同种光源不能同时产生紫外线和可见光，因此，紫外-可见分光光度计需要同时安装两种光源。

2.单色器（分光系统）

单色器的作用是将光源发出的复合光分解成单色光并可从中选出任一波长单色光的光学系统。通常由入射狭缝、准直镜、色散元件、聚焦透镜和出射狭缝构成，如图1-5所示。入射狭缝用于限制杂散光进入单色器，准直镜将入射光束变为平行光束后进入色散元件。色散元件将复合光分解成单色光，然后通过聚焦透镜将平行光聚焦于出射狭缝。出射狭缝用于限制谱带宽度。常用的色散元件是光栅（raster）和棱镜（prism）。单色器的性能直接影响入射光的单色性，从而也影响到测量的灵敏度、选择性及校准曲线的线性关系等。

3.吸收池（比色皿）

吸收池是用于盛放待测溶液和决定透光液层厚度的器件。通常有玻璃和石英比色皿两种。在可见光区进行测定时，可选用两种中的任一种使用。在紫外线区测定时，由于玻璃对这段波长范围的辐射有强吸收，故只能选用石英比色皿进行测定。

吸收池的主要规格有0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm和5.0cm，常用的吸收池厚度为1.0cm，根据被测试样的浓度和吸收情况来选择合适的吸收池。

使用吸收池时，应先用溶剂洗涤吸收池，然后再用被测试样溶液润洗3次。拿取吸收池时，应拿吸收池毛玻璃的两面，不要触摸透光面。吸收池外沾有液体时，应小心地用擦镜纸或脱脂棉擦净，保证其透光面上没有斑痕。避免测定含强酸或强碱的溶液。

4.检测器

又称光电转换器（photoelectric transducer），它的功能是检测透过吸收池的光信号，并将光信号转变成可测量的电信号。常用的有光电池、光电管或光电倍增管，后者较前者更灵敏，它具有响应速度快、放大倍数高、频率响应范围广的优点，特别适用于检测较弱的辐射。近年来还使用光导摄像管或光电二极管阵列作检测器，具有快速扫描功能。

5.信号处理及显示系统

它的作用是放大电信号，并以适当方式显示或记录下来。由于透过试样后的光很弱，所以射到光电管产生的光电流很小，因此需要放大才能测量出来，放大后的信号可直接输入记录式电位计。常用的信号处理及显示系统有检流计、数字显示仪、微型计算机等。

（二）紫外-可见分光光度计的类型

紫外-可见分光光度计，可分为单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计。

1.单光束紫外-可见分光光度计

经单色器分光后的一束平行单色光，轮流通过参比溶液和试样溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，易于维修，适用于测定特定波长的吸收，进行定量分析。其原理如图1-6（a）所示。

2.双光束紫外-可见分光光度计

双光束仪器中，从光源发出的光经单色器分光后，再经旋转折光器分成两束，交替通过参比池和试样池，测得的是透过试样溶液和参比溶液的光信号强度之比。双光束仪器克服了单光束仪器由于光源不稳引起的误差，并且可以对全波段进行扫描。其原理如图1-6（b）所示。

3.双波长紫外-可见分光光度计

该仪器既可用作双波长分光光度计，又可用作双光束仪器。其原理如图1-6（c）所示。由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两个不同波长的单色光λ1和λ2，由折光器并束，使其在同一光路交替通过同一吸收池，由光电倍增管检测信号，得到的信号是两波长处吸光度之差ΔA。双波长仪器的主要特点：

①不需参比液，克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高、选择性高。

②对浑浊试样进行测定时，可消除背景吸收。

③适当选择波长，简化混合组分同时测定过程。

④可测定导数光谱（derivative spectrum）。

六、定性、定量、结构分析

（一）定性分析

1.光谱比较法

在相同的实验条件下，分别测定未知纯化合物和已知纯化合物的吸收光谱，根据图谱中吸收峰的位置、数目、相对强度及吸收峰的形状进行比较，如果两者的吸收图谱完全一致，则可初步认定两者系同一物质。如果没有已知的标准物，则可与《中华人民共和国药典》中收录的标准图谱比较，如果二者的图谱有明显的差异，即可认定二者并非同一物质。

2.特征数据的比较

用于定性鉴别的主要数据有最大吸收波长λmax和吸光系数（ε、）。在不同化合物的紫外吸收光谱中，可能最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε很接近，但因物质的分子量不同，百分吸光系数的数值会有差别，故在进行比较的时候，要同时比较物质的最大吸收波长λmax和百分吸光系数。例如：醋酸甲羟孕酮和炔诺酮，在无水乙醇中测得λmax都在（240±1）nm，而且ε相差不大，但是差别很大，可以由此来进行鉴别。

（二）定量分析

根据朗伯-比尔定律，在一定条件下待测溶液的吸光度和溶液的浓度呈线性关系，据此可对待测组分进行定量分析。

1.吸光系数法

如果待测样品的吸光系数已知，由紫外-可见分光光度法测得样品的吸光度，根据朗伯-比尔定律A=KcL，可计算出待测样品的浓度。

2.标准对比法

在相同条件下，配制浓度为cs的标准溶液和浓度为cx的待测溶液。分别测定吸光度，根据朗伯-比尔定律：

As=KLcs

Ax=KLcx

由于标准溶液和待测溶液当中所含的物质为同一物质，故吸光系数相同，如果选用相同的比色皿，两式相消，即可求得待测物质的浓度。

3.标准曲线法

首先，配制一系列浓度不同的标准溶液，分别测定对应的吸光度，以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标作图，在一定范围内，可得到一条过原点的直线，称之为标准曲线。然后再在相同的实验条件下测定待测溶液的吸光度，从上述标准曲线得出的回归方程计算出待测溶液的浓度。

标准曲线法需要有标准物质，适用于大批量样品的测定。

（三）紫外吸收光谱法结构分析

紫外吸收光谱往往要与其他仪器联用才能准确地对一种化合物作出鉴定，但是对于化合物中官能团及共轭体系的确定是十分有效的，规律如下：

①在220～280nm范围内无吸收，可推断该化合物不含苯环、共轭双键、醛基、酮基、溴、碘。

②在210～250nm范围内有强吸收，表示含有共轭双键。

③在270～300nm范围内有一个随溶剂极性增大而向短波移动的弱吸收带，说明有羟基的存在。

④在260nm左右处具有精细结构的弱吸收带表明有苯环的存在。

⑤如果化合物有许多吸收峰，或者延伸到可见光区，可能为多环芳烃。

⑥还可用于互变异构体的判断。

七、分光光度计的使用及维护

（一）分光光度计的使用程序

1.开机

分别开启计算机和仪器主机。进入操作系统，预热20min。

2.仪器设置

设置的主要参数包括：①波长的选择；②吸光度数值的设置；③测量模式的设置；④扫描速度等的设置。

3.将待测试液放入样品池中并测试

根据设置好的参数进行测试，窗口出现扫描谱图或者吸光度数值，根据需要进行保存或者是数据的导出。

4.数据处理

将导出的数据输入到作图软件之中作图。

5.关机

①关闭运行软件，退出操作系统。

②关闭仪器主机和计算机主机。

（二）分光光度计仪器维护

分光光度计是精密光学仪器，正确安装、使用和保养对保持仪器良好的性能和保证测试的准确度有重要的作用。

分光光度计应安装在稳固的工作台上（周围不应有强磁场，以防电磁干扰），室内温度宜保持在15～28℃。室内应干燥，相对湿度宜控制在45%～65%，不应超过70%。室内应无腐蚀性气体，应与化学分析操作室分开，室内光线不宜过强。

保养和维护方法如下：

①仪器工作电源一般为220V，允许±10%的电压波动。为保持光源灯和检测系统的稳定性，在电源电压波动较大的实验室，最好配备稳压器。

②为了延长光源使用寿命，在不使用时不要开光源灯。如果光源灯亮度明显减弱或不稳定，应及时更换新灯。更换后要调节好灯丝位置，不要用手直接接触窗口或灯泡，避免油污粘附，若不小心接触过，要用无水乙醇擦拭。

③不要在仪器上方倾倒测试样品，以免样品污染仪器表面，损坏仪器。

④在可见光区进行测量时，要把氢灯或者氘灯关掉。

⑤在进行测试前，先打开仪器主机进行预热后再进行测定。

⑥光电转换元件不能长时间曝光，应避免强光照射或受潮积尘。

【任务操作】

任务一　邻二氮菲分光光度法测定微量铁

【任务目标】

1.正确使用分光光度计，了解工作原理。

2.正确绘制吸收曲线及标准曲线。

3. 能够利用邻二氮菲分光光度法测定微量铁的含量。

【测定原理】

由朗伯-比尔定律A=KLc可知，在一定条件下，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。绘制出以吸光度A为纵坐标、浓度c为横坐标的标准工作曲线，测出待测液的吸光度，就可由标准曲线查得对应的浓度，此浓度即为待测样品的含量。

邻二氮菲分光光度法是化工产品中测定微量铁的通用方法，在pH值为2～9的溶液中，邻二氮菲和二价铁离子结合生成红色配合物：

此配合物的lgK稳=21.3，摩尔吸光系数ε510=1.1×104L·mol-1·cm-1，而Fe3+能与邻二氮菲生成3∶1配合物，呈淡蓝色，lgK稳=14.1。所以在加入显色剂之前，应用盐酸羟胺（NH2OH·HCl）将Fe3+还原为Fe2+，其反应式如下：

2Fe3++2NH2OH·HCl2Fe2++N2+2H2O+4H++2Cl-

【仪器与试剂】

TU-1810型分光光度计、酸度计、50mL比色管、容量瓶、吸量管（1mL、2mL、5mL、10mL）、比色皿、洗耳球。

1×10-3mol·L-1铁标准溶液、100μg·mL-1铁标准溶液、10%盐酸羟胺、1mol·L-1 NaAc、0.15%邻二氮菲水溶液。

【任务操作步骤】

1.准备工作

打开仪器电源开关，预热，调试仪器。

2.测量工作

（1）吸收曲线的绘制和测量波长的选择

用吸量管吸取2.00mL 1.0×10-3mol·L-1铁标准溶液，注入50mL比色管中，加入1mL 10%盐酸羟胺溶液，摇匀；加入2mL 0.15%邻二氮菲溶液；5mL 1mol·L-1 NaAc溶液，以水稀释至刻度。在分光光度计上以水为参比溶液，在440～580nm范围内进行光谱扫描，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标、绘制吸收曲线。在紫外-可见分光光度法定量分析选择测量的适宜波长时，一般选用最大吸收波长λmax为测定波长。

（2）显色剂条件的选择（显色剂用量）

在6支比色管中，各加入2.00mL 1.0×10-3mol·L-1铁标准溶液和1mL 10%盐酸羟胺溶液，摇匀。分别加入0.10mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL及4.00mL 0.15%邻二氮菲溶液；5mL 1mol·L-1 NaAc溶液，以水稀释至刻度，摇匀。在分光光度计上用1cm比色皿，采用试剂空白为参比溶液，测吸光度。以邻二氮菲体积为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸光度-显色剂用量曲线，从而确定最佳显色剂用量。

（3）溶液pH的确定

取8支50mL比色管，各加入2mL 1.00×10-3mol·L-1铁标准溶液和1mL 10%的盐酸羟胺溶液，摇匀。放置2min，加入2mL 0.15%邻二氮菲，摇匀，分别加入0.00mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL、3.00mL 1mol·L-1的NaAc溶液，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。在分光光度计上，在其他条件一定的前提下，分别测其吸光度。以邻二氮菲体积为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制A-pH曲线，从而确定最佳显色剂用量。

（4）显色时间及有色溶液的稳定性

用吸量管吸取2mL 1.00×10-3mol·L-1铁标准溶液于50mL比色管中，加入1mL 10%的盐酸羟胺溶液，摇匀。再加入2mL 0.15%邻二氮菲溶液，5mL 1mol·L-1 NaAc溶液，以水稀释至刻度，摇匀。以试剂空白为参比，静置，每2min测一次吸光度。以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制A-t吸收曲线，选择测量适宜的显色时间。

（5）标准曲线的制作

在6个50mL的容量瓶中，用1mL吸量管分别加入0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL 100μg·mL-1铁标准溶液，各加入1mL 10%盐酸羟胺，摇匀。再加入2mL 0.15%的邻二氮菲溶液和5mL 1mol·L-1NaAc溶液，以蒸馏水稀释至刻度，摇匀。放置一段时间。以试剂空白为参比，在选定的波长、适宜显色剂用量、适宜显色时间下测定各溶液的吸光度，绘制c-A标准曲线。

（6）试液含铁量的测定

准确吸取适量试液（如工业盐酸）代替标准溶液，其他步骤同上，平行三次测定其吸光度。记录计算机显示的含铁量，计算试液中铁的含量（以mg·L-1表示）。

【数据处理】

1.邻二氮菲-Fe2+吸收曲线的绘制

①数据记录。

②吸收曲线图，由图得出最大吸收波长λmax。

2.分析条件的选择

①显色剂用量。

②溶液pH。

③显色时间。

3.工业盐酸中铁含量的测定（见表1-2和表1-3）

【注意事项】

1.各种试剂的加入顺序。

2.测量条件选择好后不要再改变。

【任务思考】

1.分光光度法测定微量铁时为什么要选择在pH=2～9？

2.参比溶液的作用是什么？

任务二　产品中苯甲酸含量的测定

【任务目标】

1.正确使用分光光度计，了解工作原理。

2.熟练绘制标准曲线，能进行样品含量的测定。

【测定原理】

含有苯环和共轭双键的有机化合物在紫外区有特征吸收，未知结构不同对紫外-可见光的吸收曲线不同。苯甲酸及其盐对紫外线有选择性吸收，最大吸收波长在225nm处左右。

【仪器与试剂】

TU-1810型紫外分光光度计、酸度计、50mL容量瓶、移液管、比色皿、洗耳球。

1mg·mL-1苯甲酸储备液：称取0.5g苯甲酸，加水溶解后用水稀释至500mL，摇匀后备用。取此储备液25.00mL于250mL容量瓶中，用水稀释至250mL，摇匀后备用。此时标准溶液中苯甲酸含量为100μg·mL-1。

【任务操作步骤】

1.苯甲酸系列工作溶液的配制

在7支50mL的容量瓶中，分别加入0.00mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL、10.00mL、15.00mL、20.00mL的100μg·mL-1苯甲酸溶液，用水稀释至刻度，摇匀备用。

2.苯甲酸吸收曲线的绘制

在分光光度计上，以水为参比溶液，用1cm的石英吸收池，在200～400nm波长范围内测定并记录10.0μg·mL-1苯甲酸工作溶液在不同波长下相应的吸光度A。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，并在曲线上找出最大吸收波长，用λmax表示。

3.苯甲酸标准曲线的绘制

在分光光度计上，用1cm的石英比色皿，在最大吸收波长处，测定系列标准溶液的吸光度，以苯甲酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准工作曲线。

4.未知样品苯甲酸含量的测定

准确吸取未知样品试液代替标准溶液，其他步骤同上，平行三次测定其吸光度，计算未知样品试液中苯甲酸的含量（以μg·L-1表示）。

【数据处理】

1.苯甲酸吸收曲线的绘制

①数据记录。

②吸收曲线图，由图得出最大吸收波长λmax。

2.产品中苯甲酸含量的测定（见表1-4和表1-5）

【任务思考】

1.本实验可否选用玻璃比色皿进行测定？为什么？

2.如果样品的吸光度在标准溶液最大吸光度之外，能否将标准曲线外延求得样品的含量？

任务三　枣果皮中总黄酮含量的测定

【任务目标】

1.掌握紫外-可见分光光度法的基本原理和定量分析方法。

2.了解紫外-可见分光光度计的构造及使用方法。

3.学会紫外-可见分光光度分析最佳条件的选择。

【测定原理】

根据朗伯-比尔定律A=KLc，在一定条件下待测溶液的吸光度和溶液的浓度呈线性关系，据此可对枣果皮中总黄酮的含量进行定量分析。

【仪器与试剂】

枣果皮；芦丁（上海晶纯实业有限公司，纯度>99%）；无水乙醇；甲醇；氢氧化钠；亚硝酸钠；硝酸铝； TU-1900双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；BS210S电子分析天平（北京赛多利斯公司）；DK-98-1型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；TDL-5-A台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ-50E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

【任务操作步骤】

①选取实验（枣果皮中总黄酮含量的测定）。

②打开电脑主机和仪器电源。

③打开工作站软件，进行自检。

④参数设置。

⑤光谱扫描，试剂空白进行基线校正。

⑥根据光谱扫描结果，选择适宜的测定波长。

⑦光度测定。

⑧选用试剂空白作为参比，进行调零。

⑨标准品及样品吸光度的测定。

⑩数据处理（记录浓度、吸光度、线性回归方程及相关系数）。

实验完毕，关闭仪器。

【任务提示】

在操作的过程中，应重点提示操作的步骤及仪器的使用，让学生知道规范操作的标准。

【任务检测】

①检查操作是否规范。

②查看数据处理是否正确。

【任务报告】

学生能够熟练操作仪器及学会数据的处理。

【任务评价】

①实训前资料的收集。

②独立操作及动手能力。

③实训操作的规范性。

④实训的纪律性。

⑤实训报告。

【目标检测】

一、名词解释

透过率，吸光度，摩尔吸光系数，百分吸光系数，吸收光谱

二、填空题

1.在吸收光谱分析技术中，常因波长范围不同而选用不同材料制作的吸收池。可见光谱分析技术中选用____________吸收池，紫外光谱分析技术中选用____________吸收池。

2.紫外-可见分光光度计中，可见光区常用的光源为_______，可见光波长范围为_______，紫外线区常用的光源为_______，紫外线波长范围为_______。

3.紫外-可见分光光度计的类型很多，但其基本是由_______、_______、_______、_______、_______五部分组成。

4.当吸光度A=0时，透过率T为_______。

5.在紫外-可见吸收光谱分析技术中，进行含量测定时，吸光度的最适宜范围是_______。

6.朗伯定律是说明在一定条件下，光的吸收与_______成正比，比尔定律说明在一定条件下，光的吸收与_______成正比，二者合为一体称为朗伯-比尔定律。

三、计算题

1.已知Fe2+浓度为1.0mg·L-1的溶液，用邻二氮菲在一定条件下显色，用厚度为2cm的吸收池在510nm处测得吸光度为0.380，试计算其摩尔吸光系数。

2.为检测某钢厂生产的一批弹簧钢中锰含量是否达标，现取钢试样1.00g溶解于酸中，将其中的锰氧化成KMnO4，准确配制成250mL溶液，测得其吸光度为1.00×10-3mol·L-1 KMnO4溶液吸光度的1.5倍，计算钢中锰的质量分数。

3.称取维生素C 0.05g溶于100mL的0.005mol·L-1硫酸溶液中，再准确量取此溶液2.00mL稀释至100mL，取此溶液于1cm吸收池中，在245nm处测得A值为0.551，求试样中维生素C的百分含量。