第三节 高粱红天然染料的提取
从高粱壳中提取天然红色素的研究国内外已有些报道和研究，均采用溶剂法（如乙醇或乙醇水溶液法）来提取高粱红色素［12］。本试验分别以水、乙醇和乙醇水溶液为溶剂对高粱红色素进行提取。
一、以水为溶剂提取高粱红天然染料
1.高粱壳准备
取高粱壳若干，除去高粱秸等杂质，用清水洗三次，挤出水分，放入烘箱中80℃烘干至恒重，然后用粉碎机将高粱壳粉碎至粗粉末待用。
2.提取工艺的优化
（1）Na2CO3、NaOH浓度对提取的影响。试验条件：用Na2CO3溶液或NaOH溶液提取高粱壳中的天然红色素。将8g高粱壳加入100mL溶液中，温度80℃，时间60min，过滤后将提取液用容量瓶定容至100mL。取1mL用40%乙醇—盐酸溶液（pH=3）定容至100mL，以40%乙醇—盐酸溶液（pH=3）为参比液，光程为1cm，调节pH=3，用721型分光光度计测定在其最大吸收波长490nm处的吸光度（以下吸光度测试均为此方法），Na2CO3、NaOH浓度对提取效果的影响如图2-3所示。
图2-3 Na2CO3和NaOH浓度对提取液吸光度的影响
由图2-3可以看出，随着Na2CO3浓度和NaOH浓度的增大，提取液的吸光度逐渐增加，并且NaOH对提取液吸光度的影响比Na2CO3大。这是因为高粱红色素的主要成分为5，4′-二羟基异黄酮-7-O-半乳糖苷和5，4′-二羟基-6，8-二甲氧基异黄酮-7-O-半乳糖苷，由于分子中含有羟基，增加碱用量会促进羟基电离成为负氧离子，色素因此会更易溶解于水中。当NaOH及Na2CO3超过20g/L用量时，提取液的吸光度值变化不大。在NaOH与Na2CO3用量相同的提取条件下，用NaOH时吸光度值较高，说明NaOH提取效率较高，所以选择NaOH，用量为20g/L。
（2）温度对提取的影响。试验条件：高粱壳8g加入100mL溶液中，溶液中含NaOH 20g/L，时间60min。提取液用容量瓶定容至100mL。取1mL用40%乙醇—盐酸溶液（pH=3）定容至100mL，以40%乙醇—盐酸溶液（pH=3）为参比液，光程为1cm，用721型分光光度计测定在其最大吸收波长490nm处的吸光度（以下吸光度测试均为此方法）。温度对提取液吸光度的影响见图2-4。
图2-4 温度对提取液吸光度的影响
由图2-4可以看出，温度越高，提取效果越好。温度为100℃时，提取效果最好。
（3）时间对提取的影响。试验条件：高粱壳8g加入20g/L的NaOH溶液中，温度100℃，取得不同提取时间的提取液。提取液用容量瓶定容至100mL。取1mL用40%乙醇—盐酸溶液（pH=3）定容至100mL，以40%乙醇—盐酸溶液（pH=3）为参比液，光程为1cm，用721型分光光度计测定在其最大吸收波长490nm处的吸光度，时间对提取效果的影响如图2-5所示。
图2-5 时间对提取的影响
由图2-5可以看出，提取时间越长，提取效果越好，时间达到60min后，提取效果变化不大，故选择提取时间为60min。
（4）提取次数的影响。试验条件：高粱壳8g加入20g/L的NaOH溶液中，温度为100℃，时间为60min。取得不同提取次数的提取液。提取液用容量瓶定容至100mL。取1mL用40%乙醇—盐酸溶液（pH=3）定容至100mL，以40%乙醇—盐酸溶液（pH=3）为参比液，光程为1cm，用721型分光光度计测定在其最大吸收波长490nm处的吸光度，提取次数的影响见图2-6。
图2-6 提取次数对提取液吸光度的影响
从图2-6可以看出，第三次提取时，提取液浓度已很低，从经济性上考虑，只取两次提取液即可。第三次含量较少，不进行第三次提取。
通过上述试验，得出最佳提取条件：高粱壳用量为80g/L，NaOH用量为20g/L，温度为100℃，时间为60min，提取两次。所得高粱红色素溶液，用1mol/L盐酸溶液沉淀，放置12h，用减压法抽滤，得膏状物，再于80℃下放入烘箱中烘干。粗产率为8.3%。产品为褐色无定形粉末。
二、以乙醇为溶剂提取高粱红天然染料
以乙醇为溶剂，试验条件为：高粱壳8g加入100mL乙醇中，70℃，60min。所得提取液用容量瓶定容至100mL。吸取1mL提取液，以40%乙醇—盐酸溶液（pH=3）定容至100mL，测定溶液的吸光度为0.030，该值仅为相同条件下NaOH水溶液的提取液吸光度值（0.240）的12.5%。由于提取率太低，故不采用乙醇为溶剂提取高粱红天然染料。
三、以乙醇的水溶液为溶剂提取高粱红天然染料
取8g高粱壳，加入100mL的乙醇溶液，在一定温度条件下提取色素一定时间，提取液用容量瓶定容至100mL，吸取1mL，以40%乙醇—盐酸溶液（pH=3）定容至100mL，测试高粱红天然染料在最大吸收波长490nm处的吸光度。
（1）溶液pH对提取的影响（图2-7）。乙醇溶液浓度为40%，在80℃条件下提取60min。
图2-7 pH对提取结果的影响
由图2-7可以看出，随着溶液pH的升高，提取液的吸光度降低，说明提取液中高粱红色素的量减少，故选取提取液pH=1。
（2）乙醇浓度对提取结果的影响。调节提取液的pH=1，其他提取条件与上述条件相同。乙醇浓度对提取结果的影响见图2-8。
图2-8 乙醇浓度对提取结果的影响
由图2-8可以看出，乙醇浓度为60%时，提取效果较好。
（3）温度对提取结果的影响。调节提取液pH=1，乙醇浓度选择60%，提取时间为60min，测定不同提取温度条件下提取液的吸光度，温度对提取结果的影响见图2-9。
图2-9 温度对提取结果的影响
由图2-9可以看出，温度超过70℃时，吸光度变化不大，故提取温度选择70℃。
（4）时间对提取结果的影响。选择乙醇浓度为60%，调节提取液pH=1，在温度为70℃的条件下，考查提取时间对提取结果的影响。时间对提取结果的影响见图2-10。
图2-10 时间对提取结果的影响
由图2-10可以看出，温度一定，时间越长，提取液吸光度值越高，但时间超过120min后吸光度值变化不大，因此，提取时间为120min。
（5）提取次数对提取结果的影响。选择乙醇溶液浓度为60%，调节提取液pH=1，提取温度为70℃，时间为120min，考察不同提取次数对提取结果的影响。提取次数对提取结果的影响见图2-11。
图2-11 提取次数对提取结果的影响
由图2-11可以看出，第三次提取溶液的吸光度较低，从经济性考虑，只取两次提取液，第三次含量较少，不进行第三次提取。
以上述最佳提取条件得高粱红色素溶液，蒸干溶剂，得膏状物，再于80℃下放入烘箱中烘干，产率为8.5%，产品为棕色无定形粉末。
综合以上三种提取方法，得出如下结论：
单纯用乙醇提取，效果较差，不采用此法提取高粱红天然染料。而用氢氧化钠的水溶液及60%的乙醇溶液提取，效果较好。60%的乙醇溶液提取效果略好于氢氧化钠水溶液的提取效果。因氢氧化钠水溶液提取成本较低，方法简便，不需蒸馏乙醇，且提取的染液可直接用于染色。故本试验采用该方法提取的高粱红染液进行染色试验。
综上所述，确定高粱红天然染料的提取条件：
高粱壳80g放入1L NaOH溶液中，NaOH用量为20g/L，温度为100℃，时间为120min。提取两次。提取液定容为2000mL进行下面的染色试验，染液的浓度以X表示。
四、高粱红天然染料的光谱性质
本试验采用紫外—可见分光光度计测试高粱红溶液的最大吸收波长。从查阅的资料以及试验中发现，高粱红天然染料在水中的最大吸收波长在可见光区找不到，推测其值应在紫外光区［16］，且在pH＜4条件下的酸性水溶液中，高粱红部分沉淀析出［17］，影响吸光度的测定结果。而在乙醇水溶液中高粱红天然染料的溶解性较好。因此本试验pH＜7时选用40%乙醇—盐酸溶液为稀释液，pH=7时选用40%乙醇溶液为稀释液，pH＞7时选用40%乙醇溶液—氢氧化钠溶液为稀释液来测定其最大吸收波长。
取1mL上述溶液，分别用40%乙醇—盐酸溶液（pH=3、4、5、6时）、40%乙醇溶液（pH=7时）、40%乙醇溶液—氢氧化钠溶液（pH=8、9时）定容至100mL，以对应的稀释液为参比液，光程为1cm，用721型分光光度计在380～760nm之间测定其最大吸收波长，其光谱见图2-12。
图2-12 高粱红天然染料的光谱性质
从图2-12可以看出，pH为3、4时，最大吸收波长λmax=490nm；pH为5、6、7时，最大吸收波长λmax=500nm；pH为8、9时在可见光区找不到最大吸收波长，推测应在紫外光区。
高粱红天然染料的最大吸收波长λmax随pH变化而变化，因此试验必须在固定的pH下进行测试。
本试验均以40%乙醇—盐酸溶液（pH=3）为参比液和稀释液来测定不同提取条件下高粱红天然染料的吸光度，以保证数据的一致性。将提取并纯化的高粱红天然染料以溴化钾压片法做红外光谱测试，分析酸、碱及中性条件下的高粱红天然染料结构变化情况。
五、高粱红不同pH的红外光谱
pH=3、7、9时高粱红溶液于80℃烘箱中烘干，得到三种无定形粉末，pH=3时，粉末颜色较浅，pH=7、9时，粉末颜色加深。以KBr压片法做红外光谱图，如图2-13所示。
图2-13 不同pH时高粱红色素的红外光谱
通过对图2-13中不同pH条件下的红外光谱分析比较，可以得出以下结论。
（1）波数在3400～3520 cm-1及1200 cm-1附近的吸收峰，说明有—OH存在，在1550cm-1附近的吸收峰说明含有双键或共轭双键，1050～1100 cm-1附近的吸收峰说明含有醚键。
（2）波数在3500cm-1处的吸收随着pH的减小而增加，这种变化一方面可能是由于酚羟基的酸性引起的。另一方面的原因是强酸作用下羰基质子化也可以得到含有羟基结构的正离子（因为芳环的存在使正离子具有一定的稳定性），这种结构也为—OH吸收峰的增加做出一定的贡献。
高粱红的主要成分5，4′-二羟基异黄酮-7-O-半乳糖苷在酸、碱条件下的化学反应［18］如图2-14和图2-15所示。
图2-14 5，4′-二羟基异黄酮-7-O-半乳糖苷在酸性条件下的反应
图2-15 5，4′-二羟基异黄酮-7-O-半乳糖苷在碱性条件下的反应
高粱红的另一种成分5，4′—二羟基—6，8—二甲氧基异黄酮—7—O—半乳糖苷在酸、碱条件下的化学反应如图2-16和图2-17所示。
图2-16 5，4′-二羟基-6，8-二甲氧基异黄酮-7-O-半乳糖苷在酸性条件下的化学反应
图2-17 5，4′-二羟基-6，8-二甲氧基异黄酮-7-O-半乳糖苷在碱性条件下的化学反应
六、高粱红色素溶液的光稳定性
取浓度为X的提取液四份，每份1mL，用盐酸分别调节pH=3、5、7、9，定容至100mL，测吸光度值，然后将每种定容高粱红色素溶液分成两份，分别在室内自然光和无光条件下存放七天，室温为25℃，测定溶液吸光度的变化情况，结果如图2-18所示。
图2-18 不同pH下高粱红溶液的光稳定性
由图2-18可以看出，在pH分别为3和5时，在有光与无光条件下放置时，高粱红色素溶液的吸光度增大，pH分别为7和9时，在有光与无光条件下放置时，高粱红色素溶液的吸光度减小。然而，无论是酸性、中性还是碱性条件下，当高粱红溶液存放于暗处时，溶液的吸光度变化不大。有光条件下放置7天，在碱性及中性介质中吸光度减小程度较大，说明中性及碱性条件下高粱红溶液的耐光稳定性较差。而在酸性介质中吸光度变化不大，说明酸性条件下高粱红溶液的耐光稳定性较好。
七、高粱红天然染料提取液的标准工作曲线
将提取液用容量瓶定容至100mL的高粱红提取液，分别取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，然后用容量瓶以40%乙醇—盐酸溶液（pH=3）定容至100mL，以0.6mL稀释液测定最大吸收波长，λmax=490nm，与以上测试结果一致。然后在最大吸收波长下标定标准工作曲线，如图2-19所示。
图2-19 高粱红天然染料标准工作曲线
由图2-19可以看出，在染液浓度0～1.0g/L范围内，高粱红天然染料标准工作曲线基本为直线。
八、本节小结
1.高粱红色素的光谱性质
染料的最大吸收波长λmax是随pH的变化而变化的，pH为3、4时，最大吸收波长λmax=490nm；pH为5、6、7时，最大吸收波长λmax=500nm；pH为8、9时在可见光区找不到最大吸收波长，推测应在紫外光区。
2.高粱红色素的光稳定性
在室内自然光和无光存放7天，室温25℃，测定不同pH条件下经光照的高粱红色素溶液的吸光度变化情况。结果表明，高粱红色素在碱性条件下耐光稳定性较差，酸性条件下耐光稳定性较好。
3.高粱红色素提取方法的选择
溶剂种类、酸碱种类及浓度对提取的影响较大。用氢氧化钠的水溶液及60%的乙醇—水溶液提取效果较单纯以乙醇为溶剂提取效果好；60%的乙醇水溶液提取效果略好于氢氧化钠水溶液的提取效果；但氢氧化钠水溶液提取法成本较低，提取方法也较简便，不用蒸馏乙醇，且提取的染液可直接用于染色。
4.高粱红色素的最佳提取条件
高粱壳用量为80g/L，NaOH用量为20g/L，温度为100℃，时间为120min。提取次数为两次。
在本课题的研究中，从高粱壳中提取的高粱红天然染料溶出物收率较高，约为8.5%，获得的染料为粉状染料。
5.有待解决的问题
高粱红天然染料在pH=4、5时在水中的溶解性较差，需找到增加水中溶解性的方法，以提高其利用率。