第三节 细菌的接种法

一、目的与要求

（1）掌握微生物各种分离、接种的方法。

（2）掌握无菌操作的基本环节。

（3）完成一定数量的微生物接种任务。

二、原理

在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须把它们分离出来。将一种微生物移到另一种灭菌的培养基上称为接种。

分离培养微生物时，要考虑微生物对外界的物理、化学等因素的影响，即选择该类微生物最适合的培养基和培养条件。在分离、接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具使用前后都要经过火焰灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。

（1）菌种：大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、青霉菌。

（2）缓冲葡萄糖肉汤培养基试管垂直；缓冲葡萄糖肉汤固体培养基试管斜面；缓冲葡萄糖肉汤固体培养基平板；察氏培养基试管斜面；察氏培养基平板。

（3）接种环，接种针，接种钩，镊子，酒精灯，火柴，酒精棉，试管架，糨糊，标签纸，恒温培养箱等。

三、操作方法

细菌经分离培养出单个菌落后，常需再移种至其他培养基中，以进一步鉴定或保存菌种。根据接种培养基之物理性状，纯种细菌接种法可分为斜面培养基接种、液体培养基接种和半固体培养基穿刺接种法三类。

1．斜面培养基接种法

斜面培养基接种法一般用于纯培养。从平板上挑取单个菌落接种至斜面培养基上，培养后获得大量纯种细菌（有菌苔生长），可进一步对细菌进行鉴定或作为菌种保存。

（1）左手持菌种管与待接种的培养管，将两管并列，略倾斜，琼脂的斜面均向上。

（2）右手持接种环，在火焰上烧灼灭菌，待冷。

（3）以右手掌与小指、小指与无名指分别拨取并挟持两管盖塞，将两管口迅速通过火焰灭菌。

（4）用无菌冷却了的接种环伸入菌种管，从斜面上刮取菌苔少许，立即移入待接种的培养基管，自斜面底部向上划一直线，然后再由底部向上蜿蜒划线。取出接种环，管口通过火焰灭菌，塞回盖塞。做好标记后培养。次日观察细菌菌苔生长情况。

2．液体培养基接种法

液体培养基接种法，主要用于增菌培养或细菌鉴定。若接种于肉汤培养基，经37℃培养18～24小时后，可观察细菌的不同生长现象。其他的液体培养基，如葡萄糖蛋白胨水、各种单糖发酵管等，接种后大多供测定细菌生化反应之用。

（1）取接种环火焰烧灼灭菌，冷却。

（2）按照上述“双管接种法”一样的操作手法，左手持细菌斜面菌种和肉汤培养基两支试管。

右手持接种环，按无菌操作取少量细菌，在倾斜的管壁与液面交界处轻轻地研匀，试管直立时黏附管壁上的细菌浸入液体中，管口火焰灭菌，塞瓶塞，接种后放于37℃温箱中培养18～24小时后取出。

3．半固体穿刺接种法

半固体穿刺接种法，主要用于保存菌种或检查细菌有无动力，无动力的细菌在半固体培养基中沿穿刺线生长，有动力的细菌在半固体培养中呈扩散生长，甚至使培养基变得混浊。另外，此法也可用于细菌生化反应的检测，如接种于醋酸铅培养基、明胶培养基等。

（1）将接种针经火焰烧灼灭菌冷却后，从斜面培养物上蘸取细菌。

（2）用无菌操作穿刺接种，将接种针刺入半固体培养基的正中央，深度达距管底0.5cm处为止，然后顺原路退出，穿刺时要直进直出。接种针经火焰灭菌后放回原处。

（3）管口经火焰灭菌后，塞回盖塞，培养于37℃, 18～24小时后观察结果。

思维聚焦

比较斜面培养基接种法、液体培养基接种法和半固体穿刺接种法的原理及适用范围。

知识拓展

（1）大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%，是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。大肠杆菌能合成维生素B和维生素K，正常栖居条件下不致病；若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。大肠菌群数常作为饮水、食物或药物的卫生学标准。

（2）酒精灯是以酒精为燃料的加热工具，用于加热物体。酒精灯由灯体、灯芯管和灯帽组成。酒精灯的加热温度为400～500℃，适用于普通的微生物实验。