第四节 细菌的分离与培养
想一想，议一议：
1．无菌操作过程中应该注意哪些问题？
2．为什么冷却后才能在培养基上划线？
一、目的与要求
（1）掌握微生物的各种分离、培养方法。
（2）掌握无菌操作的基本环节。
（3）完成一定数量的微生物分离、培养任务。
二、原理
在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须把它们分离出来。将一种微生物移到另一种灭菌的培养基上称为接种。
分离培养微生物时，要考虑微生物受外界的物理、化学等因素的影响，即选择该类微生物最适合的培养基和培养条件。在分离、接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具无论使用前后都要经过火焰灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。
细菌的生长条件包括：①营养物质；②适宜温度；③一定的酸碱度；④适当的气体环境等。我们可根据细菌对营养、pH、渗透压的要求制备细菌培养基。把细菌接种于培养基后，放恒温箱（一般为37℃）内培养一定时间（通常18～24小时），细菌便可大量繁殖，可进一步观察和研究其生物学特性。
在接种和分离培养细菌时，常用接种环来蘸取细菌或标本，接种针则主要供作穿刺培养和挑取单个菌落之用。在使用接种环或接种针时，一般用右手以执笔式较为方便，左手可持培养基进行配合。
接种环和接种针结构
接种程序通常分为：①灭菌接种环（针）；②待冷；③蘸取细菌或标本；④进行接种；⑤灭菌接种环（针）5个步骤。不同的培养基，接种方法不尽相同，生长现象也各异：若细菌在液体培养基中生长，可表现为液体均匀混浊、出现菌膜或沉淀等不同现象；若在固体培养基上生长，可观察到菌苔（斜面培养）或菌落（平板分离培养）；在半固体培养基中可见扩散生长或沿接种线生长。
三、材料与仪器
吸管，培养皿，试管，接种环，接种针，培养基。
四、操作步骤
琼脂平板培养的方法很多，现以分区划线接种法为例。此方法可通过划线分离，充分利用培养基表面，分离出单个生长的菌落。
（1）在平板的底部用记号笔写上组别、标本名称或编号、日期等记号。
（2）右手握持接种环（执笔式）通过火焰灭菌，冷却后，取一接种环上述细菌混合液。
（3）再以左手握持平板培养基，使平板略呈垂直方向，并靠近火焰周围，以免空气中杂菌落入。然后将蘸有菌液的接种环，先在培养基一角涂成薄膜（涂膜面约占整个培养基表面1/10的①区）。
（4）烧灼接种环，以杀死环上剩余的细菌。冷却后，将接种环再通过①区薄膜处作连续划线（使环面与平板表面成30～40°角，以腕力在平板表面进行划线，注意勿将培养基划破），划出约占总表面积1/5的②区，同法，再分别划出③区、④区、⑤区。注意⑤区勿与①区接触。
平板分区划线分离法
分区划线接种法及培养后菌落分布示意图
（5）将划好的平板倒置于37℃培养箱，培养18～24小时后观察菌落的形状、大小、边缘、颜色、湿润度、透明度等，比较两种菌落的差异。
思维聚焦
使用涂布平板法和划线法如何能得到单菌落？
知识拓展
接种环是在生命科学试验中常用的一种实验室工具，广泛应用在微生物检测、细胞微生物、分子生物学等众多学科领域。接种环按材质不同一般可分为一次性的塑料接种环（塑料制成的）和金属接种环（钢、铂金或者镍铬合金）。
接种环的使用途径：
（1）划线法。用接种环粘取含菌材料，在固体培养基表面划线。
（2）点植法。用接种环在固体培养基表面接触几点。
（3）倾注法。取少许含菌材料放入无菌培养皿中，倾注已融化的48℃左右的琼脂培养基，摇匀冷却。
（4）穿刺法。用接种环粘取微生物穿刺而进入半固体培养基深层培养。
（5）侵洗法。用接种环挑去含菌材料，在液体培养基中冲洗。