第三节　仪器分析

20世纪40年代以后，一方面由于生产和科学技术发展的需要，另一方面由于物理学革命使人们的认识进一步深化，分析化学也发生了革命性的变革，从传统的化学分析发展为仪器分析。

仪器分析就是利用能直接或间接地表征物质的各种特性（如物理性质、化学性质、生理性质等）的实验现象，通过探头或传感器、放大器、分析转化器等转变成人可直接感受的已认识的关于物质成分、含量、分布或结构等信息的分析方法。也就是说，仪器分析是利用各种学科的基本原理，采用电学、光学、精密仪器制造、真空、计算机等先进技术探知物质化学特性的分析方法。因此仪器分析是体现学科交叉、科学与技术高度结合的一个综合性极强的科技分支。仪器分析的发展极为迅速，应用前景极为广阔。

仪器分析是化学学科的一个重要分支，它是以物质的物理性质和化学性质为基础建立起来的一种分析方法。利用较特殊的仪器，对物质进行定性分析、定量分析和形态分析。 

仪器分析方法所包括的分析方法目前有数十种之多。每一种分析方法所依据的原理不同，所测量的物理量不同，操作过程及应用情况也不同。

仪器分析的分析对象一般是半微量（0.01～0.10g）、微量（0.1～10mg）、超微量（<0.1mg）组分的分析，灵敏度高；而化学分析一般是半微量（0.01～0.10g）、常量（>0.1g）组分的分析，准确度高。

仪器分析大致可以分为电化学分析法、核磁共振波谱法、原子发射光谱法、气相色谱法、原子吸收光谱法、高效液相色谱法、紫外-可见光谱法、质谱分析法、红外光谱法和其他仪器分析法。

仪器分析主要特点如下：

①灵敏度高　大多数仪器分析法适用于微量、痕量分析。例如，原子吸收分光光度法测定某些元素的绝对灵敏度可达10-14g，电子光谱甚至可达10-18g。

②取样量少　化学分析法取样量为10-4～10-1g；仪器分析试样量常在10-8～10-2g。

③在低浓度下的分析准确度较高　含量在10-9%～10-5%的杂质测定，相对误差低达1%～10%。

④快速　例如，发射光谱分析法在1min内可同时测定水中的48个元素，灵敏度可达ng-1级。

⑤可进行无损分析　有时可在不破坏试样的情况下进行测定，适用于考古、文物等特殊领域的分析，试样可回收。有的方法还能进行表面或微区分析。

⑥能进行多信息或特殊功能的分析　有时可同时作定性、定量分析，有时可同时测定材料的组分比和原子的价态。放射性分析法还可作痕量杂质分析。

⑦专一性强　例如用单晶X衍射仪可专测晶体结构；用离子选择性电极可测指定离子的浓度等。

⑧便于遥测、遥控、自动化　可用于即时、在线分析控制生产过程、环境自动监测与控制。

⑨操作较简便　省去了繁多化学操作过程。随自动化、程序化程度的提高，操作将更趋于简化。

⑩仪器设备较复杂，价格较昂贵。

仪器分析自20世纪30年代后期问世以来，不断丰富了分析化学的内涵并使分析化学发生了一系列根本性的变化。随着科技的发展和社会的进步，分析化学将面临更深刻、更广泛和更激烈的变革。现代分析仪器的更新换代和仪器分析新方法、新技术的不断创新与应用，是这些变革的重要内容。

现代仪器分析涉及的范围很广，其中常用的有光学分析法、电化学分析法和色谱法。光学分析法是基于人们对物质光谱特性的认识而发展起来的一种分析测定方法。17世纪牛顿将白光分成了光谱以后，科学家对光谱进行了研究。19世纪前半期，人们已经把某一特征谱线和某种物质联系了起来，并提出了光谱定性分析的概念。在此基础上，德国化学家本生和物理学家基尔霍夫合作设计并制造了第一台用于光谱分析的光谱仪，实现了从光谱学原理到光谱分析的过渡，产生了一种新的分析方法即光谱分析法。19世纪后半期，人们又对光谱定量分析的可能性进行了探讨。1874年，洛克厄通过大量实验得出结论，认为光谱定量分析只能依据光谱线的强弱。到20世纪，用光电量度法测定了光谱线的强度。后来，光电倍增管被应用于光谱定量分析。与此同时，光谱分析中的另一种方法即利用物质的吸收光谱的吸收光度法，也得到了发展。

电化学分析法是利用物质的电化学性质发展起来的一种分析方法。

电化学分析法中首先兴起的是电重量分析法。美国化学家吉布斯把电化学反应应用于分析化学中，用电解法测定铜，后来这种方法被广泛应用于生产中。电重量分析法存在着耗时长、易氧化等缺点，化学家在研究中把物质的电化学性质与容量分析法结合起来，发展出了一种新方法，这就是电容量分析法。电容量分析法中发展较早的是电位滴定法。其后，极谱分析法和库仑分析法也相继发展起来。

色谱分析法是基于色谱现象而发展起来的一种分析方法。1906年，俄国植物学家茨维特认识到所谓色谱现象和分离方法有密切联系，而且对分离有重大意义。他用这种方法分离了植物色素，并系统地研究了上百种吸附剂，奠定了色谱分析法的基础。20世纪30年代，具有离子交换性能的合成树脂问世，解决了一系列疑难问题，进一步发展了色谱分离技术。由于单纯的分离意义不大，20世纪50年代，人们开始将分离方法和各种检测系统连接起来，分离与分析同时进行，设计和制造了大型色谱分析仪。

除了上述的方法以外，现代仪器分析法还有核磁共振法、射线分析法、电子能谱法、质谱法等。

分析化学中的分析是分离和测定的结合，分离和测定是构成分析方法的两个既相独立又相联系的基本环节。分离是使物质纯化的一种手段，而纯化的背后是物质的不纯，是物质具有混合性。我们知道，化学家所说的物质指的是物质本身，是某种单质或化合物。这里所说的物质本身，意思是以纯粹的形式存在的物质，没有其他物质混合于其中的物质，也就是人们通常所说的纯物质。可是，无论是天然存在的还是人工制造的物质，都不是绝对纯的，绝对纯是达不到的，绝对纯只能在理论中或思想上存在。因此，在化学分析中，首先遇到的矛盾就是纯与不纯的矛盾。

分离是纯化物质的一种手段。分离一般有两条基本途径：一条是将所要分析的物质从混合物中提取出来，另一条则是将杂质提取出来。这两条途径是同一原理的两种不同的实现方式，它们互为正反，互为表里。在分析化学发展的历史中，产生了许多分离方法。在古代，在酿造业中应用了蒸馏、结晶等分离手段；在近代，产生了各种各样的分离方法，如沉淀分离、溶剂萃取分离、离子交换分离、电解分离等。分离是有限度的。有些混合物由于性质非常相似，分离非常困难，如果不分离，共存的组分又互相干扰。在化学分析中，常常使用从分离操作中演变出的其他方法，如掩蔽方法。

在仪器分析的发展史上，试样和试剂有不同的发展形式和内容。在早期，需要分析的是自然物，如矿石和植物，本身就是试样，而与其发生作用而进行鉴别的主要是火。后来，被分析的是溶液，与之发生变化的也是溶液，这时，试样和试剂都是溶液。人们最早使用的试剂是一种叫五倍子的植物浸液，被用于测定矿泉水中的铁。随着实践和认识的发展，大量植物浸液被应用于化学分析之中，形成了天然植物试剂系列。在应用天然试剂的过程中，人们也在研究如何制备化学试剂。世界上第一个人工制备的分析化学试剂是黄血盐溶液，由此开创了化学试剂的新领域，拓宽了分析化学的研究范围。

随着生产、生活和科学的发展，作为被分析的试样，其外延扩大了，从单一的自然物发展为自然物和人工产物。试样的内涵深化了，要求分析的内容不再局限于物质的定性组成，还要求分析各组分的含量。与此同时，试剂的种类越来越多，应用范围也越来越广。一种试样可以用多种试剂进行分析，一种试剂也可用于分析多种试样，同时还产生了类似于系统分析中组成试剂的一般性试剂。

在当代，被分析的试样既有各类混合物，也有一些纯净的化合物，既要求进行元素分析，还要求进行结构分析、生物大分子的测定等。试剂也有很大发展，应用于分析化学的试剂，有各种物理化学试剂、有机试剂和生化试剂，还研究和制备了一系列相对于某种分析方法的专用试剂、特效试剂和特殊试剂。

在分析过程中，又产生了一种关系，这就是灵敏度和准确度的关系。灵敏度是被测组分浓度或含量改变一个单位所引起的测量信号的变化。若考虑分析时存在噪声等因素，灵敏度实际上就是被测组分的最低检出限。准确度是测量值的可靠程度，实质上是测量值与真实值的接近程度，一般用误差来表示。在分析中，既要求分析方法具有一定的灵敏度，又要求具有一定的准确度。就具体的分析方法来说，灵敏度和准确度常常发生矛盾。有的分析方法有较高的准确度，却不够灵敏；有的分析方法灵敏度较高，但却不够准确。前者如重量分析法，后者如比色分析法。现代科学技术的发展，要求高准确度和高灵敏度，现代仪器分析正是适应这种要求而发展起来的。

在分析化学发展的初期，人们只是在实践中掌握了一些简单的分析、检验方法，当时既没有化学理论，也没有分析方法的理论。随着分析、检验实践的进步和发展，各种分析和检验方法被应用于生产、生活和科学研究之中，并对这些方法进行了概括和总结，形成了分析化学理论，分析化学才真正成为一门科学。

在仪器分析的发展中，理论和方法的相互作用需要中介和桥梁，这就是技术。理论要起指导作用，要转化为方法，需要特定的仪器、设备和试剂。而制作和使用仪器或工具，正是通常所说的技术的特点。例如，光谱学原理早在牛顿时期就已初步形成，到18世纪已经发展成熟，利用特征光谱线进行物质的鉴定的思想也已有人提出，但是直到19世纪中期，才实现了光谱分析。其原因在于，到这个时候才应用光谱学原理制作出了可用于分析的光谱仪。技术是实现和实施方法的保证，仪器分析方法尤其如此。

现代仪器分析应用了现代分析化学的各项新理论、新方法、新技术，把光谱学、量子学、傅里叶变换、微积分、模糊数学、生物学、电子学、电化学、激光、计算机及软件成功地运用到现代分析的仪器上，研发了原子光谱（原子吸收光谱、原子发射光谱、原子荧光光谱）法、分子光谱（UV、IR、MS、NMR、Flu）法、色谱（GC、LC）法、分光光度法、激光光谱法、拉曼光谱法、流动注射分析法、极谱法、离子选择性电板法、火焰光度分析法等现代仪器分析方法。计算机的应用则极大地提高了仪器分析能力。现代分析仪器灵敏度高、选择性好、检出限低、准确性好，可进行数据处理和显示分析结果，实现了分析仪器的自动化和样品的连续测定。

现代科学技术的发展、生产的需要和人们生活水平的提高，对分析化学提出了新的要求，为了适应科学发展，仪器分析随之也将出现一些发展趋势。

①方法创新　需要进一步提高仪器分析方法的灵敏度、选择性和准确度。各种选择性检测技术和多组分同时分析技术等是当前仪器分析研究的重要课题。

②分析仪器智能化　计算机在仪器分析法中不仅只运算分析结果，而且可以储存分析方法和标准数据，控制仪器的全部操作，实现分析操作自动化和智能化。

③新型动态分析检测和非破坏性检测　离线的分析检测不能瞬时、直接、准确反映生产实际和生命环境的情景实况，不能及时控制生产、生态和生物过程。运用先进的技术和分析原理，研究并建立有效实用的实时、在线、高灵敏度、高选择性的新型动态分析检测和非破坏性检测，将是21世纪仪器分析发展的主要方向。生物传感器和酶传感器、免疫传感器、DNA传感器、细胞传感器等不断涌现。纳米传感器的出现也为活体分析带来了机遇。

④多种方法的联合使用　仪器分析多种方法的联合使用可以使每种方法的优点得以发挥，每种方法的缺点得以补救。联用分析技术已成为当前仪器分析的重要发展方向。

⑤扩展时空多维信息　随着环境科学、宇宙科学、能源科学、生命科学、临床化学、生物医学等学科的兴起，现代仪器分析的发展已不局限于将待测组分分离出来进行表征和测量，而且成为一门为物质提供尽可能多的化学信息的科学。随着人们对客观物质认识的深入，某些过去所不甚熟悉的领域（如多维、不稳定和边界条件等）的研究也逐渐提到日程上来。采用现代核磁共振光谱、质谱、红外光谱等分析方法，可提供有机物分子的精细结构、空间排列构成及瞬态变化等信息，为人们对化学反应历程及生命的认识提供了重要信息。

总之，仪器分析正在向快速、准确、灵敏及适应特殊分析的方向迅速发展。

一、紫外光谱分析

紫外吸收光谱和可见吸收光谱都属于分子光谱，它们都是由于价电子的跃迁而产生的。利用物质的分子或离子对紫外和可见光的吸收所产生的紫外可见光谱及吸收程度可以对物质的组成、含量和结构进行分析、测定、推断。

在有机化合物分子中有形成单键的σ电子、有形成双键的π电子、有未成键的孤对n电子。当分子吸收一定能量的辐射能时，这些电子就会跃迁到较高的能级，此时电子所占的轨道称为反键轨道，而这种电子跃迁同内部的结构有密切的关系。 

紫外可见吸收光谱应用广泛，不仅可进行定量分析，还可利用吸收峰的特性进行定性分析和简单的结构分析，测定一些平衡常数、配合物配位比等；也可用于无机化合物和有机化合物的分析，对于常量、微量、多组分都可测定。紫外可见吸收光谱采用紫外可见分光光度计测定。

物质的紫外吸收光谱基本上是其分子中生色团及助色团的特征，而不是整个分子的特征。如果物质组成的变化不影响生色团和助色团，就不会显著地影响其吸收光谱，如甲苯和乙苯具有相同的紫外吸收光谱。另外，外界因素如溶剂的改变也会影响吸收光谱，在极性溶剂中某些化合物吸收光谱的精细结构会消失，成为一个宽带。所以，只根据紫外光谱是不能完全确定物质的分子结构，还必须与红外吸收光谱、核磁共振波谱、质谱以及其他化学、物理方法共同配合才能得出可靠的结论。

1.化合物的鉴定

利用紫外光谱可以推导有机化合物的分子骨架中是否含有共轭结构体系，CC—CO、苯环等。利用紫外光谱鉴定有机化合物远不如利用红外光谱有效，因为很多化合物在紫外没有吸收或者只有微弱的吸收，并且紫外光谱一般比较简单，特征性不强。利用紫外光谱可以用来检验一些具有大的共轭体系或发色官能团的化合物，可以作为其他鉴定方法的补充。

①如果一个化合物在紫外区是透明的，则说明分子中不存在共轭体系，不含有醛基、酮基或溴和碘。可能是脂肪族碳氢化合物、胺、腈、醇等不含双键或环状共轭体系的化合物。

②如果在210～250nm有强吸收，表示有K吸收带，可能含有两个双键的共轭体系，如共轭二烯或α，β-不饱和酮等。同样在260nm、300nm、330nm处有高强度为K吸收带，表示有三个、四个和五个共轭体系存在。

③如果在260～300nm有中强吸收（ε=200～1000），则表示有B带吸收，体系中可能有苯环存在。如果苯环上有共轭的生色基团存在时，则ε可以大于10000。

④如果在250～300nm有弱吸收带（R吸收带），则可能含有简单的非共轭并含有n电子的生色基团，如羰基等。

2.纯度检查

如果有机化合物在紫外可见光区没有明显的吸收峰，而杂质在紫外区有较强的吸收，则可利用紫外光谱检验化合物的纯度。

3.异构体的确定

对于异构体的确定，可以通过经验规则计算出λmax值，与实测值比较，即可证实化合物是哪种异构体。如乙酰乙酸乙酯的酮-烯醇式互变异构。

4.位阻作用的测定

由于位阻作用会影响共轭体系的共平面性质，当组成共轭体系的生色基团近似处于同一平面，两个生色基团具有较大的共振作用时，λmax不改变，εmax略为降低，空间位阻作用较小；当两个生色基团具有部分共振作用，两共振体系部分偏离共平面时，λmax和εmax略有降低；当连接两生色基团的单键或双键被扭曲得很厉害，以致两生色基团基本未共轭，或具有极小共振作用或无共振作用，剧烈影响其UV光谱特征时，情况较为复杂化。在多数情况下，该化合物的紫外光谱特征近似等于它所含孤立生色基团光谱的“加合”。

5.氢键强度的测定

溶剂分子与溶质分子缔合生成氢键时，对溶质分子的UV光谱有较大的影响。对于羰基化合物，根据在极性溶剂和非极性溶剂中R带的差别，可以近似测定氢键的强度。 

6.定量分析

朗伯-比尔定律是紫外-可见吸收光谱法进行定量分析的理论基础，它的数学表达式为：

A=εbc

各种因素对吸收谱带的影响表现为谱带位移、谱带强度的变化、谱带精细结构的出现或消失等。

谱带位移包括蓝移（或紫移，hypsochromic shift or blue shift）和红移（bathochromic shift or red shift）。蓝移（或紫移）指吸收峰向短波长移动，红移指吸收峰向长波长移动。吸收峰强度变化包括增色效应（hyperchromic effect）和减色效应（hypochromic effect）。前者指吸收强度增加，后者指吸收强度减小。

影响有机化合物紫外吸收光谱的因素有内因（分子内的共轭效应、位阻效应、助色效应等）和外因（溶剂的极性、酸碱性等溶剂效应）。由于受到溶剂极性和酸碱性等的影响，将使这些溶质的吸收峰的波长、强度以及形状发生不同程度的变化。这是因为溶剂分子和溶质分子间可能形成氢键，或极性溶剂分子的偶极使溶质分子的极性增强，因而在极性溶剂中π→π* 跃迁所需能量减小，吸收波长红移（向长波长方向移动）；而在极性溶剂中， n→π* 跃迁所需能量增大，吸收波长蓝移（向短波长方向移动）。

极性溶剂不仅影响溶质吸收波长的位移，而且还影响吸收峰吸收强度和它的形状，如苯酚的B吸收带，在不同极性溶剂中，其强度和形状均受到影响。在非极性溶剂正庚烷中，可清晰地看到苯酚B吸收带的精细结构，但在极性溶剂乙醇中，苯酚B吸收带的精细结构消失，仅存在一个宽的吸收峰，而且其吸收强度也明显减弱。许多芳香烃化合物中均有此现象，这是由于有机化合物在极性溶剂中存在溶剂效应。所以在记录紫外吸收光谱时，应注明所用的溶剂。

另外，由于溶剂本身在紫外光谱区也有其吸收波长范围，故在选用溶剂时，必须考虑它们的干扰。

测定单体香料紫外吸收图谱采用紫外可见分光光度计（见图2-13）。每一个单体香料化合物都有自己的紫外吸收图谱，例如苯甲酸与水杨酸的紫外图谱见图2-14（1为苯甲酸，2为水杨酸）。

苯甲醇及其包合物的紫外图谱见图2-15。

利用紫外吸收图谱可以帮助我们对许多香料进行定性分析，但香料香精的分析更多的是在应用液相色谱分析时，利用紫外检测器对色谱分离出来的每一个峰进行的定性分析，详见“液相色谱分析”一节。

二、红外光谱分析

将一束不同波长的红外射线照射到物质的分子上，某些特定波长的红外射线被吸收，形成这一分子的红外吸收光谱。每种分子都有由其组成和结构决定的独有的红外吸收光谱，据此可以对分子进行结构分析和鉴定。红外吸收光谱是由分子不停地作振动和转动运动而产生的。分子振动是指分子中各原子在平衡位置附近做相对运动，多原子分子可组成多种振动图形。当分子中各原子以同一频率、同一相位在平衡位置附近作简谐振动时，这种振动方式称简正振动（例如伸缩振动和变角振动）。分子振动的能量与红外射线的光量子能量正好对应，因此当分子的振动状态改变时，就可以发射红外光谱，也可以因红外辐射激发分子而振动而产生红外吸收光谱。分子的振动和转动的能量不是连续而是量子化的。但由于在分子的振动跃迁过程中也常常伴随转动跃迁，使振动光谱呈带状，所以分子的红外光谱属带状光谱。

红外光谱仪（图2-16）的种类有：

①镜和光栅光谱仪。属于色散型，它的单色器为棱镜或光栅，属单通道测量。

②傅里叶变换红外光谱仪。它是非色散型的，其核心部分是一台双光束干涉仪。当仪器中的动镜移动时，经过干涉仪的两束相干光间的光程差就改变，探测器所测得的光强也随之变化，从而得到干涉图。经过傅里叶变换的数学运算后，就可得到入射光的光谱。

这种仪器的优点：

①通道测量，使信噪比提高。

②光通量高，提高了仪器的灵敏度。

③波数值的精确度可达0.01cm-1。

④增加动镜移动距离，可使分辨本领提高。

⑤工作波段可从可见区延伸到mm区，可以实现远红外光谱的测定。

红外光谱分析可用于研究分子的结构和化学键，也可以作为表征和鉴别化学物种的方法。红外光谱具有高度特征性，可以采用与标准化合物的红外光谱对比的方法来做分析鉴定。已有几种汇集成册的标准红外光谱集出版，可将这些图谱储存在计算机中，用以对比和检索，进行分析鉴定。利用化学键的特征波数来鉴别化合物的类型，并可用于定量测定。由于分子中邻近基团的相互作用，使同一基团在不同分子中的特征波数有一定变化范围。此外，在高聚物的构型、构象、力学性质的研究以及物理、天文、气象、遥感、生物、医学等领域也广泛应用红外光谱。

例如苯甲酸的红外光谱图如图2-17所示。

乙酸龙脑酯的红外光谱图如图2-18所示。

麝香草酚的红外光谱图如图2-19所示。

γ-戊内酯的红外光谱图如图2-20所示。

四氢呋喃的红外光谱图如图2-21所示。

利用红外吸收图谱可以帮助我们对许多香料进行定性分析，但香料香精的分析更多的是在应用气相色谱分析时，利用红外检测器对色谱分离出来的每一个峰进行的定性分析，详见“气相色谱分析”和“气红联用分析”两节。

三、荧光分析

荧光分析是利用某些物质被紫外光照射后处于激发态，激发态分子经历一个碰撞及激发过程所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析。

特点：灵敏度高 达10-12～10-10g/mL，但应用不如UV广泛。

应用：直接荧光光度法；作为HPLC的检测器（用得较多）。

根据物质分子吸收光谱和荧光光谱能级跃迁机理，具有吸收光子能力的物质在特定波长光（如紫外光）照射下可在瞬间发射出比激发光波长的光，即荧光。

例如SO2分子受特定光照射后处于激发态的SO2分子返回基态时发出荧光，其荧光强度与SO2呈线性关系，从而可测出气体浓度。当检测仪器系统确定后，荧光总光强I与SO2浓度之间的关系可表示为：

I=kc

在稳定的条件下，这些参数也随之确定，k可视为常数。因此，I=kc表示紫外荧光光强I与样气的浓度c成线性关系。这是紫外荧光法进行定量检测的重要依据。

直接测定法：利用物质自身发射的荧光进行测定分析。

间接测定法：由于有些物质本身不发射荧光（或荧光很弱），这就需要把不发射荧光的物质转化成能发射荧光的物质。如用某些试剂（如荧光染料），使其与不发射荧光的物质生成各种络合物，络合物能发射荧光，再进行测定。因此荧光试剂的使用，对一些原来不发射荧光的无机物质和有机物质进行荧光分析打开了大门，扩展了分析的范围。

不管是直接测定还是间接测定，一般是采用标准工作曲线法，取各种已知量的荧光物质，配成一系列的标准溶液，测定出这些标准溶液的荧光强度，然后给出荧光强度对标准溶液的浓度的工作曲线。在同样的仪器条件下，测定未知样品的荧光强度，然后从标准工作曲线上查出未知样品的浓度（即含量）。

一般常用的荧光分析仪器有：目测荧光仪（荧光分析灯）、荧光光度计（图2-22）和荧光分光光度计三种。

荧光分析是一种先进的分析方法，它比电子探针法、质谱法、光谱法、极谱法等都应用得较广泛和普及，这同荧光分析具有的很多优点分不开。荧光分析所用的设备较简单，如目测荧光仪和荧光光度计构造非常简单完全可以自己制造。比起质谱仪、极谱仪和电子探针仪来在造价上要便宜很多倍，而且荧光分析的最大特点是分析灵敏度高、选择性强和使用简便。同时具备这三大特点的仪器并不多。

荧光分析法的最大特点是灵敏度高，对某些物质的微量分析可以检测到10-9g数量级。荧光分析的灵敏度比分光光度法的灵敏度高2～3个数量级，这是由于荧光分析的荧光和入射光之间成直角，而不在一条直线上，所以是在黑背景下检测荧光。而分光光度法的接收器与入射光在一条直线上，是在亮背景下检测。因此荧光分析法比分光光度法灵敏度高。分光光度法的灵敏度一般只能检测到10-6g，两者相差三个数量级。当然荧光分析法比起带电子显微镜的电子探针法灵敏度又低一些，然而电子探针仪器价格昂贵，使用不方便。

荧光分析的第二个特点是选择性强，特别是对有机化合物而言。因荧光光谱既包括激发光谱又包括发射光谱，凡是能发射荧光的物质，必须首先吸收一定波长的紫外线，而吸收了紫外线后不一定就发射荧光。能发射荧光的物质，其荧光波长也不尽相同。即使荧光光谱相同，它的激光光谱也不一定相同。反之如果它们的激发光谱相同，则可用发射光谱把它们区分开来，因此供选择的余地是比较多的，所以荧光分析的选择性很强。例如有两种物质，它们的荧光光谱很相似，不易把它们分开。但它们的激光光谱不会相同，因此就可用扫描激光光谱把它们分开。如果用分光光度法就难以办到这一点，因为分光光谱只能得到待测物质的特征吸收光谱。所以分光光度法的选择性就没有荧光分析法强。

目前利用荧光光度法直接测定香料、香精和香制品的实例不多，但通过测定、分析各种香辛料、精油样品的抗氧化性时，则常用荧光光度法测定其对羟基自由基的清除率。

芳香化合物都有荧光，在乙醇溶液里，它们的谱带限度：苯255～300nm，甲苯261～300nm，邻二甲苯260～320nm，间二甲苯267～280nm，对二甲苯265～290nm，苯酚287～350nm，邻甲苯酚287～385nm，间甲苯酚286～385nm，对甲苯酚292～385nm；在己烷溶液里，联苯294～365nm，二苯甲烷272～320nm，联苄基270～320nm，二苯醚284～368nm，二苯胺326～415nm；在液体溶液中，喹啉385～490nm，7-羟基香豆素为蓝色荧光；在酸性溶液中，吖啶425～454nm，为蓝绿色荧光。

吲哚和15种吲哚环的第3或第5位有取代基的衍生物，在强碱的甲醛溶液中，显出的荧光在380～460nm。

表2-3是几个香料的直接荧光分析方法。

所有的醇都能与8-羟基喹啉钒盐反应生成络合物，所生成的络合物水解，释放出的8-羟基喹啉再与镁络合生成荧光产物，利用这一反应可做醇的荧光测定，其灵敏度可达微克级。利用此方法可做所有醇类香料的荧光分析。

酚在硫酸介质中与乙酰乙酸乙酯缩合生成香豆素，呈蓝-蓝紫色荧光。利用此方法可做所有酚类香料的荧光分析。

水杨酸酯可在碱性的二甲基甲酰胺溶剂中直接做荧光测定。

事实上，所有单体香料都可以采用化学“修饰”、络合等方法做荧光检测，只是目前这类工作还未得到香料分析工作者的重视。

四、核磁共振分析

核磁共振主要是由原子核的自旋运动引起的。不同的原子核，自旋运动的情况不同，它们可以用核的自旋量子数I来表示。自旋量子数与原子的质量数和原子序数之间存在一定的关系，大致分为三种情况：I值为0的原子核可以看做是一种非自旋的球体。I为1/2的原子核可以看做是一种电荷分布均匀的自旋球体，1H、13C、15N、19F、31P的I均为1/2，它们的原子核皆为电荷分布均匀的自旋球体。I大于1/2的原子核可以看做是一种电荷分布不均匀的自旋椭球体。

核磁共振波谱法是研究处于强磁场中的原子核对射频辐射的吸收，从而获得有关化合物分子结构信息的分析方法。以1H核为研究对象所获得的谱图称为氢核磁共振波谱图；以13C核为研究对象所获得的谱图称为碳核磁共振波谱图。核磁共振波谱与红外吸收光谱具有很强的互补性，已成为对有机和无机化合物结构分析强有力的工具之一。近年来，核磁共振波谱分析技术发展迅速，超导核磁、二维和三维核磁-脉冲傅里叶变换核磁等技术的应用也日益广泛。

连续波核磁共振波谱仪 CW-NMR：如今使用的核磁共振仪有连续波（continal wave，CW）及脉冲傅里叶（PFT）变换两种形式。连续波核磁共振仪主要由磁铁、射频发射器、检测器、放大器及记录仪等组成。磁铁用来产生磁场，主要有永久磁铁、电磁铁、超导磁铁三种。

CW-NMR价格低廉，易操作，但是灵敏度差。因此需要的样品量大，且只能测定如1H/19F/31P之类天然丰度很高的核，对诸如13C之类低丰度的核则无法测定。

核磁共振波谱仪（图2-23）的分辨率多用频率表示（也称“兆数”），其定义是在仪器磁场下激发氢原子所需的电磁波频率。如一台磁场强度为9.4T的超导核磁中，氢原子的激发频率为400MHz，则该仪器为“400M”的仪器。频率高的仪器，分辨率好，灵敏度高，图谱简单易于分析。磁铁上备有扫描线圈，用来保证磁铁产生的磁场均匀，并能在一个较窄的范围内连续精确变化。射频发射器用来产生固定频率的电磁辐射。波检测器和放大器用来检测和放大共振信号。记录仪将共振信号绘制成共振图谱。

20世纪70年代中期出现了脉冲傅里叶核磁共振仪，它的出现使13C核磁共振的研究得以迅速开展。 

脉冲变换傅里叶核磁共振波谱仪（pulse Fourier transform-NMR）与连续波仪器不同，它增设了脉冲程序控制器和数据采集处理系统，利用一个强而短（1～50μs）的脉冲将所有待测核同时激发，在脉冲终止时及时打开接收系统，采集自由感应衰减信号（FID），待被激发的核通过弛豫过程返回平衡态时再进行下一个脉冲的激发。得到的FID信号是时域函数，是若干频率的信号的叠加，在计算机中经过傅里叶变换转变为频域函数才能被人们识别。PFT-NMR在测试时常进行多次采样，而后将所得的总FID信号进行傅里叶变换，以提高灵敏度和信噪比（进行n次累加，信噪比提高n1/2倍）。傅里叶变换离子回旋共振质谱仪见图2-24。

PFT-NMR灵敏度很高，可以用于低丰度核，测试时间短（扫一次一到几秒），还可以测定核的弛豫时间，使得利用核磁共振测定反应动态成为现实。

香叶醇-β-D-葡萄糖苷 （gerany-1β-D-glycoside，GGLY），结构如图2-25所示。天然存在于茶叶等植物中，是挥发性香料物质香叶醇的糖苷键合态风味前体，其本身没有香气，在植物成熟期间通过酶水解释放出配基——香叶醇。也可以通过加酸、加热、紫外辐射、光照等方式分解释放出配基，可作为新型的、热稳定型香原料。有一个香叶醇糖苷的1H NMR中，在D 4.35附近出现双重峰，耦合常数J1-2=7.8Hz，这是葡萄糖环上的C1—H的化学位移，它受两个杂原子的去屏蔽作用，化学位移明显移向低场，根据β-型J1a-2a=7.0～10.0Hz，α-型J1e-2a=2.5～3.5Hz的规律，证明它为β-型糖苷。

有报道称某种肉香香气物质（挥发性）的分析方法如下：利用活性炭或纤维针对香气物质进行物理吸附，然后通过气相色谱进行分离，最后用质谱进行物质鉴定。这一过程即为顶空分析，通过该方法可以完成对香气成分的定性、定量分析。对非挥发性的香味物质可以采用常规的分离方法（如凝胶过滤、离子交换树脂、高效液相色谱等）进行分离，然后再通过紫外分光光度法、红外吸收光谱法、核磁共振波谱法等对物质进行分析鉴定。

覆盆子酮是一种具有幽雅果香香韵的香料，广泛用于食用香精、化妆品用香精的调配及医药中间体的合成。以对羟苯甲醛为主要原料，通过Claisen-Schmidt缩合、加氢还原二步反应合成覆盆子酮，根据气味分子结构理论设计合成了四个覆盆子酮类似物，采用红外光谱、核磁共振及质谱等分析方法对合成产物的结构进行了表征，并经调香师对其进行评香，确定这些化合物具有作为香料的应用前景。

有关资料表明，目前新发现的和新合成的香料大多是用核磁共振、红外光谱、紫外光谱及质谱等分析方法对其进行表征的，与香叶醇糖苷类似的“香料前期物”（潜香物质）则几乎都用核磁共振法表征。

五、同位素分析

自然界中碳元素有三种同位素，即稳定同位素12C、13C和放射性同位素14C，14C的半衰期为5730年。14C的应用主要有两个方面：一是在考古学中测定生物死亡的年代，即放射性测年法；二是以14C标记化合物作为示踪剂，探索化学和生命科学中的微观运动。

利用宇宙射线产生的放射性同位素14C来测定含碳物质的年龄，就叫14C测年。

14C测年法是如何测定古代遗存物的年龄呢？

原来，宇宙射线在大气中能够产生放射性14C，并能与氧结合成二氧化碳形后进入所有活组织，先为植物吸收，后为动物纳入。只要植物或动物生存着，它们就会持续不断地吸收14C，在机体内保持一定的水平。而当有机体死亡后，即会停止呼吸14C，其组织内的14C便以5730年的半衰期开始衰变并逐渐消失。对于任何含碳物质，只要测定剩下的放射性14C的含量，就可推断其年代。

植物进行光合作用吸入大气层中的二氧化碳，然后又被动物进食，故此所有生物都固定的与大自然交流着14C，直至它们死亡。一旦它们死亡，这个交流就会停止，14C的含量就会通过放射衰变逐步减少。这个衰变可以用来计量一个已死的生物的死亡时间。

当生物体死亡后，新陈代谢停止，由于14C的不断衰变减少，因此体内14C和12C含量的相对比值相应不断减少。通过对生物体出土化石中14C和12C含量的测定，就可以准确算出生物体死亡（即生存）的年代。例如某一生物体出土化石，经测定含碳量为M（g）（或12C的质量），按自然界碳的各种同位素含量的相对比值可计算出，生物体活着时，体内14C的质量应为m（g）。但实际测得体内14C的质量内只有m的1/8，根据半衰期可知生物死亡已有了3个5730年了，即已死亡了17290年了。美国放射化学家W.F.利比因发明了放射性14C测年代的方法，为考古学做出了杰出贡献而荣获1960年诺贝尔化学奖。

14C测年法分为常规14C测年法和加速器质谱14C测年法两种。当时，Libby发明的就是常规14C测年法。1950年以来，这种方法的技术与应用在全球有了显著进展，但它的局限性也很明显，即必须使用大量的样品和较长的测量时间。于是，加速器质谱14C测年技术发展起来了。

加速器质谱14C测年法具有明显的独特优点。一是样品用量少，只需1～5mg样品就可以了，如一小片织物、骨屑、古陶瓷器表面或气孔中的微量碳粉都可测量，而常规14C测年法则需1～5g样品，相差3个数量级；二是灵敏度高，其测量同位素比值的灵敏度可达10-16～10-15，而常规14C测年法则与之相差5～7个数量级；三是测量时间短，测量现代碳若要达到1%的精度，只需10～20min，而常规14C测年法却需12～20h。

正是由于加速器质谱14C测年法具有上述优点，自其问世以来，一直为考古学家、古人类学家和地质学家所重视，并得到了广泛的应用。可以说，对测定50000年以内的文物样品，加速器质谱14C测年法是测定精度最高的一种。

由于14C含量极低，而且半衰期很长，所以用14C只能准确测出5万～6万年以内的出土文物，对于年代更久远的出土文物，如生活在50万年以前的周口店北京猿人，利用14C测年法是无法测定出来的。

14C测定年代方法在技术上不同于一般放射性同位素测量，它的特点是放射性强度弱，能量低，自然碳中14C含量仅为1.2×10-10%，每克碳的放射性强度仅几微微居里，即每分钟约有10多个原子衰变，标本的年代越久远，放射性还会迅速降低，如20000年以上的标本，其计数率就会降到每分钟一次以下，针对这种情况，必须专门设计低本底和低能量β射线的高效率探测器，把标本中的碳制备成探测器的组成部分，并在特制的屏蔽室中进行测量，如气体法将标本碳全部转成计数管中的计数气体，液体法则全部转成闪烁液的溶剂，这些基本要求就决定了14C年代测定必须要有一个完备的实验室，包括设有化学处理、标本制备的系统，完善的屏蔽设备，特制的探测器和能长时间工作而又稳定的电子测量系统，并且经过精心的操作才能保证数据准确可靠。

原本的测量是借由数出个别碳原子的放射衰变量（见液相闪烁计数），但这是一个不灵敏和受制于统计误差的测量：在开始的时候已并不多的14C，而由于此其半衰期很长，故很少原子会发生衰变，所以探测它们变得相当困难[例：刚死去时的衰变为4原子/（s·mol），10000年后衰变为 1原子/（s·mol）]。

利用粒子加速器（质谱仪）的技术，14C可以直接数出，灵敏度和敏感度因而大大提升。粗略的放射性碳年数通常以BP（before present）来表示。BP就是从1950年起以前的放射性碳年数。这是一个名义上于1950年14C在大气层水平（假定这个水平不变，见下文“校准”）。

同位素指质子数相同而中子数不同的同种化学元素，最常用的稳定同位素有碳-13（13C）、氮-15（15N）、氢-2（2H即氘）和氧（18O）等。因为这些同位素比普通元素重1到2个原子量单位，所以也叫作重元素。稳定同位素（stable isotope） 就是天然同位素或非放射性同位素 （non-radioactive isotope），即无辐射衰变，质量保持永恒不变。稳定同位素在自然界无处不在，包括所有化合物、水和大气，所以也就自然地存在于动植物和人体内。其物理化学性质与普通元素相同，所以可用作示踪剂来标记化合物用于科学研究、临床医学和药物生产等几乎所有自然领域。由于没有辐射污染，稳定同位素示踪剂可以用于任何对象，包括孕妇、婴儿和疾病患者，无论是口服还是注射，都绝对安全。稳定同位素质谱实验室如图2-26所示。 

稳定同位素技术的另一特点是其测试定量的高精度和超高精度，达到ppm级（即百万分之一精度，1×10-6），而且同时也测定了化合物的浓度，事半功倍，且降低了测试误差。现在，利用同位素技术人们可以同时测定多个不同的样品，从而提高测定效率。这些高效率、高精度的特点是放射性同位素等技术所不可比拟的。 

稳定同位素技术的第三个特点是其示踪能力的微观性和灵活多变性。微观性是指它可以用来标记、追踪化合物分子内部某个或多个特定原子，比如葡萄糖分子中各个原子在人体内的不同代谢途径， 哪些原子进入三羧酸循环产生能量，而哪些原子进入脂肪代谢途径参与脂肪合成等。多变性是指通过对同位素标记位点的合理选择和巧妙设计来追踪、定性定量测定化合物的不同代谢途径或者生成过程。 

由于以上特性，自20世纪中叶特别是70年代以来稳定同位素技术在科技领先的国家被广泛应用于医学、营养、代谢、食品、农业、生态和地质等研究和生产领域。近年来在药物研发生产以及新兴的基因工程、蛋白质组学 （proteomics）、代谢组学 （metabolomics） 和代谢工程 （metabolic engineering） 等前沿领域，稳定同位素技术已成为一种应用广泛、独特高效甚至必需的技术，显著提高了解决科学问题的能力和生产效率。最近的例子是德国科学家用碳-13氨基酸通过三代喂养成功地标记了动物全身所有的蛋白质而获得了细胞代谢的重要发现。这一崭新的技术堪比当年的聚合酶连锁反应技术 （PCR），必将迅速得到广泛的推广和应用，有力地推动生命科学的发展。稳定同位素在自然界的无处不在意味着该技术应用的普遍性，具有大自然显微镜的独特功能，未来将揭开越来越多的大自然和人体的奥秘。

现今世界越来越多的消费者倾心于天然食品、饮料、药片、香料、香精和其他天然物质。 可是随着合成技术的发展，市场上不断出现以廉价人工合成品冒充天然制品的现象，有时这 种冒牌品与天然品中关键成分的化学结构基本相同，所以用化学分析法难以鉴别。

然而，在天然食品原料的生长过程中，某些同位素会发生分馏作用，使其同位素比值与人工合成品中的相应比值有较大差别。根据这一原理，Bircout提出了利用SIRA（稳定同位素比值分析）技术检验天然物质中掺假物质的设想，并首先用于检查天然果汁，成功地检出用水冲稀的制品。多功能同位素/发光测定仪如图2-27所示。

正当这项技术在食品检验中取得可喜成就之时，伪造商又设法用少量特征的稳定同位素 标记体掺到人工合成品中，调整该同位素的总含量，企图以假乱真。可是进一步研究发现，在伪造品中加入同位素标记物虽然可以模仿该同位素的总含量，但分子中某一些特征基团的同位素比值将出现更大的差别。因而检查起来更为灵敏。1983年Dana等利用这一原理在检验伪造香料、香精方面取得了令人满意的结果。

植物中碳水化合物的碳来源于CO2。CO2有12C16O2（98.426%）、13C 16O2（1.095%）， 12C16O18O（0.195%）及12C16O17O（0.079%）等四种同位素。大气（尤其是乡村大气）中的CO2，其12C/13C值基本上是恒定不变的。在ISRA中12C/13C值是用相对于国际标准的PDB（pee dee belemnite）值的δ13C来表示。PD是美国南卡罗来纳州PDB岩层中骨骼化石的碳酸盐加酸释放出来的CO2。

陆地植物12C/13C分析结果表明，碳同位素分馏作用与CO2光同化途经有关，C3 途径中δ13C为-0.7 %PDB的大气CO2，因为1，5 -二磷酸核酮糖羧化酶的分馏作用可达1.7%，所以C3植物有机物质中δ13C的为-2.4%～-3.0 %PDB。而C 4植物中有机物质中的δ13C只有-0.9%～-2.1%PDB。

例如：食用香精是食品工业的重要添加剂，其中天然香荚兰香精尤为珍贵，每年工业产值可达数百万美元。天然香荚兰香精的主要成分是香兰素，而香兰素可以用廉价的木质素或愈创木酚（来自石油，也有部分来自木焦油）制备。

香兰素分子中共有8个碳原子，对从香荚兰豆中提取的天然香兰素而言，除了塔希提出产的以外，不论是总碳的δ13C还是甲基碳的δ13C值都很稳定，从总碳的δ13C值可知香荚兰豆的δ13C比木质素（C3植物）合成的香兰素高，见表2-4；各地天然香兰素的δ13C分析结果平均值见表2-5。

注：表中的“香草豆”即香荚兰豆，“香草醛”即香兰素，下同。

因此利用各δ13C值可以容易地检查出以木质素合成的香兰素代替天然香兰素的冒牌货。

有人利用二烃基苯醛与13C-碘甲烷的甲基化反应，得到（13C-甲基）香兰素，以一定的比例掺到木质素香兰素中去，使混合物的总碳δ13C值与天然香兰素的总碳δ13C值相仿。但从表2-4可以清楚地看到，伪制品的δ13C主要集中在甲基上，所以只要改用甲基碳的δ13C值作检验指标，就能更加灵敏地检出这种伪制品来，δ13C的差值达5.08%PDB。甲基碳分析样品的制备也很容易，只要将香兰素与浓的氢碘酸作用，甲基就作为碘甲烷而脱去。利用Sofer （1980） 燃烧法（将碘甲烷与CuO一起密封在燃烧管中，加热到50℃过夜），使碘甲烷转化为CO2，净化后，进入质谱计测定。Dana等人（1983）认为，即使把10%的这种伪制品加到天然香兰素中，也能很容易地检查出来。这一方法也可检出碳环式醛基位置上标记有δ13C的合成香兰素。对于这种伪制品，甲基碳的δ13C仍是木质素的特征值（-2.8%～-3.0%PDB）。

天然度的概念是测试中14C的比活度（单位为DPM/gC，每克碳每分钟的衰变，下同）与标准值（15.5DPM/gC）的比值，天然度是区别乙醇法乙酸与合成法乙酸（原料来源于煤、石油等）的有效方法，前者天然度在96%～120%，后者近乎为零。主要是因为12C、13C、14C为同位素，但14C活泼，具有放射性。14C的半衰期为5300年左右，乙醇法乙酸中的14C来源于自然界，和5000年相比，可以忽略不计，可以认为乙醇法乙酸中的14C没有发生衰变，而直接或间接以石油等为原料制成的乙酸中的14C来源于很深的地下，经历了几百万年，其中的14C早已衰变掉。利用富集碳装置，采取14C低水平测试，所测试结果精确度较高，可以比较准确地做出乙醇法乙酸与合成法乙酸的天然度。以不同粮食为原料生成乙酸的天然度不同，例如北方比南方天然度大，主要是因为不同植物或同一植物在不同环境吸附14C的两不同，但相差不会很大。 

六、气相色谱分析

（一）色谱法

色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。

色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。 

由以上方法可知，在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。

色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。

使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。

由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。

色谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。

从两相的状态分类：色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体，由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、液-液色谱。

另外，还有一种超临界流体色谱法（supercritical fluid chromatography，SFC），超临界流体色谱是指用超临界流体做流动相，以固体吸附剂（如硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物为固定相的色谱法。超临界流体是在高于临界压力和临界温度时的一种物质状态，它既不是气体也不是液体，但兼有气体和液体的某些性质。

（二）气相色谱

气相色谱可分为气固色谱和气液色谱。气固色谱指流动相是气体，固定相是固体物质的色谱分离方法。例如活性炭、硅胶等作固定相。气液色谱指流动相是气体，固定相是液体的色谱分离方法。例如在惰性材料硅藻土涂上一层角鲨烷，可以分离、测定纯乙烯中的微量甲烷、乙炔、丙烯、丙烷等杂质。

20世纪60和70年代，由于气相色谱技术的发展，柱效大为提高，环境科学等学科的发展，提出了痕量分析的要求，又陆续出现了一些高灵敏度、高选择性的检测器。如1960年Lovelock提出电子俘获检测器（ECD）；1966年Brody等发明了FPD；1974年Kolb和Bischoff提出了电加热的NPD；1976年美国HNU公司推出了实用的窗式光电离检测器（PID）等。同时，由于电子技术的发展，原有的检测器在结构和电路上又作了重大的改进。如TCD出现了衡电流、横热丝温度及衡热丝温度检测电路；ECD出现衡频率变电流、衡电流脉冲调制检测电路等，从而使性能又有所提高。

20世纪80年代，由于弹性石英毛细管柱的快速广泛应用，对检测器提出了体积小、响应快、灵敏度高、选择性好的要求，特别是计算机和软件的发展，使TCD、FID、ECD和NPD的灵敏度和稳定性均有很大提高，TCD和ECD的体积也大大缩小。

进入20世纪90年代，由于电子技术、计算机和软件的飞速发展使MSD生产成本和复杂性下降，以及稳定性和耐用性增加，使其成为最通用的气相色谱检测器之一。其间出现了非放射性的脉冲放电电子俘获检测器（PDECD）、脉冲放电氦电离检测器（PDHID）和脉冲放电光电离检测器（PDECD）以及集次三者为一体的脉冲放电检测器（PDD）。其后，美国Varian公司推出了商品仪器，它比通常FPD灵敏度高100倍。另外，快速GC和全二维GC等快速分离技术的迅猛发展，促使快速GC检测方法逐渐成熟。

气相色谱法是指用气体作为流动相的色谱法。由于样品在气相中传递速度快，因此样品组分在流动相和固定相之间可以瞬间达到平衡。另外加上可选作固定相的物质很多，因此气相色谱法是一个分析速度快和分离效率高的分离分析方法。近年来采用了高灵敏选择性检测器，使得它又具有分析灵敏度高、应用范围广等优点。气相色谱采用气相色谱仪测定（图2-28）。

GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离，待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体（即载气，也叫流动相）带入色谱柱，柱内含有液体或固体固定相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气是流动的，这种平衡实际上很难建立起来。也正是由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附/解吸附，结果是在载气中浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出。当组分流出色谱柱后，立即进入检测器。检测器能够将样品组分转变为电信号，而电信号的大小与被测组分的量或浓度成正比。当将这些信号放大并记录下来时，就是气相色谱图了。

在石油化学工业中大部分的原料和产品都可采用气相色谱法来分析；在电力部门中可用来检查变压器的潜伏性故障；在环境保护工作中可用来监测城市大气和水的质量；在农业上可用来监测农作物中残留的农药；在商业部门可用来检验及鉴定食品质量的好坏；在医学上可用来研究人体新陈代谢、生理机能；在临床上用于鉴别药物中毒或疾病类型；在宇宙舱中可用来自动监测飞船密封舱内的气体等等。

气相色谱原理：气相色谱的流动相为惰性气体，气-固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附力不同，经过一定时间后，各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。吸附力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器，而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来，因此最后离开色谱柱。如此，各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。

气相色谱仪由以下五大系统组成：气路系统、进样系统、分离系统、温控系统、检测记录系统。组分能否分开，关键在于色谱柱；分离后组分能否鉴定出来则在于检测器，所以分离系统和检测系统是仪器的核心。

利用色谱柱先将混合物分离，然后利用检测器依次检测已分离出来的组分。色谱柱的直径为数毫米，其中填充有固体吸附剂或液体溶剂，所填充的吸附剂或溶剂称为固定相。与固定相相对应的还有一个流动相。流动相是一种与样品和固定相都不发生反应的气体，一般为氮或氢气。待分析的样品在色谱柱顶端注入流动相，流动相带着样品进入色谱柱，故流动相又称为载气。载气在分析过程中是连续地以一定流速流过色谱柱的，而样品则只是一次一次地注入，每注入一次得到一次分析结果。样品在色谱柱中得以分离是基于热力学性质的差异。固定相与样品中的各组分具有不同的亲和力（对气固色谱仪是吸附力不同，对气液分配色谱仪是溶解度不同）。当载气带着样品连续地通过色谱柱时，亲和力大的组分在色谱柱中移动速度慢，因为亲和力大意味着固定相拉住它的力量大，亲和力小的则移动快。

检测器对每个组分所给出的信号，在记录仪上表现为一个个的峰，称为色谱峰。色谱峰上的极大值是定性分析的依据，而色谱峰所包罗的面积则取决于对应组分的含量，故峰面积是定量分析的依据。一个混合物样品注入后，由记录仪记录得到的曲线，称为色谱图。分析色谱图就可以得到定性分析和定量分析结果。

（三）气相色谱检测器

气相色谱仪几种常用检测器：氢火焰离子化检测器（FID）、热导检测器（TCD）、氮磷检测器 （NPD）、火焰光度检测器（FPD）和电子捕获检测器（ECD）等。

氢火焰离子化检测器（FID）：氢火焰离子化检测器是根据气体的导电率与该气体中所含带电离子的浓度呈正比这一事实而设计的。一般情况下，组分蒸气不导电，但在能源作用下，组分蒸气可被电离生成带电离子而导电。

工作原理：由色谱柱流出的载气（样品）流经温度高达2100℃的氢火焰时，待测有机物组分在火焰中发生离子化作用，使两个电极之间出现一定量的正、负离子，在电场的作用下，正、负离子各被相应电极所收集。当载气中不含待测物时，火焰中离子很少，即基流很小，约10-14A。当待测有机物通过检测器时，火焰中电离的离子增多，电流增大（但很微弱10-12～10-8A）。需经高电阻108～1011Ω后得到较大的电压信号，再由放大器放大，才能在记录仪上显示出足够大的色谱峰。该电流的大小，在一定范围内与单位时间内进入检测器的待测组分的质量成正比，所以火焰离子化检测器是质量型检测器。

火焰离子化检测器对电离势低于H2的有机物产生响应，而对无机物、久性气体和水基本上无响应，所以火焰离子化检测器只能分析有机物（含碳化合物），不适于分析惰性气体、空气、水、CO、CO2、CS2、NO、SO2及H2S等。

热导检测器（TCD）：热导检测器（TCD）又称热导池或热丝检热器，是气相色谱法最常用的一种检测器。它是基于不同组分与载气有不同的热导率的原理而工作的热传导检测器。

工作原理：热导检测器的工作原理是基于不同气体具有不同的热导率。热丝具有电阻随温度变化的特性。当有一恒定直流电通过热导池时，热丝被加热。由于载气的热传导作用使热丝的一部分热量被载气带走，一部分传给池体。当热丝产生的热量与散失热量达到平衡时，热丝温度就稳定在一定数值。此时，热丝阻值也稳定在一定数值。由于参比池和测量池通入的都是纯载气，同一种载气有相同的热导率，因此两臂的电阻值相同，电桥平衡，无信号输出，记录系统记录的是一条直线。当有试样进入检测器时，纯载气流经参比池，载气携带着组分气流经过测量池，由于载气和待测量组分二元混合气体的热导率和纯载气的热导率不同，测量池中散热情况因而发生变化，使参比池和测量池孔中热丝电阻值之间产生了差异，电桥失去平衡，检测器有电压信号输出，记录仪画出相应组分的色谱峰。载气中待测组分的浓度越大，测量池中气体热导率改变就越显著，温度和电阻值改变也越显著，电压信号就越强。此时输出的电压信号与样品的浓度成正比，这正是热导检测器的定量基础。

热导池（TCD）检测器是一种通用的非破坏性浓度型检测器，一直是实际工作中应用最多的气相色谱检测器之一。TCD特别适用于气体混合物的分析，对于那些氢火焰离子化检测器不能直接检测的无机气体的分析，更是显示出独到之处。TCD在检测过程中不破坏被监测组分，有利于样品的收集，或与其他仪器联用。TCD能满足工业分析中峰高定量的要求，很适于工厂的控制分析。

氮磷检测器（NPD）：氮磷检测器（NPD）是一种质量检测器，适用于分析氮、磷化合物的高灵敏度、高选择性检测器。它具有与FID相似的结构，只是将一种涂有碱金属盐如Na2SiO3、Rb2SiO3类化合物的陶瓷珠，放置在燃烧的氢火焰和收集极之间，当试样蒸气和氢气流通过碱金属盐表面时，含氮、磷的化合物便会从被还原的碱金属蒸气上获得电子，失去电子的碱金属形成盐再沉积到陶瓷珠的表面上。

工作原理：在NPD检测器的喷口上方，有一个被大电流加热的碱金属盐（铷珠），受热后逸出少量离子，铷珠上加有-250V极化电压，与圆筒形收集极形成直流电场，逸出的少量离子在直流电场作用下定向移动，形成微小电流被收集极收集，即为基流。当含氮或磷的有机化合物从色谱柱流出，在铷珠的周围产生热离子化反应，使碱金属盐（铷珠）的电离度大大提高，产生的离子在直流电场作用下定向移动，形成的微小电流被收集极收集，再经微电流放大器将信号放大，再由积分仪处理，实现定性定量的分析。

氮磷检测器的使用寿命长、灵敏度极高，可以检测到5×10-13g/s偶氮苯类含氮化合物，2.5×10-13g/s的含磷化合物，如马拉松农药。它对氮、磷化合物有较高的响应。而对其他化合物有的响应值低10000～100000倍。氮磷检测器被广泛应用于农药、石油、食品、药物、香料及临床医学等多个领域。

火焰光度检测器（FPD）：火焰光度检测器是在一定外界条件下（即在富氢条件下燃烧）促使一些物质产生化学发光，通过波长选择、光信号接收，经放大把物质及其含量和特征的信号联系起来的一个装置。主要由燃烧室、单色器、光电倍增管、石英片（保护滤光片）及电源和放大器等组成。

工作原理：当含S、P化合物进入氢焰离子室时，在富氢焰中燃烧，有机含硫化合物首先氧化成SO2，被氢还原成S原子后生成激发态的分子，当其回到基态时，发射出350～430nm的特征分子光谱，最大吸收波长为394nm。通过相应的滤光片，由光电倍增管接收，经放大后由记录仪记录其色谱峰。此检测器对含S化合物不成线性关系而呈对数关系（与含S化合物浓度的平方根成正比）。

当含磷化合物氧化成磷的氧化物，被富氢焰中的H还原成HPO裂片，此裂片被激发后发射出480～600nm的特征分子光谱，最大吸收波长为526nm。发射光的强度（响应信号）正比于HPO浓度。

电子捕获检测器（ECD）：早期电子捕获检测器由两个平行电极制成。现多用放射性同轴电极。在检测器池体内，装有一个不锈钢棒作为正极，一个圆筒状放射源（3H、63Ni）作负极，两极间施加交流电或脉冲电压。

工作原理：当纯载气（通常用高纯N2）进入检测室时，受射线照射，电离产生正离子（）和电子e-，生成的正离子和电子在电场作用下分别向两极运动，形成约10-8A的电流——基流。加入样品后，若样品中含有某中电负性强的元素即易于电子结合的分子时，就会捕获这些低能电子，产生带负电荷阴离子（电子捕获）。这些阴离子和载气电离生成的正离子结合生成中性化合物，被载气带出检测室外，从而使基流降低，产生负信号，形成倒峰。倒峰大小（高低）与组分浓度呈正比，因此，电子捕获检测器是浓度型的检测器。其最小检测浓度可达10～14g/mL，线性范围为103左右。

电子捕获检测器是一种高选择性检测器。高选择性是指只对含有电负性强的元素的物质，如含有卤素、S、P、N等的化合物等有响应。物质电负性越强，检测灵敏度越高。

气相色谱-嗅觉测量（GC-O）法是一种有效分析食品风味化合物的检测技术，能够从大量的挥发性成分中挑选出气味活性成分，并衡量其对整体气味的贡献。目前，GC-O和GC-O-MS技术仅应用于香气研究，国内的相关报道较少。Delahunty等认为GC-O法作为气味活性化合物检测方法，可用于确定样品中挥发性化合物的气味活性。GC-O法对鉴定特征香味化合物、香味活性化合物及确定香味强度都非常有用。但GC-O法也存在一些缺点，如难以确定色谱峰对应的气味。在色谱图中，某几个峰有可能在一个特定气味的保留时间附近，从而难以确定气味所对应的相应色谱峰。通常采用GC-O-MS法研究香气，该法可在同一时间得到香气和MS信息，使得识别气味大为简化。

除了确定色谱峰的气味，GC-O-MS还可进行化合物的鉴别。Van Opstaele等将顶空固相微萃取与GC-O-MS法相结合，研究了单品种含氧倍半萜类酒花油馏分以确定气味活性成分。目前，GC-O-MS技术已应用于食品、酒类和香精香料等领域。

（四）全二维气相色谱

全二维气相色谱（comprehensive two-dimensional gas chromatography，GC×GC ）是20世纪90年代新发展起来的一种分析方法。与常规的二维色谱不同，该方法是将两种不同性质的色谱柱串联起来，中间用调制器连接，两支色谱柱采用不同的分离机理，使样品中所有组分在二维平面达到正交分离。全二维气相色谱具有高分辨率、高灵敏度等特点，是目前最为强大的分离工具之一，广泛应用于石油、烟草、制药等复杂体系的分离分析。

中药作为天然产物，组成十分复杂，组分间含量差异很大，并且在复方中药制剂中，数种中药材配伍使用，使其化学成分相当复杂。武建芳等在报道中提到了阮春海等曾采用GC×GC/TOFMS方法对中药挥发油进行的方法学研究是基于全二维气相色谱实现的族分离，建立了用药效群代替药效组分的中药评价方法。

武建芳等建立了分析中药莪术挥发油组成的GC×GC/TOFMS方法，实现了莪术挥发油的单个组分与族组分分析，鉴定出匹配度大于800的组分有249种，其中单萜18种，单萜含氧衍生物34种，倍半萜35种，倍半萜含氧衍生物37种，有69种组分的体积分数>0.02%。

武建芳课题组又对连翘挥发油的组成分析建立了GC×GC/TOFMS方法。连翘挥发油组成复杂，且大部分组分为痕量组分，通过优化色谱条件，使得组分的分离得到大大改善，同时鉴定出更多痕量组分，鉴定的匹配度大于800的组分有220种，而以往文献报道的均在百种之内。

邱涯琼等分别使用GC×GC/TOFMS和GC×GC/FID （氢焰检测器），对来自5个不同产地的15个羌活挥发油样品进行定性和定量分析，其中3号挥发油样品 （四川产道地羌活）定性出相似度大于800的组分共769个。结合程序升温，各挥发油样品均可以得到包含组分结构信息的二维谱图，根据单萜、单萜含氧衍生物、倍半萜、倍半萜含氧衍生物四类物质实现了明显的族分离。各产地羌活挥发油样品的定性定量结果显示，四川产道地羌活挥发油的化学成分与其他4个产地的药材相比有很大差异，其中以单萜类和倍半萜含氧衍生物类成分的含量差异最为显著。对15个样品的GC×GC/FID分析数据进行主成分分析，获得了满意的聚类结果，并且找到20个对聚类分析影响最为显著的化合物，即导致不同产地羌活挥发油的化学成分差异的标记物，均属于单萜类或倍半萜含氧衍生物类化合物，与定性定量分析结果相一致。

Dimandja等用GC×GC/FID对薄荷油和荷兰薄荷油进行分析，并与GC/MS方法进行比较，发现薄荷醇、薄荷酮为薄荷油的主要成分，而香芹酮、薄荷醇和柠檬烯则为荷兰薄荷油的主要成分，并且证实了全二维气相色谱用于挥发油分析的优越性。

七、气红联用检测

近年来以气相色谱为基础的联用技术是气相色谱发展的重要领域，而多维色谱是解决复杂混合物检测的有效手段。气相色谱和各种选择性检测器的联用受到了人们的关注，进而得到了较快的发展和普遍的应用。

气相色谱是物质分离和定量分析的有效手段，但在定性方面始终存在困难，仅靠保留指数定性未知物或未知组分是非常不可靠的。红外光谱法能提供丰富的分子结构信息，是非常理想的定性鉴定工具。然而红外光谱法原则上只适用于纯化合物，对于混合物的定性分析常常无能为力。将这两种技术取其所长，即将气相色谱的高效分离及定量检测能力与红外光谱独特的结构鉴定能力结合在一起，就是气相色谱-红外光谱（GC-FFIR）联用技术的设计思路。

20世纪60年代就有人尝试气相色谱与红外光谱的在线联用，但当时的色散型红外光谱仪因扫描速度慢、灵敏度低等不足，难以做到同步跟踪扫描，也难以胜任微量组分的检测。干涉型傅里叶变换红外光谱仪的出现为GC-FTIR联用创造了条件。1967年Low和Freeman首次演示了气相色谱-傅里叶变换红外光谱联用实验。与色散型红外光谱仪相比，干涉型傅里叶变换红外光谱仪光通量大，检测灵敏度高，能够检测微量组分，而且由于多路传输，可同时获取全频域光谱信息，其扫描速度快，可同步跟踪扫描气相色谱馏分。70年代，窄带汞镉碲（MCT）检测器代替了热释电（TGS）检测器，内壁镀金硼硅玻璃光管代替了早期的不锈钢光管，这两项关键技术使气相色谱-红外光谱联用技术进入了实用阶段。这些突破性的发展，使GC-FFIR联用仪器的检测限降低了大约3个数量级，进入商品化生产阶段。

GC-FIR联用系统主要由气相色谱、接口、红外光谱、计算机数据系统四个单元组成。其工作原理是：一方面，红外光线被干涉仪调制后会聚到加热的光管气体池入口，经过光管镀金内表面的多次反射到达探测器；另一方面，样品经过色谱柱的分离，色谱馏分将按照保留时间顺序通过光管，在光管中选择性吸收红外辐射，计算机系统采集并储存来自探测器的干涉图信息，并作快速傅里叶变换，最后得到样品的气相红外光谱图。

在色谱红外联用系统中， 从色谱柱中洗脱出来的组分被自动地输送到样品池，让实验人员摆脱了以往从色谱馏分中收集样品的麻烦，也保证了样品在不受破坏的条件下进行红外光谱分析，这是“脱机”检测无法比拟的。

试样经气相色谱分离后各馏分按保留时间顺序进入接口，接口是联用系统的关键部分。目前已有光管接口和冷冻捕集接口两种类型；后者可以使联机系统具有更高的信噪比，但由于其价格昂贵，至今普遍使用的仍是相对廉价的光管接口。目前普遍采用的是Azarrag光管，其为内表面镀金的硼硅毛细管。红外光线经镀金内壁的多次反射，有效地增加了光管的长度。根据Beer定律，光程增加，吸收值相应增加，提高了检测灵敏度，而且金的化学惰性可以防止样品在高温下分解。因为光管型GC-FIR操作简便，价格相对低廉，所以至今普遍使用的仍是光管接口。

光管接口一般包括传输线（transfer line）、光管（light pipe）、加热装置及汞镉碲（MCT）检测器。接口的出口端可直接放空或进一步连接到气相色谱仪的氢火焰检测器或热导检测器等，可同时得到各种气相色谱图。近些年很多学者在光管方面作了很多研究，例如有一种低温光管的应用技术，可以克服在高温状态下热不稳定化合物的降解。

重建色谱图是将检测器记录的干涉图经过计算机处理后的结果。主要有官能团色谱图、总吸收度重建色谱图、Gram-Schmidt重建色谱图。

官能团色谱图是在GC-FTIR联机过程中通过实时处理技术而获得。操作者可以预先设定5个“窗口”波数范围，测定过程中当某一窗口出现光谱图时，就表示样品可能含有与此吸收范围相关的官能团，通过对光谱进行积分处理，将其转换成相应的色谱图，红外光谱仪就成了气相色谱的选择性检测器。

总吸收度重建色谱图，由于色谱图上各色谱峰的响应强度是相应化合物的红外总吸收强度，能比较全面地反映色谱流出情况。但因其不是实时记录，且信噪比较低，这在很大程度上影响了它的应用。

Gram-Schmidt重建色谱图是在第一个样品馏分淋洗出来之前，从采集的扫描数据中选出仅含载气背景的干涉图，通过Gram-Schmidt矢量正交化确定一个代表载气背景干涉数据的基集，然后从后来的于涉数据中除去背景信息，并计算出背景与馏分之间的差。此时，红外光谱仪相当于气相色谱的检测器。红外光谱检测的是光谱的总吸收强度，而这个Gram-Schmidt重建色谱图是在联机运行后计算出来的，其突出优点是信噪比高。虽然其横坐标是时间，但它却不是实时的，同时，由于不同种类的化合物的红外总吸收度不同，峰面积不能反映化合物的含量。因此，这种图一般只作为色谱馏分示意图，为关联红外光谱图与气相色谱网提供帮助。

红外光谱图表征着化合物分子中各基团的吸收频率及其强度。利用红外光谱图可以鉴定其化学结构。

色谱保留值可以作为红外光谱定性的重要辅助依据。特别是当鉴定像同系物等分子结构内有不同数目的重复单元的化合物时，尤为重要。因为这类化合物的红外光谱特征十分相似，而它们的色谱保留值却存在着显著差异。

目前，商用GC-FTIR仪器一般都带有谱图检索软件，可以对GC馏分进行定性检索。将得到的GC馏分气态红外光谱图与计算机中储存的气态红外标准谱图进行比较，以实现未知组分的确认。但目前由于化合物的气态红外标准谱图数目有限，其应用受到限制。

GC-FTIR广泛应用于各种香料的分析、石油化工分析、环境污染分析（包括毒物检测、废水分析、空气污染物分析、农药分析）等。另外，燃料分析（煤与石油分馏产物的分析）也广泛使用了GC-FTIR联用技术。

随着仪器与计算机的发展，计算机差谱技术得到应用，通过光谱差减，可以把混峰光谱进行剥离，从而有可能对混峰进行完全鉴定，甚至也有可能对GC本身没有分开的峰进行剥离鉴定。GC-FTIR联用技术得到了空前的发展，应用领域越来越广泛，发挥着重要作用，尤其在异构体的分离与鉴定方面有其他分析方法无可比拟的优越性。GC-FTIR在药物分析中已得到广泛应用，并具有美好前景。

然而在痕量组分定性方面，GC-FTIR还受到两方面的限制：一是普遍应用的光管GC-FTIR检测灵敏度较低；二是可供检索的标准气相红外图谱数量少，不能像GC-MS那样方便检索，有些组分不能定性。应用双冷阱进样技术，预前柱进样技术，顶空进样技术等可不同程度提高系统的灵敏度。

随着各类标准谱库的增加与完善，会使GC-FTIR的检索范围逐渐扩大。

GC-FTIR联用技术在化合物定性方面是GC-MS的重要辅助手段，GC-MS在化合物定性中被广泛使用，主要的优点有：灵敏度高，具有强大的标准谱图数据库方便检索。

但是，仅仅依靠GC-MS得到的结果对化合物进行定性并不十分充分，其缺点有：不能够区分异构体，有时候计算机给出的几个化合物具有相似的检索相似度，难以判断结果。而红外光谱在化合物定性方面的优点有：能够提供化合物完整的结构信息，能够区分异构体，每种化合物都具有唯一的红外光谱图。这些特性使得GC-FTIR成为GC-MS的重要补充，二者的结合使化合物定性更加准确。而且红外检测器是非破坏性的，组分在经过红外检测后可以继续进行质谱检测，实现GC-FTIR-MS联用，进一步提高检测结果的可靠性。

八、气质联用检测

气相色谱法是一种以气体作为流动相的柱色谱分离分析方法，它可分为气-液色谱和气-固色谱。作为一种分离和分析有机化合物有效方法，气相色谱法特别适合进行定量分析，但由于其主要采用对比未知组分的保留时间与相同条件下标准物质的保留时间的方法来定性，使得当处理复杂的样品时，气相色谱法很难给出准确可靠的鉴定结果。

气-质联用（GC-MS）法是将GC和MS通过接口连接起来，GC将复杂混合物分离成单组分后进入MS进行分析检测。

迄今为止，人们所认识的化合物已超过1000万种，而且新的化合物仍在快速地增长，体系的分离和检测已成为分析化学的艰巨任务。

气相色谱具有极强的分离能力，但它对未知化合物的定性能力较差。质谱对未知化合物具有独特的鉴定能力，且灵敏度极高，但它要求被检测组分一般是纯化合物。将GC与MS联用，彼此扬长避短，既弥补了GC只凭保留时间难以对复杂化合物中未知组分做出可靠的定性鉴定的缺点，又利用了鉴别能力很强且灵敏度极高的MS作为检测器。凭借其高分辨能力、高灵敏度和分析过程简便快速的特点，GC-MS在环保、医药、农药和兴奋剂等领域起着越来越重要的作用，是分离和检测复杂化合物的最有力工具之一。

GC-MS联用技术的原理：将样品分子置于高真空（<10-3Pa）的离子源中，使其受到高速电子流或强电场等作用，失去外层电子而生成分子离子；或使化学键断裂生成各种碎片离子，经加速电场的作用形成离子束，进入质量分析器，再利用电场和磁场使其发生色散、聚焦，获得质谱图。根据质谱图提供的信息可进行有机物、无机物的定性、定量分析，复杂化合物的结构分析，同位素比的测定及固体表面的结构和组成等分析。

GC-MS系统的组成：气质联用仪（图2-29）是分析仪器中较早实现联用技术的仪器。自1957年J.C.Holmes和F.A.Morrell首次实现气相色谱和质谱的联用以后，这一技术得到了长足的发展。在所有的联用技术中，GC-MS联用技术发展最为完善，应用最广泛。GC-MS联用系统各部分组成见图2-30。

气相色谱仪分离样品中各组分，起着样品制备的作用；接口把气相色谱流出的各组分送入质谱仪进行检测，起着气相色谱和质谱之间适配器的作用；质谱仪对接口依次引入的各组分进行分析，成为气相色谱仪的检测器；计算机系统控制气相色谱、接口和质谱仪，进行数据采集和处理，是GC-MS的中央控制单元。

混合物被一股气流（流动相，又称气相）携带，通过一根长长的内壁涂有薄薄的一层液膜（液态固定相）的毛细柱。因为混合物的不同组分与固定相的结合能力不同，因此在柱的末端，混合物中的各个组分会逐个地出来（洗脱）而达到分离的目的。

在一个简单的气相色谱装置中，这些被逐个洗脱出来的组分被某种火焰燃烧以便于检测（通用火焰离子化检测器，FID），或者穿过某种其他的检测器后放入大气。在气相色谱中，这些组分在色谱图中是以峰的形式来记录。有关组分的信息通过测量色谱图中该组分峰的峰高和峰面积来确定。这些对应着检测到的组分量以及该组分通过毛细柱的时间。色谱图上某个组分峰最高点对应的时间（以进样作为时间起点）被称为保留时间。通常利用该组分的特定保留时间对其定性，但这种定性方式并不绝对准确，组分的确定经常会模糊或根本无法识别该组分。

与气相色谱形成鲜明对比的是，质谱检测器对混合物的检测毫无办法。如果一个单独的组分进入质谱检测器，它的质谱图可以通过各种离子化检测方法而获得。确定了该物质的质谱图通常来说就可以准确鉴别该物质为何物，并可以确定它的分子结构。显然，如果是混合物质进入质谱检测器，所获得的质谱图就会是该混合物中所有组分谱图的总和。

物质的质谱图可能会相当的复杂以至于准确鉴别混合物中的多种组分几乎是不可能的。一方面气相色谱能够高效地分离混合物但并不善于鉴定各个组分；另一方面质谱检测器善于鉴别单一的组分却难以鉴别混合物。因此，不难理解早期人们为什么致力于研究如何将两种方法联合在一起使用，组成气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）。气相色谱-质谱联用仪能将一切可气化的混合物有效分离并准确定性、定量其组分。

（一）GC-MS联用仪器的分类

按照仪器的机械尺寸，可以粗略分为大型、中型、小型三类气质联用仪；按照仪器的性能，可以粗略分为高档、中档、低档三类或研究级和常规检测级两类气质联用仪。

按照色谱技术，可分为气相色谱-四极杆质谱、气相色谱-离子阱质谱、气相色谱-飞行时间质谱等。

按照质谱仪的分辨率，可分为高分辨率（通常分辨率高于5000）、中分辨率（通常分辨率为1000～5000）、低分辨率（通常分辨率低于1000）气质联用仪。小型台式四极杆质谱检测器（MSD）的分辨率范围一般低于1000。四极杆质谱由于其本身固有的限制，一般GC-MS分辨率在2000以下。和气相色谱联用的飞行时间质谱（TOFMS），其分辨率可达5000左右。

GC-MS联用技术的应用：GC-MS联用在分析检测和研究的许多领域中起着越来越重要的作用，特别是在许多有机化合物常规检测工作中成为一种必备的工具。如环保领域在检测许多有机污染物，尤其是一些低浓度的有机化合物时。如二吖恶英等的检测方法就规定用GC-MS；药物研究、生产、质控以及进出口的许多环节中都要用到GC-MS；法庭科学中对燃烧、爆炸现场的调查，对各种案件现场的各种残留物的检测，如纤维、呕吐物、血迹等的检验和鉴定，无一不用到GC-MS；工业生产的许多领域如香料香精、石油、食品、化工等行业都离不开GC-MS；甚至竞技体育运动中，用GC-MS进行兴奋剂的检测越来越起着重要的作用。

（二）GC-MS的一些应用

痕量污染物分析：随着人类社会的不断发展、科学的不断进步，人们对生存环境中的痕量污染物的分析研究越来越重视。此类样品基体复杂，所含的未知组分多，且多为痕量分析范围，GC-MS是目前环境分析中判定未知化合物及其结构最有效的方法。已广泛应用于大气、水、土壤、沉积物、生物样品和化工产品等介质中各种有机污染物的痕量检测、鉴定和证实。

法庭科学：GC-MS用于血、尿、体液或毛发中各种毒品（如大麻、海洛因、可卡因等）或血、尿中挥发性有机物（如甲醇、乙醇、氯仿等）的检测，为疑难案件的鉴定和审定，提供了有力的证据。另外，运动员尿样中兴奋剂的检测和案件中安眠镇定药物的检测和鉴定，GC-MS也是必备的手段。

天然物质和食品：各种天然物质（如中草药、植物挥发油、昆虫性信息素和各种花香）有效成分的研究，烟、酒和饮料中风味物质（如脂肪酸、醇和酯等）和有害物质（如甲醇、农药和苯并芘等）的检测，还有药物及其临床化学的检验及鉴定，GC-MS是十分有效的手段。

（三）GC-MS联用中的主要技术问题

仪器接口：众所周知，气相色谱的入口端压力高于大气压，在高于大气压力的状态下，样品混合物的气态分子在载气的带动下，因在流动相和固定相上的分配系数不同，产生的各组分在色谱柱内的流动速度不同而分离，最后和载气一起流出色谱柱。通常色谱柱的出口端压力为大气压力。质谱仪中样品气态分子在具有一定真空度的离子源中转化为样品气态离子。这些离子包括分子离子和其他各种碎片离子在高真空的条件下进入质量分析器运动。在质量扫描部件的作用下，检测器记录各种按质荷比不同分离的离子其离子流强度及其随时间的变化。因此，接口技术中要解决的问题是气相色谱仪的大气压的工作条件和质谱仪的真空工作条件的连接和匹配。接口要把气相色谱柱流出物中的载气尽可能的除去，保留或浓缩待测物，使近似大气压的气流转变成适合离子化装置的粗真空，并协调色谱仪和质谱仪的工作流量。

扫描速度：未与色谱仪连接的质谱仪一般对扫描速度要求不高。和气相色谱仪连接的质谱仪，由于气相色谱峰很窄，有的仅几秒钟时间。一个完整的色谱峰通常需要至少六个以上的数据点。这样，一方面要求质谱仪有较高的扫描速度，才能在很短的时间内完成多次全质量范围的质量扫描。另一方面，要求质谱仪能很快在不同的质量数之间来回转换，以满足选择离子检测的需要。

气质联机是目前香料、香精、加香产品检测中最有用也是最常用的仪器，几乎所有香料、香精和加香产品用其他方法检测后，如果觉得在“定性”和“定量”方面还有疑问的话，都会采用气质联机再一次核验一下，以打消疑虑。

例如某薰衣草油样品经过检测，各项理化指标如外观、香气、相对密度、沸点、折射率、旋光度、溶解性等都“合格”，但还是不敢确定它有没有“掺杂”，此时再用气质联机检测，看看有没有“薰衣草醇”、“乙酸薰衣草醇酯”和其他“应该有的成分”，有的话，含量是多少；还可以用“手性柱”检测，看看里面的“芳樟醇”和“乙酸芳樟酯”的左旋体和右旋体各占多少比例，从而确认该样品是否为“真品”。

全二维气相色谱（GC×GC）在复杂样品分析中非常有用，但是由于其第二维的分析速度极快，因此对检测器的采集速度提出了更高的要求。目前，主要采用GC×GC与四极杆质谱联用或GC×GC与飞行时间质谱联用（GC×GC-TOFMS）。GC×GC-TOFMS可以获得海量数据，当分析大量样品时，其数据处理较困难。Weldegergisa等采用GC×GC-TOFMS法来表征Pinotage葡萄酒的挥发性成分。熊国玺等采用GC×GC-TOFMS法对烟用香精进行了定性分析，该法与GC-MS法相比具有更好的分离能力，检测出的组分明显多于一维气相色谱，有利于更全面地认识香精的化学成分，为香精原料剖析、香精开发提供更有力的支持。

九、固相微萃取分析

固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）技术是20世纪90年代兴起的一项新颖的样品前处理与富集技术，它最先由加拿大Waterloo大学Pawliszyn教授的研究小组于1989年首次进行开发研究，属于非溶剂型选择性萃取法。

SPME是在固相萃取技术上发展起来的一种微萃取分离技术，是一种集采样、萃取、浓缩和进样于一体的无溶剂样品微萃取新技术。与固相萃取技术相比，固相微萃取操作更简单，携带更方便，操作费用也更加低廉；另外克服了固相萃取回收率低、吸附剂孔道易堵塞的缺点。因此成为目前所采用的样品前处理技术中应用最为广泛的方法之一。

固相微萃取方法分为萃取过程和解吸过程两步：

（1）萃取过程——具有吸附涂层的萃取纤维暴露在样品中进行萃取。

（2）解吸过程——将已完成萃取过程的萃取器针头插入气相色谱进样装置的气化室内，使萃取纤维暴露在高温载气中，并使萃取物不断地被解吸下来，进入后序的气相色谱分析。

固相微萃取装置外形如一只微量进样器，如图2-31所示。由手柄（holder）和萃取头或纤维头（fiber）两部分构成，萃取头是一根1㎝长、涂有不同吸附剂的熔融纤维，接在不锈钢丝上，外套细不锈钢管（保护石英纤维不被折断），纤维头在钢管内可伸缩或进出，细不锈钢管可穿透橡胶或塑料垫片进行取样或进样。手柄用于安装或固定萃取头，可永远使用。

固相微萃取法分为直接萃取、顶空萃取和膜保护萃取。

（一）直接萃取

直接萃取方法中，涂有萃取固定相的石英纤维被直接插入到样品基质中，目标组分直接从样品基质中转移到萃取固定相中。在实验室操作过程中，常用搅拌方法来加速分析组分从样品基质中扩散到萃取固定相的边缘。对于气体样品而言，气体的自然对流已经足以加速分析组分在两相之间的平衡。但是对于水样品来说，组分在水中的扩散速度要比气体中低3～4个数量级，因此需要有效的混匀技术来实现样品中组分的快速扩散。比较常用的混匀技术有：加快样品流速、晃动萃取纤维头或样品容器、转子搅拌及超声。

这些混匀技术一方面加速组分在大体积样品基质中的扩散速度，另一方面减小了萃取固定相外壁形成的一层液膜保护鞘而导致的所谓“损耗区域”效应。

（二）顶空萃取

在顶空萃取模式中，萃取过程可以分为两个步骤：

①被分析组分从液相中先扩散穿透到气相中。

②被分析组分从气相转移到萃取固定相中。

这种改型可以避免萃取固定相受到某些样品基质（比如人体分泌物或尿液）中高分子物质和不挥发性物质的污染。在该萃取过程中，步骤②的萃取速度总体上远远大于步骤①的扩散速度，所以步骤①成为萃取的控制步骤。因此挥发性组分比半挥发性组分有着快得多的萃取速度。实际上对于挥发性组分而言，在相同的样品混匀条件下，顶空萃取的平衡时间远远小于直接萃取的平衡时间。

（三）膜保护萃取

膜保护SPME的主要目的是在分析很脏的样品时保护萃取固定相避免受到损伤，与顶空萃取SPME相比，该方法对难挥发性物质组分的萃取富集更为有利。另外，由特殊材料制成的保护膜对萃取过程提供了一定的选择性。

毛细管固相微萃取装置如图2-32所示，毛细管固相微萃取是色谱分析中的样品预处理和目标组分富集技术。毛细管固相微萃取器避免使用高温阀，而采用压力差和微通道控制气体流向，使仪器成本降低，而性能比用高温阀有所提高。可用于液体样品或气体样品中有机化合物的萃取或吸附富集。

十、顶空气相色谱法

顶空进样法是气相色谱特有的一种进样方法，适用于挥发性大的组分分析。测定时，精密称取标准溶液和供试品溶液各3～5mL分别置于容积为8mL的顶空取样瓶中。将各瓶在60℃的水浴中加热30～40min，使残留溶剂挥发达到饱和，再用同一水浴中的空试管中加热的注射器抽取顶空气适量（通常为1mL），进样。重复进样3次，按溶剂直接进样法进行计算与处理。

顶空进样法使待测物挥发后进样，可免去样品萃取、浓集等步骤，还可避免供试品种非挥发组分对柱色谱的污染，但要求待测物具有足够的挥发性。

顶空分析是通过样品基质上方的气体成分来测定这些组分在原样品中的含量。测定时使用顶空气相色谱仪，如图2-33所示。其基本理论依据是在一定条件下气相和凝聚相（液相和固相）之间存在着分配平衡。所以，气相的组成能反映凝聚相的组成。可以把顶空分析看作是一种气相萃取方法，即用气体做“溶剂”来萃取样品中的挥发性成分，因而，顶空分析就是一种理想的样品净化方法。传统的液液萃取以及SPE都是将样品溶在液体里，不可避免会有一些共萃取物的干扰分析。况且溶剂本身的纯度也是一个问题，这在痕量分析中尤为重要。而其做溶剂可避免不必要的干扰，因为高纯度气体很容易得到，且成本较低。这也是顶空气相被广泛采用的一个原因。

作为一种分析方法，顶空分析首先简单，它只取气体部分进行分析，大大减少了样品本身可能对分析的干扰或污染。作为GC分析的样品处理方法，其一，顶空是最为简便的。其二，是可以使气化后进样，顶空分析有不同模式，可以通过优化操作参数而适合于各种样品。其三，顶空分析的灵敏度能够满足相关要求。其四，顶空进样可相对减少用于溶解样品的沸点较高的溶剂的进样量，缩短分析时间，但对溶剂的纯度要求较高，尤其不能含有低沸点的杂质，否则会严重干扰测定。其五，与GC的定量分析能力相结合，顶空GC完全能够进行准确的定量分析。

根据取样和进样方式的不同，顶空分析有动态和静态之分。所谓静态顶空就是将样品密封在一个容器中，在一定温度下放置一段时间使气液两相达到平衡。然后取气相部分带入GC分析。所以静态顶空GC又称为平衡顶空GC，或叫做一次气相萃取。如果第二次再取样，结果就会不同于第一次取样的分析结果，因为第一次取样后样品组分已经发生了变化。与此不同的是连续气相萃取，即多次取样，直到样品中挥发性组分完全被萃取出来。这就是所谓的动态顶空GC。常用的方法是在样品中连续通入惰性气体，如氦气，挥发性成分即随该萃取气体从样品中逸出，然后通过一个吸附装置（捕集器）将样品浓缩，最后再将样品解析后进入GC进行分析。这种方法通常被称为吹扫-捕集分析方法。

顶空气相色谱法（HS-GC）又称液上气相色谱分析，是一种联合操作技术。通常采用进样针在一定条件和一定温度下对固体、液体、气体等进行萃取吸附，然后在气相色谱分析仪上进行脱附注射。萃取过程常在固相微萃取平台（图2-34）上进行。

顶空色谱进样器可与国内外各种气相色谱仪相连接，它是将液体或固体样品中的挥发性组分直接导入气相色谱仪进行分离和检测的理想进样装置。

它采用气体进样，可专一性的收集样品中的易挥发性成分，与液-液萃取和固相萃取相比，既可避免在除去溶剂时引起挥发物的损失，又可降低共提物引起的噪声，具有更高的灵敏度和分析速度，对分析人员和环境危害小且操作简便，是一种符合“绿色分析化学”要求的分析手段。

顶空分析方法随气相色谱分析方法的发展在不断更新和发展，现代顶空分析法已形成一个相对较为完善的分析体系。

顶空分析方法主要分为静态顶空分析、动态顶空分析、顶空-固相微萃取三类。

顶空技术的使用，可以免除冗长烦琐的样品前处理过程，避免有机溶剂带入的杂质对分析造成干扰，减少对色谱柱及进样口的污染。顶空色谱技术以其简单实用的优点在环境检测（如饮用水中挥发性卤代烃和工业污水中挥发性有机物）、药物中有机残留溶剂检测、食品、法庭科学、石油化工、包装材料、涂料及酿酒业分析等领域得到了广泛的应用。例如对香蕉、薄荷油、烤咖啡、白兰地酒、威士忌酒等的挥发性组分的顶空气相色谱分析，即使没有作精密的定性定量分析，从色谱图上也能了解其气味或味道的真实情况。另外，可与电子鼻、电子舌等感官仪器联用，对食品、化妆品、药品等的检测分析起到很好的辅助效果。

顶空气相色谱法也可用于测定固体高聚物和高聚物分散系。此技术检测残留单体比用常规的把高聚物溶解后再度沉淀的方法要灵敏得多。顶空气相色谱法也是测试高聚物化学稳定性的一种快速而又简便的方法。取容器中的气体进行气相色谱分析，则可了解在各种温度下容器材料的抗水蒸气、抗HCl气体等的性能。

目前顶空气相色谱法还用于“植物精气”的分析上。每一种植物都会散发一些挥发性物质出来，这就是所谓的“植物精气”，通过该植物上端“植物精气”的分析可以作为该植物进行“化学型”分类的依据，香料植物用这个方法来判定更有实际意义。例如我们可以从一棵樟树的“植物精气”分析判断该树是“芳樟”“桉樟”“脑樟”或者是其他化学型的樟树。

中南林学院森林旅游研究中心的吴楚材、吴章文教授带领课题组用顶空气相色谱法通过7年多的研究，测试了150种中国主要树种的叶片、103种木材、22种花、18个树种林分精气的化学成分，鉴定出440种植物精气的化学成分，并根据相关的技术资料对植物精气的保健功能作出了认定和评价。

十一、液相色谱分析

高效液相色谱法（HPLC）是继气相色谱之后，在20世纪70年代初期发展起来的一种以液体作流动相的新色谱技术。

高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。经典的液相色谱法中，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9×107Pa）。色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。

高效液相色谱仪（图2-35）主要由进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统等组成。

其中高压输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有计算机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。

高效液相色谱更适宜于分离和分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂、抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂等物质的分析。

高效液相色谱法只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、分子量大（大于400以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75%～80%），原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的占70%～80%。

高效液相色谱分析的主要优点是：

①分辨率高于其他色谱法；

②速度快，十几分钟到几十分钟可完成；

③重复性高；

④高效液相色谱柱可反复使用；

⑤自动化操作，分析精确度高。 

高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定：

①氨基酸及其衍生物；

②有机酸；

③甾体化合物；

④生物碱；

⑤抗生素；

⑥糖类；

⑦卟啉；

⑧核酸及其降解产物；

⑨蛋白质、酶和肽；

⑩脂类等。

这些物质都是各种香料、香精和加香产品分析时经常遇到的难挥发物质，所以检测有香物质时除了常用的气相色谱法以外，液相色谱通常作为补充方法，但也有一些实验室干脆不用气相色谱，而全部采用液相色谱检测，在有关数据足够时，也能得到令人满意的结果。同一个物质（混合物），用气相色谱在一定的条件下可以得到一张“指纹图”，用液相色谱在一定的条件下也可以得到一张不同的“指纹图”，它们都可以用来辨别这个物质。

高效液相色谱（HPLC）法适用于香精中的非挥发性成分的分析。通过HPLC法分离精油，避免了气相进样时分子重排和热分解现象的发生。

十二、液质联用检测

液相色谱-质谱联用仪（liquid chromatograph mass spectrometer），简称LC-MS，是液相色谱与质谱联用的仪器（图2-36）。它结合了液相色谱仪有效分离热不稳性及高沸点化合物的分离能力，还有质谱仪很强的组分鉴定能力。是一种分离、分析复杂有机混合物的有效手段。

联机的关键是适用接口的开发，必须在试样组分进入离子源前去除溶剂。目前，多采用履带式加热传送带。不足之处在于：

①沸点与溶剂相近或低的组分不能测；

②某种意义上失去了HPLC分离热不稳定性物质的优点；

③溶剂很难挥发尽，本底效应高，不利于分辨。

因此，LC-MS正处于发展阶段，应用还不够普遍。

液相色谱（LC）能够有效地将有机物待测样品中的有机物成分分离开，而质谱（MS）能够对分开的有机物逐个分析，得到有机物分子量、结构（在某些情况下）和浓度（定量分析）的信息。强大的电喷雾电离技术使LC-MS质谱图十分简洁，后期数据处理简单。LC-MS是有机物分析实验室、药物或食品检验室、生产过程控制或质检等部门必不可少的分析工具。

液相色谱和质谱连接，可以增加额外的分析能力，能够准确鉴定和定量，像细胞和组织裂解液、血液、血浆、尿液和口腔液等复杂样品基质中的微量化合物。高效液相色谱质谱系统（HPLC-MS）提供了一些独特的优势，包括以下三点。

①快速分析和流转所需的最少样品准备；

②高灵敏度并结合可分析多个化合物能力，甚至可以跨越化合物的种类；

③高精确度、高分辨率鉴定和量化目标分析物。

HPLC-MS仪器所用的质量分析器有四极杆（如ABI公司的API3000、2000，Agilent公司的 HP1100LC-MS，Finnigan公司的TSQ7000、LCQ DUO和 Micromass公司的 Quattro LC及Ⅱ等具有二组四极杆的能做MS/MS）、离子阱（如Finnigan公司的 LCQ DECAXP；BRUKER公司的esquire3000等能做多次串联MS分析）。四极与飞行共存：MS1采用四极分离器，MS2采用OA-Tof（如Micromass的 Q-Tof能做MS-MS）等。

HPLC系统可添置PDA（二极管阵列检测器），可做到在获得定量数据的同时，采集光谱信息，从而有助于一些特定的定性分析。

由于HPLC-MS仪采用的是软电离技术，只给出样品的准分子离子峰，且流动相的组成和接口温度又不可能做到完全一致，因此HPLC-MS（多级）目前无标准谱图库可供检索。

将液相的分析方法用于HPLC-MS（多级）联用时需要考虑以下几方面：

①分析目标化合物的离子化能力；

②流动相的混溶性；

③流速与柱子的匹配性等。

对于可以接受质子的碱性样品（如含NH2、N、NH、CO、COOR ），采用正离子化模式；反之对于易丢失质子的，有较多强负电性基团（如样品含—COOH、—SH、—NO2、—Cl、—Br、多个羟基）时可尝试使用负离子化模式。有些酸碱性并不明确的化合物则要进行预试方可确定。此时也可优先考虑用APCl（+）进行测定，对于热不稳定的化合物则优先考虑用ESI。

对样品的一般要求是：力求干净，不含显著量的杂质；不含高浓度的难挥发性酸（如硫酸、磷酸等）及其盐。因为这些酸及其盐的侵入会引起很强的噪声，严重时还会造成仪器喷口处放电。样品黏度不能过大，以防堵塞柱子、喷口及毛细管入口，因此样品的制备或前处理在HPLC-MS（多级）分析中同样是必要的。

HPLC-MS（多级）商品仪器设计时所达到的重现性和线性范围指标均能满足一般的定量分析精度要求。但由于其分析的样品来源广泛、本底复杂，因此HPLC-MS（多级）定量中要解决的主要问题是化学基质和生物学基质的干扰。

HPLC-MS（多级）应用范围：热不稳定大分子化合物的分析（如生物药品、重组产物、医药学方面的药物及体内药物分析、药物降解、药物动力学、临床医学、中药分析）；生物化学领域的肽、蛋白质、寡核苷酸、糖等；环境化学分析方面（如有机污染物，土壤与水质分析）；农药兽药残留量分析（如检测蔬菜、水果及肉类食品中的农残和药残）；法医学方面的滥用药物、爆炸物和兴奋剂检测；合成化学方面的有机金属化合物、有机合成物、表面活性剂、天然产物、复杂混合物分析等。总之，只有无法离子化的样品，质谱才不能检测。与GC-MS相比，LC-MS灵敏度更高。

质谱仪从其最基本的功能上而言，主要是一种定性分析的工具。采用LC与MS联机的操作方式，可充分发挥液相色谱的分离功能和质谱仪的高灵敏度及高选择性（如单离子检测、中性丢失等），来获取一些混合物中单一组分的结构信息。用混合编程扫描技术，进行多级质谱方式（MS-MS或MSn）可同时检测分子离子和若干碎片离子，进一步获取相关化合物的结构信息。

十三、薄层色谱法分析

薄层色谱，或称薄层层析（thin-layer chromatography），是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂作为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的，特别有效的层析方法。从20世纪50年代发展起来至今，仍被广泛采用。

薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力的不同，使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分互相分离的目的。

薄层层析可根据作为固定相支持物的不同，分为薄层吸附层析（吸附剂）、薄层分配层析（纤维素）、薄层离子交换层析（离子交换剂）、薄层凝胶层析（分子筛凝胶）等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。

吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。

物质分子之所以能在固体表面停留，是因为固体表面的分子（或离子、原子）和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时，受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。

吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内，被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。

例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的Rf值对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法加以定量。

Rf=溶质移动的距离/溶液移动的距离。表示物质移动的相对距离。

各种物质的Rf 随要分离化合物的结构，滤纸或薄层板的种类、溶剂、温度等不同而不同，但在条件固定的情况下，Rf对每一种化合物来说是一个特定数值。

（一）薄层色谱法所用的仪器与材料

1.载板变色硅胶

用以涂布薄层用的载板有玻璃板、铝箔及塑料板，对薄层板的要求是：需要有一定的机械强度及化学惰性，且厚度均匀、表面平整，因此玻璃板是最常用的。载板可以有不同规格，但最大不得超过20cm×20cm；玻璃板在使用前必须洗净、干燥。玻璃板除另有规定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的规格，要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。

2.固定相（吸附剂）或载体

薄层层析的硅胶薄层层析最常用的硅胶有硅胶G、硅胶GF、硅胶H、硅胶HF，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F等。其颗粒大小，一般要求直径为10～40μm。薄层涂布，一般可分为无黏合剂和含黏合剂两种。前者是将固定相直接涂布于玻璃板上，后者是在固定相中加入一定量的黏合剂，一般常用10%～15%煅石膏（CaSO4·2H2O）在140℃烘4h，混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.5%～0.7%）适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或缓冲液的薄层。

3.涂布器薄层层析硅胶

应能使固定相或载体在玻璃板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。

4.点样器

定性：内径为0.5mm、管口平整的普通毛细管。

定量：微量注射剂。

点样直径不超过5mm，点样距离一般为1～1.5cm即可。

5.展开室

应使用适合载板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，以便于观察。

除另有规定外，将1份固定相和3份水在研钵中向一个方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2～0.3mm），取下涂好薄层的玻璃板，置水平台上于室温下晾干，后在110℃烘30min，再置于有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。

手工制板一般分不含黏合剂的软板和含黏合剂的硬板两种。

常用吸附剂的基本情况：颗粒的大小有一定的要求，太大洗脱剂流速快分离效果不好，太细溶液流速太慢。一般说来吸附性强的颗粒稍大，吸附性弱的颗粒稍小。氧化铝一般在100～150目。碱性氧化铝适用于碳氢化合物、生物碱及碱性化合物的分离，一般适用于pH值为9～10的环境。中性氧化铝适用于醛、酮、醌、酯等pH值约为7.5的中性物质的分离。酸性氧化铝适用于pH值为4～4.5的酸性有机酸类的分离。氧化铝、硅胶根据活性分为五个级，一级活性最高，五级最低。

黏合剂及添加剂：为了使固定相（吸附剂）牢固附着在载板上，以增加薄层的机械强度、有利于操作，需要时在吸附剂中加入合适的黏合剂；有时为了特殊的分离或检出需要，要在固定相中加入某些添加剂。

薄层板的活化：硅胶板于105～110℃烘30min，氧化铝板于150～160℃烘4h，可得到活性的薄层板。

（二）点样与展开

除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，样点直径及点间距离同纸色谱法，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。

点样直径不超过5mm，点样距离一般为1～1.5cm即可。

样品在溶剂中的溶解度很大，原点将呈空心环——环形色谱效应。因此配制样品溶液时应选择对组分溶解度相对较小的溶剂。

点样方式有点状点样和带状点样。

展开剂也称溶剂系统流动剂或洗脱剂，是在平面色谱中用作流动相的液体。展开剂的主要任务是溶解被分离的物质，在吸附剂薄层上转移被分离物质，使各组分的Rf值在0.2～0.8，并对被分离物质要有适当的选择性。作为展开剂的溶剂应满足以下要求：适当的纯度、适当的稳定性、低黏度、线性分配等温线、很低或很高的蒸气压以及尽可能低的毒性。

对于展开方式总的来讲，平面色谱的展开有线性、环形及向心3种几何形式。

（1）单次展开　用同一种展开剂一个方向展开一次，这种方式在平面色谱中应用最为广泛（垂直上行展开，垂直下行展开，一向水平展开，对向水平展开）。

（2）多次展开　单向对此展开，用相同的展开剂沿同一方向进行相同距离的重复展开，直至分离满意，广泛应用于薄层色谱法。

（3）双向展开　用于成分较多、性质比较接近的难分离组分的分离。

薄层展开室需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴两条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡或按规定操作。将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，待展开至规定距离（一般为10～15cm）时，取出薄层板，晾干，按各品种项的规定检测。

影响展开的因素如下：

①相对湿度的影响；

②溶剂蒸气的影响（展开室的饱和、预吸附）；

③温度的影响；

④展距的影响（分离度正比于展距的平方根）。

（三）显色

1.光学检出法

a.自然光（400～800nm）。

b.紫外光（254nm或365nm）。

c.荧光：一些化合物吸收了较短波长的光，在瞬间发射出比照射光波长更长的光，而在纸或薄层上显示出不同颜色的荧光斑点（灵敏度高、专属性高）。

2.蒸气显色法显色

多数有机化合物吸附碘蒸气后显示出不同程度的黄褐色斑点，这种反应有可逆及不可逆两种情况。前者在离开碘蒸气后，黄褐色斑点逐渐消退，并且不会改变化合物的性质，且灵敏度也很高，故是定位时常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸气氧化、脱氢增强了共轭体系，因此在紫外光下可以发出强烈而稳定的荧光，对定性及定量都非常有利，但是制备薄层时要注意被分离的化合物是否改变了原来的性质。

3.物理显色法

用紫外照射分离后的纸或薄层，使化合物产生光加成、光分解、光氧化还原及光异构等光化学反应，会导致物质结构发生某些变化，如形成荧光发射功能团；发生荧光增强或淬灭及荧光物质的激发或发射波长发生移动等现象，提高了分析的灵敏度和选择性。

4.试剂显色法

该方法为广泛应用的定位方法。用于纸色谱的显色剂一般都适用于薄层色谱，防腐剂的显色剂不适合用于纸色谱及含有有机黏合剂薄层的显色。

（1）显色方法

a.喷雾显色　显色剂溶液以气溶胶的形式均匀喷洒在纸和薄层上。

b.浸渍显色　将展开剂的薄层板垂直插入盛有展开剂的浸渍槽中，设定浸板的抽出速度和在显色剂中浸渍的时间。

（2）显色试剂

a.通用显色剂为硫酸溶液（硫酸∶水=1∶1，硫酸∶乙醇=1∶1）、0.5%碘的氯仿溶液、中性0.05%高锰酸钾溶液、碱性高锰酸钾溶液（还原性化合物在淡红色背景上显黄色斑点）。

b.专属显色剂。

5.测定比移值

在一定的色谱条件下，特定化合物的Rf值是一个常数，因此有可能根据化合物的Rf值鉴定化合物。

6.薄层扫描

薄层扫描法，指用一定波长的光照射在经薄层层析后的层析板上，对具有吸收或能产生荧光的层析斑点进行扫描，用反射法或透射法测定吸收的强度，以检测层析谱。对于中成药复方制剂，亦可用相应的原药材按需要组合来作阴、阳对照，然后比较其薄层扫描图谱加以鉴别。使用仪器为薄层扫描仪。

如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量时，则可用薄层扫描法。薄层扫描的方法，除另有规定外，可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明，结合具体情况，选择吸收法或荧光法，用双波长或单波长扫描。由于影响薄层扫描结果的因素很多，故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描，进行比较并计算定量，以减少误差。各种供试品，只有得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。