第二节 冠状病毒的分离培养
一、标本的采集
（一）采集对象
新型冠状病毒肺炎疑似病例、临床诊断病例和聚集性病例，其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者，或其他需要进一步筛查检测的环境或生物材料（如溯源分析）等。
（二）标本采集要求
（1）从事新型冠状病毒检测标本采集的技术人员应经过生物安全培训（培训合格）和具备相应的实验技能。
（2）采样人员须穿戴专业防护装备：N95及以上防护口罩、护目镜、连体防护服、双层乳胶手套、防水靴套；如果接触了患者血液、体液、分泌物或排泄物，应及时更换外层乳胶手套。
（三）标本采集种类
（1）上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物等。
（2）下呼吸道标本：包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本。
（3）血液标本：尽量采集发病后7天内的急性期抗凝血标本。采集量5 mL，以空腹血为佳，建议使用含有乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝剂的真空采血管采集血液。
（4）血清标本：尽量采集急性期、恢复期双份血清。第一份血清应尽早（最好在发病后7天内）采集，第二份血清应在发病后第3～4周采集。采集量5 mL，建议使用无抗凝剂真空采血管。血清标本主要用于抗体的测定，从血清抗体水平对病例的感染状况进行确认。血清标本不进行核酸检测。
（5）眼结膜标本：出现眼部感染症状的病例需采集眼结膜拭子标本。
（6）粪便标本：出现腹泻症状的患者需采集粪便标本。
（7）肛拭子：可以提高检出率，有效降低假阴性的概率，减少漏诊情况。
（四）标本采集方法
（1）咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3 mL采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
（2）鼻拭子：将一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一含3 mL采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
（3）鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取黏液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的黏液，并用3 mL采样液冲洗收集器1次（也可用小儿导尿管接在50 mL注射器上来替代收集器）。
（4）深咳痰液：要求患者深咳后，将咳出的痰液收集于含3 mL采样液的50 mL螺口塑料管中。
（5）支气管灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约30 cm深处），注入5 mL生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的黏液，并用采样液冲洗收集器1次（也可用小儿导尿管接在50 mL注射器上来替代收集器）。
（6）肺泡灌洗液：局部麻醉后将支气管镜通过口或鼻经过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支气管，将其顶端契入支气管分支开口，经气管活检孔缓缓加入无菌生理盐水，每次30～50 mL，总量100～250 mL，不应超过300 mL，3 s后即可以回收，回收率不少于40%。
（7）血液标本：建议使用含有抗凝剂的真空采血管采集血液标本5 mL，室温静置30 min，以1 500～2 000 r/min的速度离心10 min，分别收集血浆和血液中细胞于无菌螺口塑料管中。
（8）血清标本：用真空负压采血管采集血液标本5 mL，室温静置30 min，以1 500～2 000 r/min的速度离心10 min，收集血清于无菌螺口塑料管中。
（9）粪便标本：如患者发病早期出现腹泻症状，则留取粪便标本3～5 mL；
（10）肛拭子标本：采样有3个步骤，用消毒棉拭子插入肛门3～5 cm；在肛门内旋转棉拭子后拔出；放入采样管中。
（11）眼结膜拭子标本：眼结膜表面用拭子轻轻擦拭后，将拭子头插入采样管中，尾部弃去，旋紧管盖。
（12）其他材料：依据设计需求规范采集。
（五）标本包装
标本采集后在生物安全二级实验室生物安全柜内分装。
（1）所有标本应放在大小适合的带螺旋盖（内有垫圈）、耐冷冻的样本采集管里，拧紧。容器外注明样本编号、种类、姓名及采样日期。
（2）将密闭后的标本放入大小合适的塑料袋内密封，每袋装一份标本。
（六）标本保存
用于病毒分离和核酸检测的标本应尽快进行检测，能在24小时内检测的标本可置于4℃保存；24小时内无法检测的标本则应置于−70℃或以下环境保存（如无−70℃保存条件，则于−20℃冰箱暂存）。血清可在4℃存放3天，−20℃以下可长期保存。应设立专库或专柜单独保存标本。标本运送期间应避免反复冻融。
（七）标本送检
标本采集后应尽快送往实验室，如果需要长途运输标本，建议采用干冰等制冷方式进行贮藏。
二、病毒的分离培养
病毒培养多包括细胞培养和鸡胚培养（9～11日龄鸡胚）两种方法。从呼吸道标本培养分离出的病毒进行鉴定常作为呼吸道病原体实验室诊断的金标准，其敏感性和特异性均在90%以上，但由于病毒培养周期较长，技术难度高且操作复杂，生物安全条件要求高，一般不适合应用于临床检测。目前公布的各项SARS-CoV-2防治诊疗指南中均未把病毒分离培养与鉴定列入病原学检测项目。
（覃 岭）