三、电子显微镜技术

（一）透射电子显微镜

透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）的成像原理与光镜显微镜不同（图2-3），它是用电子束作光源，用电磁场作透镜。电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。当电子束透射样品时，由于样品不同部位对入射电子具有不同散射度，而形成不同电子密度（即浓淡差）的高度放大图像，最后显示在荧光屏上或记录在照相感光胶片上。因为电子波的波长远比光波的波长短，所以电镜的分辨本领比光学显微镜显著提高，其分辨率可达0.2nm。由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片（表2-2）。这种切片需要用超薄切片机（ultramicrotome）制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍，由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统以及电源系统五部分构成。

目前已能在电镜照片上直接看到生物大分子的粗糙轮廓。透射式电镜主要用于观察和研究细胞内部细微结构。进行透射电子显微镜观察时最基本的制片技术是超薄切片术，切片厚度是40～50nm。切片可以单染，也可以双重染色，以增大反差。同时，也可以通过负染色技术控制电镜的分辨率，通过冷冻蚀刻技术观察细胞断裂面处的结构。

图2-3　光镜、透射电镜和扫描电镜主要特征示意图（引自 B.Alberts et al，1989）

表2-2　不同光源的波长

（二）扫描电子显微镜

扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）中电子枪发射出的电子束，经过几组电磁透镜将电子束缩小为约0.5nm的电子探针并冲击样品表面，激发出次级电子，即二次电子。二次电子的信号被收集、转换和放大后送至阴极射线管，在某一点上成像。在电子束行进的途中有一组电子偏转系统，可使电子探针在样品表面按一定顺序扫描，且这一扫描过程与阴极射线管的电子束在荧光屏上的移动同步，这样，当电子探针沿着标本表面一点一点移动时，标本表面各点发射的二次电子所带的信息量加在阴极射线管的电子束上，在荧光屏上就扫描出一幅反映样品表面形态的立体图像。通过照相可把图像记录下来。

一般扫描电镜的分辨率为3nm，近年研制的低压高分辨扫描电镜分辨率可以达到0.7nm，可以观察核孔复合体等更精细的结构。扫描电子显微镜扫描样品在干燥前需要用戊二醛和锇酸等临界温度和压力都较低的有机溶剂作媒介进行固定。干燥后在观察前还需喷镀一层金属薄膜，增加样品的导电性能，防止电荷积累，保持样品表面不皱缩、不塌陷，以得到良好的二次电子信号。