第四节　组织学常用研究技术方法

随着生命科学整体研究水平的提高，许多新技术、新方法被广泛应用于组织学研究领域，为拓展和提高组织学研究内容及水平提供了精湛的技术支持。这里仅就组织学研究常用技术方法简介如下。

一、普通光学显微镜技术

普通光学显微镜（light microscope，LM）简称光镜，使用光镜观察组织切片是组织学最常用的技术，光镜可最大限度地将观察物体放大1000～1500倍，分辨率极限达0.2μm。观察前须将研究的细胞、组织或器官经一系列的人工特殊处理及标本制作，后者可分为切片法和非切片法两种。

1.切片法　石蜡切片术（paraffin sectioning）是经典的最常用的技术，其标本制作过程包括取材、固定、脱水、透明、包埋、切片、脱蜡、染色和封片等几个主要步骤。

（1）取材　从机体取下所需新鲜组织器官的过程称取材，厚度不超过0.5cm为宜。

（2）固定　为防止取材后的组织器官蛋白质分解、自溶，并保持细胞在活体时的形态结构，需经固定剂固定。常用的固定剂有甲醛、乙醇、丙酮等。

（3）脱水　将固定后的组织器官经各级不同浓度乙醇逐渐脱除水分的过程。

（4）透明　使用二甲苯、苯、氯仿等透明剂对组织器官进行浸泡，以置换出其中的乙醇。

（5）包埋　为便于将组织器官切制成薄片，常用石蜡、火棉胶、树脂等包埋剂对其进行包埋。

（6）切片　采用组织切片机切制厚度为5～10μm的组织薄片，并裱贴在载玻片上。

（7）脱蜡　组织切片标本经二甲苯脱去其中的石蜡成分，便于染色。

（8）染色　染色的目的是让组织细胞的不同成分结构形成色差（反差），便于光镜下观察。组织切片染色是基于化学结合或物理吸附的原理。常用的酸性染色剂有伊红、坚牢绿、橙黄G等，碱性染色剂有苏木精、亚甲蓝、碱性品红等。组织学最常用的染色方法是苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）染色剂组合的染色方法，简称HE染色（H&E staining）或普通染色。伊红为酸性染料，可使细胞质和细胞外基质中的成分着粉红色，称嗜酸性（acidophilia）；苏木精为碱性染料，可使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色，称嗜碱性（basophilia）；对酸性染色剂和碱性染色剂亲和力均较弱的现象，称中性（neutrophilia）。

（9）封片　染色后的组织切片滴加树胶用盖玻片封固，利于保存和观察。

某些特殊染色时，一些重金属盐可附着在组织细胞结构表面，在银染色方法中，直接使硝酸银还原而显色呈棕黑色的现象称亲银性（argentaffin）；需添加还原剂才能显色的现象称嗜银性（argyrophilia）。组织细胞中的糖胺多糖类物质用甲苯胺蓝（toluidine blue）等碱性染色剂染色后呈紫红色的现象称异染性（metachromasin）。

组织器官取材后直接快速冷冻，然后在恒冷箱切片机中切片的方法称冰冻切片法。该法能有效保存组织器官内脂类成分和酶活性，常用于细胞组织化学研究。

2.非切片法　非切片法是指不经包埋、切片等步骤制作标本的方法。如将血液、分离细胞、脱落细胞等直接涂在载玻片上，称涂片法；将肠系膜、皮下组织撕成薄片后直接铺贴在载玻片上，称铺片法；将牙、骨等较坚硬的组织器官经机械性打磨制成薄片后贴附在载玻片上，称磨片法。上述各方法制成的标本再经固定、脱水、染色、封片后，便可在光镜下观察。

二、特殊光学显微镜技术

1.荧光显微镜技术　荧光显微镜（fluorescence microscope）以紫外线为光源，能激发染料发出荧光，是一种用来观察被荧光素染色或标记的细胞及标本中自发荧光物质的特殊显微镜。荧光显微镜技术包括自发性荧光、荧光染色法和荧光免疫细胞化学染色法三大类。利用荧光素标记的抗体直接或间接与组织细胞内相应抗原结合的原理，可检测相关抗原的定性、定位或定量。其主要特点是特异性强、敏感性高和简便高效。

2.倒置显微镜技术　倒置显微镜（inverted microscope）是把光源和聚光器安装在显微镜载物台的上方，而物镜安装在载物台下方的特殊显微镜。其特点是增大了载物台与物镜间的距离和空间，便于观察体积较大的标本物体，如放置培养皿、培养瓶或保温装置等，便于直接观察体外培养的细胞及对活细胞进行各种实验的连续观察和图像拍摄。倒置显微镜和显微操作器结合还可进行显微注射等精度极高的研究工作。

3.相差显微镜技术　相差显微镜（phase contrast microscope）是通过改变光的相位，使相位差变为振幅差，借增强或减弱光的明暗度观察生活状态下活细胞微细结构的特殊显微镜。而倒置相差显微镜用于观察活细胞分裂、增殖及运动等变化。

4.暗视野显微镜技术　暗视野显微镜（dark field microscope）是以胶体粒子干涉和散射效应为基础研制的特殊光镜，其基本原理是通过暗视野照明法，观察被检物体表面散射的光层，以确定被检物体存在与否及其运动状况，但不能分辨物体的微细结构。其主要适用于观察液体介质内未染色的细菌、酵母、霉菌及血液中的白细胞等的运动状态。

5.偏光显微镜技术　偏光显微镜（polarization microscope）具有产生偏光和检查偏光的装置，主要适用于晶体物质和纤维结构的研究，如纺锤体、肌纤维、胶原纤维等。

6.激光共聚焦扫描显微镜技术　激光共聚焦扫描显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）是20世纪80年代初研制成功的一种具有高光敏度、高分辨率的新型显微镜，主要原理是以激光为光源，运用共聚焦成像扫描系统将光束经聚焦后落在样品不同深度的微小部位，并做移动扫描，通过电子信号彩色显像，图像被探测器吸收后除传至彩色显示器荧屏外，还可同时传至图像分析系统进行二维或三维分析处理。CLSM可精确地对细胞内Ca2+、pH值等进行动态分析测定；对细胞的受体移动、膜电位变化、酶活性、信号转导和物质转运等进行观察测定；还可利用激光对细胞及染色体进行切割和分选等多项研究功能。

三、电子显微镜技术

电子显微镜（electron microscope，EM，简称电镜）与光镜的成像原理不同，是以电子束（电子枪）代替光源，电磁透镜代替聚光镜、物镜和目镜，用荧光屏成像。由于电子束在不同电压下产生不同的短波长，所以电镜的分辨率极限达0.1～0.2nm，可将观察物体放大近百万倍。电镜的种类和用途很多，常用技术如下。

1.透射电镜技术　透射电镜（transmission electron microscope，TEM）工作原理是由电子枪发射的电子束穿透观察样品后，经电磁场的聚合放大并在荧屏上显像（图1-1）。该技术的核心是样品制备，主要过程包括：将1mm3大小的组织块经戊二醛和锇酸进行双重固定、环氧树脂包埋后，制成厚度为50～100nm的超薄切片，并裱贴在铜网上，用铅和铀等重金属盐进行电子染色后，即可在电镜下观察。通常将电镜下所见结构称超微结构。凡被重金属盐电子染色结合的部位图像较暗，称电子密度高（electron dense），反之图像较明亮则称电子密度低（electron lucent）。上述被检结构与重金属盐结合后，图像呈电子密度高的染色称正染色；当重金属盐不与被检结构结合而与被检结构周围区域发生结合时，称负染色。

2.扫描电镜技术　扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）工作原理是由电子枪发射的电子束经聚焦形成一束光斑称电子探针，打在被观察样品表面后，可击出样品表面外层电子即二次电子。二次电子信号被探测器收集，并经光电倍增放大送至荧屏显像。主要用于观察样品表面形态，富有强烈的立体感，其分辨率为6～10nm。该技术的样品制备不必经超薄切片，只是要求样品表面充分暴露且干燥不变形，故样品须经固定、脱水、干燥后在其表面喷镀一层金属膜，以提高其导电性和图像反差。该技术常用于观察某些特殊结构或细胞群体的表面形态，如纤毛、微绒毛、T细胞等。

3.冷冻蚀刻复型技术　冷冻蚀刻复型技术（freeze etch replica）需将观察的组织样品用液氮超低温（-196℃）冷冻，并在真空条件下使样品断裂，升温至-100℃时断裂面含游离水较多之处的冰晶出现升华，断裂面即可呈现凹凸不平的浮雕效果，称蚀刻。蚀刻后的样品在其断裂面上先后喷镀一层铂和碳，称复型。复型后的样品用次氯酸等腐蚀剂将组织溶解，剩下的仅是一层金属复型膜，置于透射电镜下观察，所显示的凹凸面与样品实物恰恰相反。该技术尤其适用于生物膜内部结构的研究。

4.冷冻割断技术　冷冻割断技术（freeze cracking）是将已固定、包埋的观察样品在低温（-196℃）下割断。样品的断面喷镀金属膜，在扫描电镜下观察断面的三维结构。该技术尤其适用于组织内部微细结构相互关系的研究，如肝脏窦周隙及毗邻关系等。

5.扫描电镜铸型技术　扫描电镜铸型技术（scanning electron microscope casting）特别适用于观察空腔性结构的微细立体结构。

6.X-衍射显微分析技术　X-衍射显微分析技术（X-ray diffraction microanalysis）是当前研究生物大分子元素空间结构最有效的技术方法之一。

7.超高压电镜技术　超高压电镜技术（ultravoltage electron microscope，UEM）是指电子束的加速电压超出500kV以上的电镜（普通电镜在200kV以下）。目前世界上已知的电镜加速电压最高可达3000kV。UEM适于观察较厚的样品，如培养的细胞无须超薄切片即可直接观察细胞内微丝、微管等结构。

8.扫描探针电镜技术　扫描探针电镜技术（scanning probe electron microscope，SPM）是新一代研究测量物体表面性状的生物技术，主要有扫描隧道电镜技术（STM）、原子力电镜技术（AFM）、磁力电镜技术（MFM）等。SPM技术在DNA、蛋白质及生物膜等研究领域的应用尤为突出。

四、组织化学和细胞化学技术

组织化学（histochemistry）和细胞化学（cytochemistry）技术是基于物理和化学反应的原理，使组织细胞内某化学成分形成有色沉淀物，便于在光镜或电镜下对其进行定性、定位和定量研究。常用的研究内容如下。

1.糖类　显示多糖和蛋白多糖常用过碘酸-希夫反应（periodic acid-Schiff reaction，PAS反应）。其原理是过碘酸氧化反应可使糖分子的乙二醇基氧化形成乙二醛基，后者与Schiff试剂中无色碱性品红结合，即可在原糖分子存在的部位形成紫红色反应产物并形成沉淀，间接显示细胞内糖物质的状态。

2.脂类　为防止有机溶剂对脂肪和类脂的溶解，用冰冻切片为宜。可采用苏丹黑、油红O、尼罗蓝等易溶于脂类的染料进行染色。也可采用锇酸（OsO4）固定兼染色，脂肪酸或胆碱均可使锇酸还原为OsO2，使脂类呈黑色。

3.酶　已知细胞内有氧化还原酶系、水解酶系等各种酶类，现已有100多种酶的显示法。其基本原理均是利用酶对其相应底物水解、氧化产生的反应物与捕获剂发生反应时，可形成显微镜下可视的有色反应最终产物。常以最终产物显色的深浅表示该酶活性的强弱。

4.核酸　常用孚尔根反应（Feulgen reaction）显示DNA，其原理是DNA分子中的脱氧核糖与嘌呤之间的连接键经稀盐酸处理后被打开，在形成醛基后再与Schiff试剂中的碱性品红作用，使DNA呈紫红色。也可用甲基绿-派若宁反应，DNA呈蓝绿色，RNA呈红色。

五、免疫组织化学和免疫细胞化学技术

免疫组织化学（immunohistochemistry）和免疫细胞化学（immunocytochemistry）均基于抗原-抗体特异性结合的免疫学原理，将已知细胞内某种多肽、蛋白质作为抗原注入机体内，使机体产生与之相应的抗体，并分离提取，提取后的抗体用荧光染料或铁蛋白予以标记。最终用标记的抗体来寻找观察样品中能与其发生特异性结合的抗原。光、电镜下样品中凡有标记物的部位即可表明相应抗原的存在。

通常标记抗体与抗原发生直接结合称直接法（图1-2A），又称一步法，该方法简单方便，特异性强，但敏感性较低；若将分离提取的抗体（Ⅰ抗）再作为抗原去免疫另一机体，并制备原抗体（Ⅰ抗）的抗体，后者称Ⅱ抗，用标记物如荧光素或酶等再标记Ⅱ抗，最后用Ⅰ抗和标记Ⅱ抗先后处理观察样品，即形成抗原-Ⅰ抗-标记Ⅱ抗的复合物，此方法称间接法（图1-2B），又称二步法。间接法中的一个抗原分子可通过一个Ⅰ抗与多个标记Ⅱ抗结合，因而具有较高的敏感性，其不足是易出现非特异性反应。

目前，间接法较常用的是PAP（过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物）法，因抗原经抗体逐级放大并与酶分子结合，使其敏感性更强（图1-3）。而ABC（抗生素-生物素-过氧化物酶复合物）法比PAP法敏感性提高20～30倍（图1-4）。如使抗体与荧光素结合，则称荧光标记抗体法（图1-5）。

六、原位杂交技术

原位杂交技术（in situ hybridization）又称核酸分子杂交组织化学技术，用来检测样品中特定的基因片段、转录水平的基因活性及表达（mRNA）。其原理是依据DNA双链的核苷酸互补特点，将带有标记物的已知碱基序列的核酸片段（探针），与组织细胞内待测的核酸进行特定的杂交，并通过标记物的显示，在光镜、电镜下检测被杂交核酸的存在与否或定位、定量（图1-6）。目前该技术使用的核酸探针标记物通常有放射性类和非放射性类两种。放射性类常用的核素为35S、32P和3H等，经放射自显影技术处理后即可用光镜、电镜观察。非放射性类的标记物为地高辛、生物素、荧光素、铁蛋白等，可经免疫组织化学技术处理后观察。

七、细胞化学计量技术

细胞化学计量技术（quantitation in cytochemistry）是一种应用数字来反映组织细胞内某类化学物质或反应产物的量化方法。常用的技术方法如下。

1.显微分光光度测量技术　显微分光光度测量技术（microspectrophotometry）是采用显微分光光度计基于细胞内某物质的消光度与其厚度和该物质的浓度成正比的原理，通过光电自控系统将所测的消光度转换为电信号而获得光密度（OD）值，对样品进行定量分析。

2.流式细胞技术　流式细胞技术（flow cytometry，FCM）可对单个细胞的生理、生化和生物物理特性进行快速高效分析测定。常用于细胞动力学、免疫学和肿瘤学中的DNA、RNA、蛋白质、染色体、抗原、抗体、细胞亚群和杂交细胞的分选研究。

3.显微图像分析系统　显微图像分析系统（microscope image analysis system）主要由显微镜、计算机、图像采集装置和数据处理分析软件四大构件组成，可快速准确地进行组织切片或电镜照片中微细结构和成分的数量、体积、面积、周长、直径等相对和绝对值的测定并打印，同时可进行二维或三维的转换，其中三维立体结构的测定研究也称体视学。同样也可经外置的图像采集装置对较大的被检测物如整体动物（小鼠）、器官及X线片等实物进行图像采集并进行测定分析。

八、放射自显影技术

放射自显影技术（autoradiography，ARG）是基于放射性同位素（radioisotope，RI）核裂变时放出的核射线可使感光材料中的溴化银颗粒感光还原成银粒的原理，将标记的示踪剂注入机体或掺入培养基中，经细胞摄取后，取被检组织或细胞制成切片或涂片标本，并与感光材料紧贴，经适当时间的曝光、显影和定影后，可呈现出与标本中示踪剂分布部位、数量、强度（浓度）完全一致的影像，可得知示踪剂的精确分布和含量。

九、体外培养技术

体外培养技术（in vitro culture）是组织培养（tissue culture）和细胞培养（cell culture）的总称（图1-7）。该技术取活体组织或细胞后，置体外适宜的条件下，在使其继续生长、繁殖的同时进行实验观察研究，故体外培养技术又称体外实验。首次分离后培养的细胞称原代培养（primary culture）；细胞增殖后再传代继续培养的细胞称继代培养（subculture）；经长期反复传代培养而成的细胞称细胞系（cell line）；采用细胞克隆而建成的某种纯细胞群体称细胞株（cell strain）。

十、细胞融合技术

细胞融合技术（cell fusion）是指用人工方法在体外使两个或两个以上细胞成为一个双核或多核细胞的过程。细胞融合可在基因型相同或不同的细胞中进行。前者形成的融合细胞称同核体，后者形成的融合细胞称异核体。采用细胞融合技术，使离体培养的两个不同个体的细胞发生融合，形成一个新型的杂交细胞（hybrid cell）是当前生物医学中建立新品系细胞的重要手段，也是制备单克隆细胞系的关键技术。

十一、组织工程技术

组织工程（tissue engineering）是一门新兴学科，是应用生命科学和工程学的原理与技术，在掌握机体正常及病理两种状态下的结构与功能关系基础上，采用以生物材料为替代物，更新、修复机体损伤或衰老的组织器官。组织工程的核心是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建，并达到永久性替代。

组织工程技术的实施须有四个前提条件：①种子细胞：即分裂、增殖旺盛的细胞，如人胚干细胞；②细胞间质：可以是生物性材料，如牛胶原，或是无毒、可被机体吸收的人工合成的高分子材料，如聚乙醇酸；③构建复合物：在体外让种子细胞在细胞间质上进行三维培养，并形成所需形状的复合物；④将复合物移植到机体所需的部位。

视窗

撩开“精子库”的面纱

笼罩着神秘面纱的精子库又称精子银行。早在1778年，有学者研究发现，将精子置于冰雪中降温后再复温，部分精子仍具有运动能力。在过去的几十年中研究发现，低温可影响细胞的生化进程，利于细胞保存。精子是人体中最耐冷冻的细胞之一，将其置于液氮（-196℃）中保存，细胞进程则处于停滞状态，10～20年复苏后精子仍能保持活力。实践证明冷冻复苏后的精子通过人工授精，能够使人正常受孕，这一研究成果为精子库的建立奠定了基础。而最早的人类精子库是为参战士兵而建的。

曾获得诺贝尔奖的美国遗传学家H.J.Muller，几十年前提出了一个大胆且颇有争议的建议——建立“天才”精子库，专门贮存卓越人士的精子。只有少数诺贝尔奖获得者支持并捐献了自己的精子，贮存于美国加利福尼亚的某精子库中，人们称其为“诺贝尔精子库”。Muller的愿望是美好的，他想把具有卓越才能和优良素质的人的生殖细胞贮存起来，供人们选择，以提高人类的基因质量，使优良性状延续，孕育出更多的天才。遗憾的是并没有“人造诺贝尔才子”降世，因为卓越人士的产生不仅与遗传有关，更重要的是环境因素对遗传的影响，况且这些成功人士一般年龄偏高，甚至年过花甲，而精子的基因突变率与年龄成正比，这使子代出现先天性遗传病的概率也随之增高。同时还涉及伦理方面的诸多问题。

国内外的相关研究表明，发达国家的男性，其精子数量和质量都呈现下降趋势。这与环境污染、地球变暖、生育年龄推迟有着密切的关系。另外，生活环境与工作压力，以及疾病、意外伤害等诸多不可预测的因素，都可能使人们的生育能力发生变化。而人生的最佳生育时间仅为十几年，精子库的建立就是为男士们未雨绸缪，提供“生殖保险”和“优生保险”，以解除后顾之忧。现在精液冷冻技术在医学、生物学和畜牧业等许多领域得到广泛应用。我国几个大城市已分别建立了精子库。