一、骨诱导生物材料

如前所述，传统观念认为，无生命的生物材料不可能诱导有生命的组织再生。20世纪90年代初，中国科学家发现并证明一定的多孔磷酸钙陶瓷可以诱导骨再生（图1-3）。10类不同组成和结构的多孔磷酸钙陶瓷，植入6类不同种属动物非骨部位后，对万余张组织切片的统计分析显示，材料的骨诱导作用是与材料组成、结构和动物种系密切相关的（图1-4）。

图1-3　多孔磷酸钙陶瓷植入狗背肌内45天取材后的组织学分析

BMP-2.bone morphogenetic protein-2，骨形态发生蛋白质-2。

图1-4　不同多孔磷酸钙陶瓷在不同种属动物中诱导成骨的统计分析

BCP 1 100.烧结温度为1 100℃的双相磷酸钙陶瓷；BCP 1 200.烧结温度为1 200℃的双相磷酸钙陶瓷；HA 1 200.烧结温度为1 200℃的羟基磷灰石陶瓷。

进一步研究揭示，诱发材料骨诱导作用的必要材料学因素是：三维贯通的类骨多孔结构和表面类骨磷灰石的形成。多孔且孔壁富含贯通微孔的磷酸钙陶瓷表现出骨诱导性，而致密或孔壁闭合的磷酸钙陶瓷无骨诱导性。三维贯通孔隙结构的存在与否，是材料有无骨诱导性的首要决定因素（图1-5）。基因层面，多孔结构可上调细胞成骨基因表达，归因于类骨多孔结构有利于新骨形成所需营养和氧的供应，而表面微孔更易于富集微环境中的离子或蛋白。此外，骨诱导性材料表面能够在模拟体液或体内生理环境中形成类骨磷灰石（图1-6），这是一种在生物大分子参与和调控下，结晶不完善的磷灰石微晶所形成的表面层。宿主微环境亦能影响材料表面类骨磷灰石的形态，不同植入部位、不同相组分的多孔磷酸钙陶瓷能够形成不同形貌及尺寸的类骨磷灰石。同时，类骨磷灰石表面层的厚度、面积与材料诱导骨生成的量呈正相关趋势，说明类骨磷灰石的形成是材料诱导成骨的关键材料学因素之一。大量的研究证实，经适当的表面生物活化处理，表面形成类骨磷灰石层的多孔钛金属，植入体内也可诱导骨形成。此现象既说明孔结构和类骨磷灰石两个因素促进材料诱导成骨的普适性，又大大拓宽了生物材料骨诱导理论的应用范围。

图1-5　类骨多孔结构在诱发材料骨诱导中的作用

图1-6　表面形成类骨磷灰石层在诱发材料骨诱导中的作用

V.血管；M.陶瓷材料；B.新骨。

材料可以诱导骨再生的立论点是自然骨的形成过程。自然骨的形成是在成骨部位的间充质干细胞，通过一系列的细胞分化过程完成。细胞分化过程受控于细胞内级联激活的成骨基因表达，后者则取决于细胞所处的微环境。材料介入生物环境必将改变细胞所处的微环境，影响细胞内基因表达及细胞分化方向，从而可能形成特定的组织（图1-7）。

研究发现，骨诱导性材料可以募集间充质干细胞迁入待修复区域。高分辨透射电镜观察发现，材料植入早期长入其内部孔隙的、丰富的纤维组织可以提供成骨分化所必需的间充质细胞。同时，通过免疫组织化学染色切片观察发现，植入动物体内的骨诱导性磷酸钙陶瓷孔隙内有大量骨髓来源的间充质干细胞。近年来，有研究者通过性别交叉实验，将雄性比格犬的骨髓干细胞移植入雌性动物骨髓中，随后对雌性比格犬肌内植入骨诱导性磷酸钙陶瓷，4周后不但观察到陶瓷内部新骨生成，还在其孔隙内检测到雄性动物干细胞来源的Y染色体。研究结果证明，在磷酸钙陶瓷异位诱导成骨的过程中，骨髓中的干细胞会被募集迁移至非骨位置，直接参与骨诱导过程。募集而来的骨髓干细胞具备骨、软骨、脂肪等多向分化潜能，其分化方向受到各种生长因子的调控。因此，骨诱导过程亦离不开材料对干细胞成骨分化的维持，直至其分泌骨基质形成骨组织。早期已有研究表明，骨诱导性材料具备吸附富集某些生长因子或细胞因子的功能，植入后材料的免疫组织化学切片显示孔隙内具有骨形态发生蛋白质-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）的显著阳性着色。体内外吸附实验同样证明，骨诱导性材料可特异性吸附富集BMP-2、重组人转化生长因子-β1 （transforming growth factor-β1， TGF-β1）等生长因子蛋白。再者，骨诱导性材料亦能直接刺激与其接触的细胞，激活细胞中成骨基因级联表达，并转录为细胞因子，这些因子将通过自分泌或旁分泌通路再作用于自身或其他细胞，使其定向分化（图1-8）。体内外研究显示，干细胞能够积极响应骨诱导性材料的刺激，促使细胞内TGF-β1、BMP-2、核心结合因子（core binding factor 1，Cbfa1）、骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）、整合素（integrin）等成骨相关基因蛋白发生时序性变化。其中，有报道显示，诸如BMP/Smad（drosophila mothers against decapentaplegic protein）、Wnt（Wingless-type MMTV integration site family）等经典骨发育信号通路在材料诱导成骨过程中亦具有重要作用。这些通路的上调与否甚至可以作为预测材料骨诱导性的指标。

图1-7　自然骨形成过程中的细胞分化和级联基因表达

图1-8　骨诱导相关细胞及信号通路

PTH.parathyroid hormone，甲状旁腺激素；BMPs.bone morphogenetic proteins，骨形态发生蛋白质家族；Wnts.Wnt proteins，Wnt蛋白质类；OPG.osteoprotegrin，护骨因子；M-CSF.macrophage colonystimulating factor，巨噬细胞集落刺激因子；RANKL.receptor activator of nuclear factor-κB ligand，核因子κB受体激活蛋白配体。

材料除了能够改变干细胞自身分泌的因子来调控其成骨分化，还能通过旁分泌通路改变其周围炎性细胞的因子分泌来诱导干细胞成骨。研究确证，材料植入动物体内早期的组织切片中即观察到巨噬细胞。一方面，骨诱导性材料可改变单核/巨噬细胞的表型及其表达的单核细胞趋化蛋白（monocyte chemotactic protein，MCP）、胰岛素样生长因子（insulin like growth factor，IGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等免疫相关炎性因子，这些因子的表达变化进一步解释了巨噬细胞与骨诱导性材料共培养可促进干细胞迁移和成骨分化。另一方面，巨噬细胞能够顺应材料刺激而发生破骨细胞分化。分化而来的破骨细胞将材料识别为骨，在其表面发生类似于骨吸收的作用，改变材料表面微观形貌以及离子的溶出释放行为等，再作用于干细胞，诱导其成骨分化。

除了通过刺激宿主免疫反应来间接调控成骨，骨诱导性材料还能够通过调控血管生成来促进成骨。材料诱导成骨过程中常常伴随着大量毛细血管的新生。体内外实验研究表明，骨诱导材料有促进内皮细胞的增殖和血管分支作用（图1-9）。这个过程可能由材料介导的内皮细胞自分泌或成纤维细胞旁分泌作用来实现。血管的生成不仅提供了新陈代谢物质的输送，并且可以将其他部位，如骨髓中的干细胞运送至成骨部位。另外，血管中的内皮或周皮细胞还可能受材料或其他分泌因子（如炎性因子）的刺激作用而转换为间充质干细胞[上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）效应]，为成骨提供可分化的干细胞。从材料角度而言，植入材料中血管的生成受到材料结构、组分及降解速率的影响。简而言之，骨诱导材料可能通过综合调控干细胞自分泌/旁分泌、免疫反应和血管生成等过程来实现其骨诱导功能。

图1-9　多孔磷酸钙陶瓷植入小鼠大腿肌内不同时期的组织学分析（HE染色，内部孔隙内有大量新生血管）

HA.羟基磷灰石；BCP-1.羟基磷灰石占比70%的双相磷酸钙陶瓷；BCP-2.磷酸三钙占比70%的双相磷酸钙陶瓷；β-TCP.β-磷酸三钙陶瓷；1周.植入皮下1周；2周.植入皮下2周；4周.植入皮下4周。

图1-10　生物材料诱导骨形成的机制假设

图1-10为生物材料诱导骨再生的机制简图。

骨诱导性材料的阶段性研究成果已初步实现工程化和临床转化。基于多孔磷酸钙陶瓷开发的骨诱导人工骨作为骨缺损腔充填剂和不承力部位的骨修复体，迄今临床应用已超过30万例（图1-11）。典型的案例是应用于骨腔缺损的填充修复，其中1例用于6岁儿童右胫骨病变行病灶清除后的颗粒人工骨植入，术后25年随访，患者已成人且双下肢等长，步态正常；骨诱导椎板材料的临床应用已超过20年，材料既可诱导骨再生，也能形成光滑脊柱内膜；颗粒和柱状骨诱导人工骨组合应用于股骨头缺血性坏死病例，亦表现出良好的修复效果。2016年以来，国内外研究人员进一步采用先进的材料表面生物活化改性技术，在可承重生物惰性钛合金、聚醚醚酮表面进行改性，增强其体内形成类骨磷灰石层的能力或仿生矿化沉积类骨磷灰石涂层，赋予材料良好的生物活性甚至骨诱导性，创造了基于高界面结合强度的仿生脊柱融合器。这一突破，解决了常规融合器与界面骨结合不稳定、生物力学相容性差等影响融合的难题，可实现脊柱长期稳定的融合。

图1-11　骨诱导人工骨产品及其临床应用实例

生物材料骨诱导性的研究和骨诱导人工骨的研发成功，是生物材料学与工程的突破性进展，证明了无生命的生物材料可以诱导有生命的骨再生和形成，为再生医学的发展开辟了一条新的途径，即可利用优化设计的生物材料植入体内，直接刺激机体再生组织或器官，可称之为体内组织工程（in vivo tissue engineering），“划时代地宣告再生医学中骨诱导材料的到来”（T.Kokubo教授），是“对中国和全球骨骼-肌肉系统治疗方面的开创性贡献，并引领生物材料产品开发”。