一、实验室诊断方法

1.一般常规检验

（1）外周血白细胞：

病毒性感染的患儿通常外周血白细胞计数正常或偏低，中性粒细胞减少，淋巴细胞和单核细胞比例升高。病毒感染较重时，如流感危重症，淋巴细胞往往偏低。值得注意的是，部分病毒感染也可引起白细胞升高，如EBV、CMV、汉坦病毒，部分肠道病毒如EV-A71等。

（2）C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）：

CRP水平正常或轻度升高。

（3）降钙素原（procalcitonin，PCT）：

是诊断脓毒症和识别严重细菌感染的生物标志物。当病毒感染时，由于机体干扰素-γ增高，会降低白细胞介素1β（IL-1β）对PCT的上调作用，故可用PCT值来粗略区分病毒和细菌感染。通常认为，PCT＜0.25μg/ml不考虑存在细菌感染。

2.生化检验

病毒感染的生化检测无特征性。不同病毒感染所致的心肌、肝脏等损害程度不同，表现也不同，部分病毒感染患儿可有肝酶、血乳酸脱氢酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶升高及电解质紊乱等。

3.血清学检测

病毒感染血清学检测抗体的方法包括补体结合试验、血凝抑制试验、中和试验、免疫黏附血凝试验等。病毒感染血清抗体主要包括IgM和IgG。IgM阳性表明感染发生于当前或近期，有急性感染可能。在初次感染中，IgM可在症状出现的几天内出现，7～10天达到高峰，30天后迅速降低，部分患儿2～3个月后仍可检测阳性。IgM表达1周左右后，IgG表达上升，IgG在恢复期较急性期有4倍及以上升高也可作为现症感染的依据。病毒自然感染或人工免疫后，血清IgG在IgM产生后出现，并到达比IgM更高的水平，之后逐渐下降至一个略低水平持续数年甚至终身。当再次感染时，IgG发生记忆应答，IgM则可应答或不应答。其他抗体IgA、IgD和IgE对病毒感染的预测价值没有IgM和IgG高。

已有商品化的酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒可检测血清中呼吸道病毒的抗体水平。由于呼吸道病毒感染的潜伏期较短（1～3天），且血清学阳性转阴性需要时间，而婴幼儿可因免疫反应较弱可出现假阴性；另外，还存在IgM检测试剂低敏感性及免疫功能不全者缺乏抗体应答等因素。因此，血清抗体检测对儿童呼吸道病毒早期诊断的价值受一定的限制，主要用于流行病学调查。

4.病原学检测

（1）抗原检测：

其基本原理为用某种病毒特异性抗体和样本中的抗原相互结合，快速检测临床标本中的病毒抗原。根据抗体标志物的不同，有直接或间接免疫荧光法、放射免疫法、酶联免疫法、胶体金免疫分析、免疫层析法等。直接免疫荧光法是通过荧光素直接标记特异性抗体来检测相应的病原体，不同的病毒检测需要制备相应的荧光抗体，较间接免疫荧光法的成本高，但减少了二抗可能导致的非特异性反应，从而提高了特异性。目前国内常用的直接免疫荧光法检测试剂盒可以检测呼吸道合胞病毒，腺病毒，流感病毒A、B，副流感病毒1、2、3，共7项病毒。临床采集的鼻咽拭子和气管吸取物、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）或痰液均可用免疫荧光法检测呼吸道病毒抗原，而咽拭子获取的细胞数较少，不适用于免疫荧光法检测。胶体金免疫分析和免疫层析法检测呼吸道病毒抗原操作简单、快速，不需要特殊设备，可实现床旁检测。

（2）核酸检测：

随着分子生物学技术的不断改进，病毒核酸检测方法迅猛发展，由于其快速、简便、高通量、高敏感度及高特异度的优势，成为诊断呼吸道病毒感染的主要方法。从呼吸道标本中提取病毒核酸，利用病毒基因特异的寡核苷酸作为引物，加入热稳定的核酸聚合酶，在合适温度下对病毒的特异基因片段进行重复扩增，采用多种不同的方法检测病毒特异性的扩增产物。临床采集到的鼻咽拭子、气道吸取物、BALF或痰液均可用于检测。最常用的核酸检测方法是聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），包括单目标终点法、巢式PCR、实时PCR和定量PCR等，其中定量PCR不仅能检测样本中的特定DNA或RNA，而且还能量化，可以反映呼吸道病毒的复制水平，进行动态监测有助于疗效判断。多重PCR法的出现提高了诊断效率，该方法不易交叉污染，试验操作简便，容易标准化。已有多种商品化试剂盒，可同时快速检测临床标本中多种常见的呼吸道病毒核酸。环介导等温扩增检测（loop mediated isothermal amplification，LAMP）是一种全新的核酸扩增方法，在灵敏度、特异度和检测范围等指标上能媲美PCR技术，可以不依赖专门的仪器设备实现现场快速检测，检测成本亦低于荧光定量PCR。其他核酸检测方法还包括依赖核酸序列扩增法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、基因芯片技术（gene chip technique）等。

目前核酸检测技术已可实现床旁检测，1小时左右可获得多种常见呼吸道病毒的核酸检测结果，为临床呼吸道病毒感染的诊治提供快速诊断。

相对于常规核酸检测，Sanger测序技术、焦磷酸测序技术和二代测序技术等可得到病原体的基因序列，最快可在5～6小时获得病毒的整个基因组序列，从而为病毒感染的诊断提供更多的信息。二代测序技术不但在高通量方面表现出优势，而且在发现新病原方面也有突破性进展，但目前二代测序的结果还需要验证，不能直接用于临床诊断，且费用较高，要广泛应用尚待时日。

虽然核酸检测技术特异性强、敏感、快速，可用于早期诊断，但由于潜在的残留和交叉污染，存在核酸检测假阳性的可能，且部分病毒核酸检测阳性（如鼻病毒、肠道病毒和冠状病毒等）不能确定是否为现症感染，要结合流行病学、临床特征及血清抗体检测等综合判断。

（3）病毒直接检测/培养：

通过电子显微镜可直接观察到呼吸道标本中病毒的典型特征形态，但要求标本中有大量病毒（108～109/L）才能检测到，并且需要有经验的技术人员和昂贵的电子显微镜设备，操作复杂，技术要求高，不适宜用于呼吸道病毒感染的临床诊断。

呼吸道病毒分离培养是病毒检测的“金标准”，经典病毒分离培养方法有动物培养、鸡胚培养和组织细胞培养。但培养周期较长，检测环节较多，操作不易标准化，对人员技术要求较高，不适合用于临床诊断。