第二节　血管新生的调控机制

血管为身体各个器官、组织输送氧气和营养物质，同时也与癌症、心血管疾病等多种疾病息息相关。在过去的10年中，人们对血管新生分子调控机制的认识快速增长，将抗血管生成的药物用于治疗癌症、眼底疾病等。迄今为止，已有成千上万的患者受益于血管生成蛋白-血管内皮生长因子的阻滞剂，但其有效性和抗药性仍是突出的问题。目前的临床研究已经找出了新的治疗靶点和策略，为进一步提高抗血管生成治疗的临床效果奠定了基础。

血管的形成，能够给周围组织提供氧气和营养物质、带走废物，也可通过循环中的免疫细胞对机体进行免疫监视，还能诱导一些促使器官形成的信号因子分泌。虽然血管新生对组织修复和再生有益，但异常的血管生长会导致许多疾病。过度的血管新生会引发炎症，而某些新生的血管也能成为肿瘤细胞扩散的途径。例如，不充分的血管生长会导致卒中、心肌梗死、溃疡性疾病和神经退化，而异常血管生长或重塑可导致癌症、炎性疾病、肺动脉高压和盲眼病等。

一、血管在分支产生、成熟和静止期的调控

在健康的成年人身上，静止的内皮细胞通过自分泌的方式产生VEGF、Notch、血管生成素1（angiopoietin-1，Ang-1）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）等信号因子，来维持自身较长的寿命和抵抗有害刺激。血管为组织供应氧气，内皮细胞能感受氧气并在低氧诱导因子如脯氨酰羟化酶2（prolyl hydroxylase domain 2，PHD2）、低氧诱导因子2α（hypoxia-inducible factor-2α，HIF-2α）作用下，通过调整自己的形状来改善血液的流动。静止期内皮细胞排列形成一层具有流线型表面的单层方阵，细胞之间通过连接的分子（如钙粘连蛋白和闭合蛋白）相互连接。这些内皮细胞外表面被周细胞包裹，周细胞可以抑制内皮细胞的增殖并释放维持细胞生存的信号，如VEGF、Ang-1等。内皮细胞和周细胞在静止时共同形成血管基膜。

在缺氧、炎症或肿瘤细胞的作用下，处于静止期的血管感受到周围组织释放入血管的信号因子，如VEGF、Ang-2、FGF或一些趋化因子等，周细胞脱离周围的血管壁并从基膜中分离出来，这个过程是通过MMPs水解基膜蛋白完成的。随后，内皮细胞之间的连接变疏松，新生血管开始扩张。VEGF增加内皮细胞的通透性，导致血浆蛋白渗出，形成一个临时的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）支架。整合素刺激能使内皮细胞迁移到ECM表面。在蛋白酶的作用下，ECM中的促血管生成因子开始释放，并重塑ECM使其成为适应血管新生的微环境。内皮细胞为了能够形成管状结构并且避免大量的内皮细胞向血管新生的信号分子趋化，由一个内皮细胞（也被称为端内皮细胞）形成新生血管的顶端，同时表达VEGF受体、神经毡蛋白（neuropilin，NRP）和Notch配体、DLL4和JAGGED1等因子。在Notch、Notch调控的锚蛋白重复蛋白（Notch-regulated ankyrin repeat protein，NRARP）、WNT、胎盘生长因子（placental growth factor，PlGF）和FGF的刺激下，与端内皮细胞相邻的内皮细胞随之拉长膨出形成茎内皮细胞；并在VE-cadherin、CD34、唾液黏蛋白（sialomucins）、VEGF等因子作用下，这些内皮细胞（茎内皮细胞）建立新的管腔。

端内皮细胞有丝状伪足，可以感知受体酪氨酸激酶配体和信号素等信号分子；而茎内皮细胞则通过释放EGFL7分子进入ECM来传递关于其邻近位置的空间信息，从而使血管新膨出的茎得到延伸。同时，由HIF-1α驱动的低氧诱导程序开始启动，使内皮细胞对血管生成信号产生反应。髓样细胞协助新生的血管与另一血管融合，使得血流能够通过。内皮细胞恢复成为静止期的方阵状态。同时，在血小板衍生生长因子B（PDGF-B）、Ang-1，TGF-β、肝配蛋白B2和Notch等信号因子的作用下，周细胞可覆盖新生血管的内皮细胞。新生血管的蛋白酶被金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）和纤溶酶原激活物抑制因子1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）所抑制，使血管基膜得以沉积，导致细胞连接重新建立，以确保最优的血流动力分配。

二、调控血管新生的信号因子

（一）VEGF家族

VEGF是一个家族，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和PIGF。通常VEGF-A和PIGF可促进新生血管形成和增加血管通透性，VEGF-B在非新生血管形成的肿瘤中起作用，VEGF-C和VEGF-D在癌组织的新生血管和新生淋巴管的形成过程中发挥作用，VEGF-E也是一种潜在的调控新生血管形成因子。与血管内皮生长因子进行特异性结合的高亲和力受体称为血管内皮生长因子受体（VEGFR），主要分为3类VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3。VEGFR-1主要在造血干细胞、单核细胞和血管内皮细胞表达，VEGFR-2在血管内皮细胞和淋巴内皮细胞表达。在肿瘤形成中，VEGFR-1和VEGFR-2可调节肿瘤血管的新生；VEGFR-3调节肿瘤淋巴管的生成。

VEGF作为一个主要调控血管生成的生长因子，在血管新生的过程中扮演重要的角色。在血管新生中，VEGF-A是首要的因子，它通过VEGFR-2（也称FLK-1）来调节血管的新生。此外，神经毡蛋白（NRP1和NRP2）也是VEGF的受体。不论VEGF-A还是其受体VEGFR-2缺乏都会导致血管发育不良。端内皮细胞DLL4的表达上调可激活茎内皮细胞的Notch信号通路，引起茎内皮细胞VEGFR-2的表达下降，使得茎内皮细胞对VEGF敏感性相比端内皮细胞较差，从而保证了端内皮细胞的生长处于领先地位，以及对血管新生的调控。此外，可溶性VEGF异构体促进血管扩张，而与基质结合的VEGF异构体促使血管出现分支。肿瘤细胞、髓样细胞和其他间充质细胞通过旁分泌的方式释放VEGF，能诱导血管产生分支并且导致异常的肿瘤血管形成；而由内皮细胞通过自分泌方式产生的VEGF可以维持血管内环境的稳定。研究表明，VEGFR-2信号的生物学效应取决于其在亚细胞的定位。例如，激活VEGFR-2，诱导动脉形态发生的VEGF必须来自内皮细胞。VEGFR-2突变会导致血管肿瘤，VEGF和其受体的遗传多样性共同决定病理性的血管新生。此外，VEGF信号的阻断可以抑制恶性肿瘤和眼病中的血管新生，达到治疗的效果。VEGF蛋白或基因也与血管功能异常和渗血相关。

VEGF-C作为VEGFR-2和VEGFR-3受体的配体，可以通过作用于受体来激活端内皮细胞。VEGFR-3是早期胚胎形成时血管生成的必要因子，但后来成为淋巴管生成的重要调控因子，可以使已存在的淋巴管中形成新的淋巴管。斑马鱼体内的第一个产生的胚胎静脉是由共同的前体血管分离出的内皮细胞产生的，激活VEGFR-2可抑制静脉内皮细胞的萌发，而激活VEGFR-3的作用则相反。在动脉干上产生的静脉衍生血管也依赖于VEGFR-3信号。抗VEGFR-3的抗体可以协同抑制受体二聚体化或阻断配体与受体的结合，从而减缓肿瘤生长。VEGFR能够拮抗VEGFR-2作用，因此VEGFR-3可作为新的抗血管新生的药物靶点。

PIGF最初被认为是一种与VEGF的作用相同的血管生长因子。然而，PIGF只在特定疾病中与血管新生相关。PIGF作为一种多效应的细胞因子能直接或间接地刺激血管生成。同时，PIGF激活骨-骨髓来源的内皮祖细胞、骨髓细胞及基质细胞，为肿瘤细胞创造生长的微环境。抑制PIGF将影响肿瘤相关巨噬细胞的极化，从而改善血管的灌注和成熟，并且增强了血管对化疗的敏感性。但也有研究发现阻断PIGF不能抑制移植瘤模型中肿瘤的生长。因此，PIGF阻断对癌症患者的潜在疗效仍有待进一步研究。

VEGF家族成员VEGF-B缺陷不影响小鼠正常发育中的血管新生，但是再出生后会表现VEGF水平下降。VEGF-B只在某些特定组织（如心脏）中抑制血管新生活动，但它促进神经元的存活并对新陈代谢有影响。VEGF-B对病理性血管生成的不同影响已得到证实，它可以促进心脏血管的生长且不会引起如渗透率增加、血液渗漏等不良反应。

VEGFR-1（FLT-1）在血管生成中的确切作用仍未阐明。它可在细胞膜上作为锚定信号的受体，又可作为一种可溶性分泌蛋白（也称sFLT-1）。sFLT-1可以与它的配体结合，能协助血管分支形成或抑制血管出芽。由于其酪氨酸激酶活性较弱，VEGF与VEGFR-1结合后会降低激活VEGFR-2所需的游离VEGF的数量，VEGFR-1通过这种竞争结合的方式抑制了VEGFR-2的活性。然而，在血管新生的内皮、基质和髓样细胞胞内激动VEGFR-1，产生的信号可以刺激血管病理性新生。VEGFR-1信号也促进高表达VEGFR-1的肿瘤细胞生长，这些肿瘤细胞通过不依赖血管新生的方式自分泌VEGF，并在转移前的内皮细胞中上调MMP9。

（二）PDGF家族

血管的正常功能取决于血管的成熟。一些生长因子家族成员，如PDGF、血管生成素和TGF-β能促进这一过程。为了稳定内皮细胞通道，血管内皮细胞释放PDGF-B与表达PDGF受体-β（PDGF receptor-β，PDGFR-β）的周细胞结合。因此，敲除PDGF-B基因后引起周细胞缺陷会导致血管渗漏、扭曲、微瘤形成和出血。敲除小鼠体内编码PDGF-B蛋白滞留基序（周细胞黏附的必需基因）会导致肿瘤血管脆弱和过度扩张，而带有PDGFR-β亚效等位基因的小鼠大脑血管周细胞不足，因此会产生血-脑屏障缺陷以及有毒物质泄漏所导致的神经退行性损伤。肿瘤来源的PDGF-B可通过上调间充质细胞来源因子1α（SDF-1α）间接增加周细胞的生成。此外，血管周围的PDGFR-β阳性的前体周细胞产生促进周细胞形成。VEGF通过抑制血管壁细胞中PDGFR-β信号，从而减少了周细胞的覆盖，使肿瘤血管发生异常。

抑制PDGFR能引起周细胞解离从而减缓肿瘤生长，也导致相应位置的血管难以成熟且易于退化。缺乏蛋白多糖NG2的周细胞缺陷小鼠也会形成异常的肿瘤血管和较小的肿瘤。然而，PDGF-B在小鼠体内的过表达能通过促进周细胞的募集和诱导内皮细胞生长抑制肿瘤生长。由于内皮细胞的生存依赖于周细胞产生VEGF，所以周细胞可以保护内皮细胞不受VEGF降低的影响，并对抗VEGF抑制剂的作用。阻断PDGF-B减少周细胞，可使成熟的血管对VEGF阻滞剂更敏感。但联合使用多种抑制剂的疗法并不优于单独抗VEGF的疗法。此外，PDGFR-β阳性周细胞在肿瘤转移中也具有双重作用。在原发性肿瘤中，周细胞可以限制肿瘤细胞进入血管内渗，由于周细胞减少，松散的血管壁不再是肿瘤细胞扩散的屏障。临床上血管周围的周细胞缺失也与患者肿瘤的转移相关。因此，阻碍血管的成熟可以促进恶性肿瘤的发生。

PDGF-B阻断可用于治疗其他非肿瘤性的血管疾病，如肺动脉高压。而对PDGF-B的激活可能成为治疗血管畸形的一种方法。PDGF-CC是另一个生长因子家族成员，它由成纤维细胞释放而来，能刺激血管生长和成熟，并减弱抗VEGF治疗的反应。PDGF-CC通过阻止血管周围PDGFR-α阳性星形胶质细胞的激活，使得胶质细胞与周细胞共同构成血-脑屏障，并在卒中中保持了血-脑屏障的完整性。PDGF-DD抑制了眼球新生血管的形成，而PDGF-DD的过度表达则使肿瘤血管正常化，并改善了药物的传递。

（三）TGF-β信号

人类遗传性出血性毛细血管扩张症的特点是血管畸形，是由编码内聚糖（ENG）或激活素受体激酶（ALK1）的基因突变引起的，它们都属于TGF-β家族中的受体。动物实验证实，TGF-β受体ALK-1、TGFR-1、TGFR-2或ENG的缺失导致动静脉畸形，这些异常类似于遗传性出血性毛细血管扩张症患者。然而，目前对于TGF-β信号通路的研究结果尚未统一，这可能源于TGF家族成员具有促进血管生成和抗血管生成的双重作用。此外，虽然TGF-β促进血管平滑肌细胞分化，但ENG或ALK-1的缺乏最终损害血管壁中细胞的发展，目前尚不清楚其他TGF-β组成分子是否也通过内皮细胞或血管平滑肌细胞调节它们在体内对血管的影响。临床前研究表明，ENG或ALK-1的抗体可以抑制肿瘤血管生成和生长。

（四）FGF超家族

FGF超家族及其受体具有广泛的生物学功能。bFGF是最早发现的血管生成因子之一，具有促血管新生和动脉新生的功能，FGF9刺激骨修复中的血管新生。FGF激活受体（FGFR）后通过诱导其他细胞释放血管生成因子，作用于内皮细胞上或间接刺激血管生成。例如，在心脏中，FGF介导的信号通过刺激hedgehog、Ang-2和VEGF-B的释放以刺激血管的生长。由于抑制FGFR信号在静止的内皮细胞中会导致低水平的血管分裂，低水平的FGF可维持血管的完整性，而在静止期的内皮细胞上抑制FGF受体信号能引起血管的不完整。异常FGF信号促进肿瘤血管生成，并促进肿瘤血管抵抗VEGF或表皮生长因子受体抑制剂的治疗。目前，血管再生的特异性FGF或FGFR抑制剂发展受阻，部分原因在于小鼠FGF-1或FGF-2缺失并不能产生血管缺陷，并且FGF超家族也过于庞大。

（五）Ang和TIE信号转导

健康血管具备维持自身功能机制，同时还能对促血管生成的刺激作出反应，Ang和TIE家族在其中具有重要影响。人类Ang家族蛋白包括两个受体，TIE-1和TIE-2，以及3个配体，即Ang-1、Ang-2和Ang-4。Ang-1作为TIE-2的激动剂发挥作用，而Ang-2以环境依赖的方式作为一个竞争性的Ang-1拮抗剂发挥作用。而TIE-1作为孤核受体可能是TIE-2的负调节因子，但其确切作用仍不清楚。Ang-1可在血管壁中的细胞和肿瘤细胞中表达，而Ang-2则由血管生成的端内皮细胞释放。在融合的内皮细胞中，Ang-1通过诱导细胞连接中的TIE-2信号，以维持内皮细胞的静止状态。Ang-1也可以刺激血管壁生成和基膜的沉积，从而促进血管的紧密性。在血管生成刺激因子的作用下，血管内皮细胞释放出Ang-2可以拮抗Ang-1和TIE-2信号，以增强壁细胞分离、血管的渗透性和内皮细胞的生长。小鼠中TIE-2的缺陷可以引起血管缺陷；而人类的生殖细胞和体细胞TIE-2突变可导致静脉畸形。肿瘤细胞源性的Ang-2也能促进血管生成，其促进血管生成的作用是通过招募表达TIE-2的单核细胞（TIE-2-expressing monocyte，TEM）实现的。

Ang-TIE信号转导对肿瘤的整体影响是环境依赖的。Ang-1通过促进内皮细胞的存活和血管的成熟来刺激肿瘤生长，但也抑制肿瘤细胞转移并且维持肿瘤外健康血管的完整性。相反，Ang-2能刺激肿瘤血管新生，招募促血管新生的TEM，且Ang-2的抑制能促进血管的恢复和正常化。鉴于Ang-2和VEGF协同增加血管生成，VEGF和Ang的联合阻断在抑制肿瘤血管生成、转移和渗漏方面具有优势。

（六）Notch和WNT信号通路

一般来说，血管分支模型要求端内皮细胞迁移和茎内皮细胞增殖，最近的研究表明Notch信号参与该过程中。已知VEGFR-2的活化上调端内皮细胞中DLL4的表达。在邻近的茎内皮细胞中，DLL4激活可以下调VEGFR-2，但上调VEGFR-1激活的Notch信号，因此，茎内皮细胞对VEGF信号的促萌芽活性的响应较弱，但对PIGF等分子敏感。总的来说，DLL4和Notch信号限制了血管产生分支，但有助于形成灌注血管。内皮细胞中的DLL4通过上调血管壁中Notch阳性细胞的PDGFR-β信号，可刺激血管成熟。JAGGED1是另一种由茎内皮细胞表达的Notch配体，通过干扰茎内皮细胞到端内皮细胞的相互作用来促进细胞的选择。茎内皮细胞中的Notch信号是处于动态平衡的，源于它上调了自身的抑制剂NRARP，形成负反馈的调节。

内皮细胞通过精确调控VEGFR-1和VEGFR-2的表达，持续竞争着端内皮细胞的位置。抑制DLL4和Notch的信号诱导了更多的低灌注血管的形成，导致肿瘤缺氧和生长抑制。然而，健康动物的DLL4下调会导致血管新生物的产生，并且使内皮细胞上Notch下游的转录因子RBP-J失活，最终使血管新生失控。这些数据表明，静止期的内皮细胞需要低水平的Notch信号，但使用DLL4和Notch抑制剂来治疗癌症还需要进一步探讨。Hedgehog家族成员的信号通过调节Notch的表达，也参与了胚胎血管生成、血管形态形成以及动脉的分化。

内皮细胞表达不同类型的WNT配体和它们的卷曲（frizzled，FZD）受体，其中一些可刺激内皮细胞增殖。在血管分支过程中，Notch在茎内皮细胞增殖中激活WNT信号，促进茎内皮细胞增殖中发挥作用。WNT也会在反馈系统中激活Notch，因为在内皮细胞中WNT信号会诱发一种类似于Notch的表型，其特征是血管分支缺陷、静脉特性的丧失和异常的血管重建。在小鼠中部分WNT和FZD成员（Wnt2、Wnt5a、Fzd4和Fzd5）基因的失活引起血管缺陷，而Wnt7a和Wnt7b的联合缺失则损害了脑血管生成和血-脑屏障的形成。因为一些WNT成员抑制血管生成，因此需要这些蛋白质的特异性阻滞剂。