第五节　呼吸道疾病病毒病原学诊断

一、概述

病毒感染的诊断方法有多种，包括病毒分离（动物实验、鸡胚培养和细胞培养等）、病毒血清学诊断方法、免疫学方法检测病毒抗体/抗原、分子生物学技术和电子显微镜技术等，所有这些方法均可用来进行呼吸道病毒感染的诊断。具体选择何种方法应根据患儿的病程、所采集的样本类型来确定。

二、诊断方法的选择

1.病毒分离

动物接种曾是唯一一种病毒病的诊断方法和发现新病毒的实验技术。细胞培养技术的发展使病毒分离技术有了巨大的进步。近年来，随着一些新的快速诊断方法的建立，而且一些新发现的病毒极难分离培养，病毒分离因耗时费力，已逐渐少用，但分离到病毒株，对其致病机制的研究和诊治策略的制定均有重要价值。

2.病毒血清学方法

病毒血清学方法一般指中和试验、补体结合试验和红细胞凝集试验等，可同时用于病毒和病毒抗体的检测、分离病毒的鉴定等，中和试验仍是目前病毒分离鉴定的重要方法之一。

3.病毒免疫学诊断方法

免疫学技术的发展使病毒的免疫学诊断方法发展迅速。目前应用较广的有免疫荧光技术、酶联免疫吸附技术（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、化学发光法（chemiLuminescence，CL）和免疫层析法等。ELISA和CL因其操作简单、快速、敏感、特异性强且无放射性污染，对设备要求不高，被广泛应用于病毒感染的诊断。免疫荧光法和胶体金免疫层析法，是常用的呼吸道病毒感染快速诊断方法。

4.分子生物学方法

在病毒病诊断中应用较广的分子生物学方法主要有核酸杂交和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。PCR方法有很高的特异性，可以检测到1个拷贝的病毒核酸，与核酸杂交结合使用可以极大地提高检测的敏感性和特异性。目前临床实践中已较广泛的应用分子生物学方法检测病毒核酸，是病毒感染诊断的主要方法。

三、标本的采集和处理

1.血标本

血标本可以分离血清/血浆用于检测病毒核酸、病毒抗原和特异性抗体。用于病毒特异性IgM抗体检测，可采集单份急性期血清；特异性IgG抗体检测应采集急性期和恢复期双份血清，急性期标本采集越早越好，恢复期标本应在发病后2周或更迟一些。

2.鼻咽吸取物

用于病毒的分离、抗原和核酸检测。婴幼儿适于采集鼻咽吸取物。通过商品化的黏液抽吸器（如Pennine 6型黏液抽吸器）从双侧鼻孔中抽吸获得，导管在鼻尖到外耳道中间的位置连接，不停地转动导管，采用负压100mmHg持续15秒的间歇性抽吸后慢慢退出。另一鼻孔重复上述操作。粘在导管腔内的分泌物用无菌采集容器收集，另一管通过1ml VTM冲洗转移到黏液收集管中。

3.鼻咽拭子

用于病毒的分离、抗原和核酸检测。用干鼻咽拭子准确地擦拭患者的鼻咽部，立即浸入含2～3ml病毒培养液的灭菌试管中。

4.肺组织活检和尸检标本

用于病毒分离或直接检出。用带盖无菌玻璃瓶留取，用于电镜切片用的标本应切成1mm的小块，直接浸于2%戊二醛固定液中。尸检标本应尽早采集，最迟不超过死后24小时，用于病毒分离时应在死后3～6小时采集。

四、病毒的分离鉴定

1.标本

呼吸道感染的病毒分离主要采集鼻咽分泌物、鼻咽拭子、肺泡灌洗液和肺组织标本。

2.动物实验

较少用于呼吸道病毒的分离等。

3.鸡胚培养

是较早用于病毒分离培养的技术之一。细胞培养技术的发展，大大代替了鸡胚培养，但鸡胚培养在黏液病毒和痘类病毒等研究中仍起重要作用。

4.组织培养

包括组织块培养和细胞培养，目前一般指细胞培养。用于病毒分离的主要是单层细胞培养，是病毒分离的重要技术（图2-5-1）。

（1）细胞培养的分类：

根据细胞来源和染色体特性可分为下列四类。

1）原代细胞培养：

由新鲜组织制备的单层细胞，分离病毒最为敏感，但制作和保存不便，一般只能传2～3代。

2）传代细胞系：

由原代细胞连续传代或由肿瘤细胞培养而来，可以无限传代，应用保存方便。应用于呼吸道病毒分离的传代细胞系主要有Hep-2（人喉上皮癌细胞）、Vero（传代非洲绿猴肾细胞）等。

3）二倍体细胞株：

细胞在传代中保持二倍体特性，染色体总数为46条，属正常细胞，一般只能传40～50代。如人胚肺细胞，对呼吸道病毒较为敏感。

图2-5-1　呼吸道感染标本中病毒分离鉴定流式图

（摘自：闻玉梅.现代医学微生物学.上海：上海医科大学出版社，1999.）

4）病毒基因转染细胞系：

由传代细胞系经病毒基因转染后建立的带有某种病毒全部或部分基因组的细胞系。

（2）组织培养的基本条件

1）培养基：

现在普遍应用人工合成培养基，如DMEM、RPMI1640等。培养基主要含各种氨基酸、葡萄糖、维生素、无机盐和其他成分。培养基的选择应根据细胞的特性而定，原代细胞和上皮样传代细胞多选用Eagles培养基，而成纤维细胞用RPMI1640。

2）血清：

常用的是胎牛血清和小牛血清。病毒分离的血清需56℃ 30分钟灭活，以除去对病毒的干扰。一般生长液加10%～20%的血清，而维持液加2%～5%的血清。

3）酸碱度：

细胞生长的最适pH为7.0～7.4，最大耐受范围为pH 6.6～7.8。在适当pH范围，偏酸的环境易于细胞贴壁。

4）温度：

一般37～38℃作为细胞培养的生长温度，32～35℃为维持温度。细胞对高温的耐受较差，超出生长最适温度2～3℃，细胞在24小时内即死亡，而低温对细胞的影响较小，25～35℃均可作为细胞的维持温度。

5）其他条件：

细胞培养用水的纯度越高越好，最低是双蒸水，最好的是蒸馏水再经交换树脂处理，电阻率≥10MΩ·cm。培养条件要求绝对无菌。培养器皿常用玻璃和塑料制品，要求对细胞无毒性，所用橡皮需经酸、碱处理。

（3）培养方法：

细胞培养的方法有静置培养、悬浮培养、旋转培养、混合培养等，在原代和传代细胞培养中常用静置培养，但旋转培养可以增加病毒分离的敏感性，如呼吸道合胞病毒培养。

1）传代细胞培养

a.将生长较密的单层细胞经0.25%的胰酶或0.1%的EDTA消化。一般室温10～30分钟可见细胞固缩，细胞间出现间隙。

b.弃消化液，加少量生长液，用吸管吹打细胞，使之脱落、形成单个细胞。

c.按原体积2～4倍的比例稀释后分瓶培养，视细胞生长速度，一般3～5天形成单层细胞。

2）细胞的冻存：

先将细胞按传代细胞程序消化、分散，800～1 000r/min离心 5～10分钟，每瓶细胞用含10%二甲基亚砜的生长液稀释至0.5～1.0ml，分装细胞冻存管，于 -60℃冻存 1～2 小时，置液氮中保存、登记。

3）冻存细胞的复苏：

从液氮中取出细胞管置40℃温水中，并不断搅拌使其快速解冻，800～1 000r/min离心5～10分钟后弃冻存液，用生长液按原冻存量或1倍稀释，分瓶培养。

（4）病毒的接种及鉴定

1）病毒的接种：

首先选择生长良好的单层敏感细胞，弃培养液，用Hanks液或生理盐水洗涤后，接种原培养液1/10的接种物，摇匀后置37℃吸附30～90分钟，然后弃接种液，加新鲜维持液，于33～35℃培养。

2）观察细胞病变：

大多数病毒增殖均会引起细胞病变（图2-5-2、图2-5-3），称为致细胞病变作用（CPE）。腺病毒引起细胞聚合，副黏病毒等引起细胞融合，鼻病毒致细胞固缩，正黏病毒等引起细胞轻微病变。

图2-5-2　呼吸道和胞病毒引起的细胞融合病变

图2-5-3　麻疹病毒引起的细胞融合病变

3）病毒的鉴定：

①核酸扩增：应用特异性引物扩增获得序列，根据基因序列比对确定病毒，主要用于型或亚型的鉴定。②中和试验：是鉴定病毒最可靠的方法之一，需要用已知的特异性免疫血清，而且需配合观察CPE或细胞吸附试验。方法是先滴定免疫血清和病毒的滴度，一般病毒用100～1 000ID50量。将病毒与血清混匀，37℃作用1小时后接种细胞单层，培养、观察结果。③荧光染色：该方法能在出现CPE前检出病毒和不产生CPE的病毒。方法是将接种病毒的细胞消化、涂片、晾干后丙酮固定，用荧光素标记的特异性多克隆抗体或单克隆抗体染色，如有病毒生长，在荧光显微镜下可见病毒生长部位显荧光。④其他：电镜观察、补体结合试验，红细胞吸附试验等，应用较少。

五、病毒的血清学诊断

血清学诊断方法是诊断病毒感染和鉴定病毒的重要手段。经典的血清学诊断技术包括中和试验、补体结合试验、红细胞凝集试验和红细胞凝集抑制试验、红细胞吸附试验等。近几年发展的免疫荧光技术、ELISA 和CL等也属血清学范畴，但一般称为现代免疫学技术。

血清学抗体检测包括特异性IgG和IgM检测。血清抗体检测在呼吸道病毒感染方面主要用于回顾性诊断，当病人恢复期血清较急性期血清特异性抗体滴度有4倍或4倍以上升高时具有诊断价值，测定单份血清中的特异性IgM抗体检测在呼吸道病毒感染的诊断中价值不大。

1.中和试验

（1）原理：

中和试验是病毒型特异性反应，其原理是特异性的中和抗体与相应的病毒结合后，使病毒不能吸附于敏感细胞，失去感染的能力。用中和试验测定的体液抗体水平在一定程度上反映出机体抗病毒感染的能力。但中和试验操作较复杂。

（2）用途：

①鉴定病毒；②分析病毒抗原的性质；③测定免疫血清的抗体效价和疫苗接种后的效果；④测定患者血清中的抗体，用于诊断病毒。

2.补体结合试验

（1）原理：

补体结合试验是属（或组、族）特异性反应，其原理是特异性病毒抗原和相应的补体结合形成免疫复合物时能结合补体。因此，加入定量的补体于抗原抗体的反应系统中，补体被结合，不再以游离的形式存在，此时若再加入到另一抗原抗体的反应系统中（羊红细胞和溶血素），则后者因缺乏游离的补体参与溶血反应，结果不溶血，称为阳性反应，反之，称为阴性反应。

（2）用途：

①流行病学调查；②病毒病的诊断；③疫苗使用后人群抗体调查；④鉴定病毒。

3.红细胞凝集和凝集抑制试验

（1）原理：

红细胞凝集和凝集抑制试验也为型特异性反应。其原理是病毒或病毒血凝素能选择性地引起个别种类的哺乳动物的红细胞发生凝集，当加入相应的特异性抗体，这种凝集现象即被抑制。如下所示：

病毒+红细胞→凝集

病毒+抗体+红细胞→凝集抑制（不凝集）

（2）用途：

①鉴定病毒；②诊断病毒病；③病毒分族（组），如根据腺病毒对猴和大白鼠红细胞凝集力的差异可分为5个族；④免疫机体后抗体效价的测定；⑤浓缩病毒；⑥病毒抗原分析；⑦病毒株变异相的测定，如流感病毒“O”相与“D”相的测定。“O”相是对人致病的病毒，对豚鼠红细胞凝集效价高，对鸡红细胞凝集效价低；“D”相是适应鸡胚尿囊中繁殖已发生变异的病毒，对豚鼠和鸡红细胞都有相似效价的凝集力。

六、现代免疫学诊断方法

1.免疫荧光法（IFA）

IFA可分为直接法和间接法。IFA可以检测病毒抗原和抗体。在临床中应用IFA检测鼻咽分泌物中脱落上皮细胞内的病毒抗原，可以在2～3小时内出结果，达到快速诊断的目的。目前市售商业化试剂盒已在临床广泛应用，取得较好的效果。

（1）直接法：

将荧光素标记在病毒特异性IgG抗体上，标记抗体直接与固定在载玻片上的细胞内病毒抗原结合，然后在荧光显微镜下观察结果。直接法简便，特异性高，但敏感性稍低。一种标记的荧光抗体，只能检测一种病毒抗原。

（2）间接法（图2-5-4）：

间接法有两对抗原抗体系统，第一对为病毒抗原与相应的抗体；第二对为抗体及相应的荧光素标记的抗人或动物的抗球蛋白抗体。由于夹层免疫球蛋白分子有多个抗原决定簇，能结合多个荧光素标记的抗体分子，故间接法比直接法敏感5～10倍。间接法的缺点是参与反应的因素多，易出现非特异性荧光，操作和判断结果应注意。

图2-5-4　间接免疫荧光法检测呼吸道分泌物中的RSV抗原

2.酶免疫学方法

该方法的原理是基于抗原抗体反应的高度特异性和酶促反应的敏感性。某些酶标记于抗体或抗原形成的酶标记物，既具有抗体或抗原的免疫反应活性，又保留了酶的酶促反应活性。试验中待测标本中的抗体或抗原与已知的固相抗原或抗体结合，然后与相应的酶标记物结合形成免疫复合物，加入底物后在酶的作用下产生颜色反应，通过肉眼观察或仪器测定酶促反应的强弱即可定性或定量检测待测抗原或抗体。

目前常用的酶免疫方法有免疫酶标试验、酶联免疫吸附试验、免疫印迹和胶体金免疫层析法等。

（1）酶联免疫吸附试验（ELISA）：

ELISA有多种方法，目前应用较广泛的有以下几种：

1）ELISA的种类：

①间接法ELISA：原理类似间接法IFA，用于检测特异性病毒抗体。方法是将纯化的病毒抗原包被在固相载体表面，加入待测血清后，如待测血清中含有相应抗体，与固相载体表面的抗原特异性结合，形成抗原抗体复合物，洗涤后加入酶标记抗人免疫球蛋白，与固相载体表面的抗原抗体复合物特异性结合，洗涤后加入底物显色，测OD值，OD值的大小与待检血清中抗体含量呈正比。②双抗体夹心法：用于检测病毒抗原。将特异性抗体包被在固相载体表面，加入待检标本，待测抗原与固相载体表面的抗体形成抗原抗体复合物，洗涤后加入酶标记的特异性抗体，温育反应使之抗原结合，洗涤后加入底物显色，测OD值，OD值的大小与待检血清中病毒抗原含量呈正比。③双抗原夹心法：将双抗体夹心法ELISA中的包被物和标记物改为病毒抗原，用于检测病毒特异性抗体，称为双抗原夹心法。④捕获法：将抗人IgM（μ链特异性）或抗人IgA抗体吸附于固相表面，捕获待检标本中的IgM或IgA抗体，然后加入已知的特异性抗原进行反应，再加入酶标记的特异性抗体，形成大的免疫复合物，加入底物显色后，测得的OD值的大小与待检血清中特异性IgM或IgA抗体含量呈正比。

2）ELISA的结果判断：

①S/N值法：S为待测定孔的OD值，N为阴性对照平均OD值，以S/N值≥2.1为阳性；1.5＜S/N值＜2.1为可疑；S/N值＜1.5为阴性。可疑标本应重复测定，仍为可疑判为阴性。②临界值法：一般以阴性平均OD值加2～3个标准差为临界值，大于临界值为阳性，反之为阴性。

3）ELISA的影响因素：

ELISA具有特异性强、敏感性高的优点，但也易受pH、温度、反应时间、抗原和酶标记浓度和载体等因素影响。

（2）免疫酶标试验：

其原理同免疫荧光试验，检测步骤也相同，只是由于标记物不同，IFA可以在荧光显微镜下直接观察结果，而免疫酶标需底物显色。免疫酶标试验可分为直接法和间接法，以间接法较为常用。

免疫酶标试验的优点是可以用普通显微镜观察，染色标本能长期保存，是一种较特异、快速和简便的方法。其缺点是易产生非特异性反应。该方法主要用于细胞培养或活检、尸检标本的病毒抗原检测和血清等体液标本中特异性抗体的检测。

（3）免疫印迹技术：

该方法是将蛋白电泳和酶免疫技术结合使用的一种方法，用于病毒抗原和特异性抗体的检测。其原理是将已知抗原经聚丙烯酰胺（或琼脂糖）电泳后，转印于硝酸纤维膜（NC膜）作为固相抗原，再进行类似ELISA的酶免疫反应。该法的特异性优于ELISA法，但由于制备复杂、成本较高，而且操作不如ELISA方便，仅应用于少数病毒（如HIV）感染的确诊和实验室研究。

（4）免疫胶体金标记技术：

该法的原理基于特异性的抗原抗体反应，用胶体金作标记物，可以用肉眼直接观察结果。该法敏感性不如ELISA法，但由于操作简单，不需要特殊设备，正逐渐被人们重视^［1］。

七、分子生物学诊断方法

1.分子杂交技术

杂交是利用放射性核素或非放射性核素标记的已知特异性核酸片段作为探针，检测标本中与探针有互补序列的目的核酸，包括斑点杂交、转印杂交和原位杂交等，但分子杂交技术由于操作繁杂，在呼吸道病毒感染诊断中应用较少。

2.聚合酶链反应（PCR）技术

已广泛应用于呼吸道病毒病的诊断，是目前呼吸道病毒感染诊断的主要方法^［2，3］。

（1）原理：

靶DNA分子变性后解链，两条单链DNA分别经复性与两条引物互补结合，在4种dNTP存在和合适的条件下，由DNA聚合酶催化引物由5′→3′扩增延长，每经过变性、复性和延伸一个循环，模板DNA增加1倍，新合成的DNA链又可作为下一循环的模板，经过30～50个循环，可使原DNA量增加106～109倍。PCR具有特异、敏感等优点，特别适用于难以分离培养和其他方法不易检测的病毒的诊断。

（2）步骤：

PCR的每一循环包括变性、复性和延伸3个步骤。

1）变性：

一般选用95℃左右温度，时间为1分钟。为使模板变性彻底，第一循环变性时间可增加至3～5分钟。

2）复性：

引物在此过程与单链模板DNA互补结合。复性的温度非常重要，过高会降低敏感性，过低会增加非特异性。复性温度取决于引物的G+C含量、浓度和长度。复性温度应低于引物Tm 值 5℃左右，Tm=4（G+C）+2（A+T）。复性时间一般为30～90秒。

3）延伸：

延伸温度一般为72℃，较复性温度高10～15℃。延伸温度不合适会影响扩增产物的特异性和产量。2kb以内的目的产物于72℃延伸1分钟即可，低浓度底物时延伸时间应稍长。

4）循环数：

PCR的循环数应根据最初模板浓度而定，循环数太多会增加非特异性，太少则影响产物量。在初始靶序列为105、104、103和50拷贝时，其循环数可分别为 25～30、30～35、35～40 和40～45。

5）热启动：

热启动可以克服引物模板发生非特异复性引起的非特异延伸和扩增，提高扩增特异性和产量。

（3）常用PCR技术

1）反转录 PCR（reverse transcriptase PCR，RTPCR）：

在PCR前增加了一步从RNA到cDNA的反转录过程。用于RNA病毒的检测。由于呼吸道病毒多为RNA病毒，所以RT-PCR在呼吸道病毒感染的诊断中应用较多。

2）多重PCR：

用于多型别病毒的分型检测或同时检测几种病毒，可以是普通PCR或巢式PCR。试验中同时使用数对不同病毒引物，因此，对引物设计较普通PCR有更高的要求。各对引物的Tm不能相差太大。现在已有商业化的检测呼吸道常见病毒的多重PCR试剂盒，可以同时检测呼吸道合胞病毒、流感/副流感、人腺病毒、人冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒和人偏肺病毒等多种病毒^［4］。多重、自动化和快速是呼吸道病毒检测的趋势。目前已有集核酸提取、扩增和分析为一体的全自动快速核酸检测技术和平台，1小时左右即可检测10余种呼吸道病毒，该类检测技术很快会广泛应用于临床呼吸道病毒感染的诊断^［5］。

3）定量PCR：

定量PCR是在普通定性PCR的过程中，通过加入参照物等方法对PCR产物定量，从而得出初始模板量。由于没有产物分析的电泳步骤，定量PCR比普通PCR减少了产物污染的机会。定量PCR的定量方法有以下几种：①竞争定量PCR：其原理是在普通PCR系统中加入一内参照竞争模板，此模板浓度可以人为控制，其序列与目的片段相同，两者扩增效率相同或近似，扩增后对两种产物定量分析，根据公式即可求出原始模板浓度的［模板含量=（目的产物含量×竞争产物含量）/竞争模板含量］。②荧光递减定量PCR：是以荧光标记分析为基础的定量PCR。当两条互补引物链分别标记上供体和受体荧光团（荧光信号试剂）时，荧光团间的荧光能量转移产生荧光，当碱基互补打破失去能量转移则荧光消失。反应分两步进行：首先在系统中加入一条过量引物和一条限量引物，当不对称PCR进行到对数期后，其中一条靶DNA大大超过另一条链；然后加入和过量DNA链互补的标记探针，与过量引物共同起始半巢式PCR反应；反应中探针双螺旋解链，两条分别标记的荧光供体和受体分离，荧光消失。实际测量系统中的荧光强度，即可计算出产物的含量，荧光强度的减少与扩增呈正比。③荧光实时定量PCR：该方法与荧光递减定量PCR相反，它测定的是荧光强度的增加。该方法是在常规PCR中加入一个特异性寡核苷酸荧光探针，该探针带有一个荧光发光基团和一个荧光淬灭基团。完整的探针在激光激发下，发光基团所产生的荧光被淬灭基团全部吸收，不发出荧光。在PCR过程中，Taq酶在链延伸过程中自身的5′-3′的核酸外切酶活性降解与模板结合的特异性荧光探针，荧光发光基团被从探针上切割下来后与淬灭基团分开，在激光的激发下产生特定波长的荧光，荧光的强度与PCR的产物量呈正比。通过动态测定荧光强度可以得到样品实际PCR扩增曲线，找到其PCR扩增的对数期，通过与标准品的对数期比较，得到样品中特定模板的起始拷贝数。

多重PCR和实时荧光定量PCR联合应用可以充分结合各自的优点，临床应用前景广阔^［6］（图2-5-5）。

图2-5-5　RSV的实时荧光定量PCR检测

4）RNA捕获PCR：

该方法最初应用于HCV-RNA的检测，其原理是合成一段与HCVRNA 3′段互补的寡核苷酸并生物素化，再与亲和素化的磁性颗粒结合，加入裂解液裂解的血清捕获HCV-RNA，再进行反转录PCR。该方法省去了RNA提取，减少了污染机会，提高了反应的特异性。

5）免疫PCR：

是一种用于检测病毒抗原的PCR技术。原理是利用亲和素和生物素的特异性结合特性，以生物素和亲和素分别标记已知的DNA和与待测抗原相应的单克隆抗体，亲和素与生物素的结合使两者形成单抗/DNA嵌合体，再与固相化的待测抗原结合后，用标记引物扩增已知的DNA，通过检测扩增产物达到检测抗原的目的。由于PCR的高度放大作用，可使检测灵敏度达到580个抗原分子，比ELISA灵敏105倍，是目前最敏感的抗原检测方法。

八、电子显微镜技术

在某些病毒感染早期的标本中，可以直接检出病毒颗粒，而且可以从形态学上鉴别病毒的种类，特别是目前尚难分离培养的病毒，用电子显微镜技术可以直接检出，为临床提供可靠的诊断依据。

1.电镜在病毒研究中的主要作用

（1）发现和鉴定新病毒。

（2）研究病毒引起的组织和细胞病理改变，以及病毒在细胞内的繁殖动态和形态发生。

（3）研究病毒的超微结构。

（4）结合临床和生物学研究，确定某些疾病的病毒病因（图 2-5-6，图 2-5-7）。

2.常用电镜技术

（1）超薄切片标本电镜观察。

（2）负染标本电镜观察。

（3）免疫电镜技术。

图2-5-6　流感病毒

图2-5-7　腺病毒

（谢正德　申昆玲）

参考文献

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