第五章　结核病免疫学

【摘要】结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病，其预防、感染、发病及预后等都与机体免疫功能息息相关。深入理解结核感染及发病过程中的免疫学机制，对于结核病的预防、诊断、治疗及新型结核疫苗的研发都具有十分重要的理论和临床意义。结核分枝杆菌诱导的免疫应答机制及参与因素十分复杂，主要涉及固有免疫及适应性免疫应答。

【关键词】固有免疫；适应性免疫；巨噬细胞；T淋巴细胞；细胞因子

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所引起的传染病，是我国第二大传染性疾病。目前唯一用于预防结核病的疫苗——卡介苗，对于成人结核病的预防效果不佳，近一个世纪来无有效的新型结核疫苗；AIDS/HIV、结核并发糖尿病、耐药等因素，使得结核病的防控形势十分严峻。无论是结核疫苗研发，还是对于AIDS/HIV、糖尿病、耐药结核病等控制，都需要对于结核病相关免疫学有更深入的研究。

固有免疫应答是机体对抗结核菌感染的第一道防线，在机体抗结核分枝杆菌感染过程中发挥非常重要的作用。结核菌感染机体后，结核分枝杆菌与固有免疫系统间相互作用，决定了结核分枝杆菌感染的结局及机体的免疫应答发展的方向。

PD-1/PD-L1通路在某些病毒和细菌感染中发挥作用，PD-1/PD-L1/PD-L2通路在肿瘤和某些感染性疾病中发挥免疫抑制作用，而在结核病中的免疫作用尚不明确。孙萌萌等[1]利用PD-L1单抗或与异烟肼共同作用，探究其对于TNF-α抗体诱导的结核复发的抑制作用。通过分析小鼠结核病急性感染期和复发期的荷菌量及病理病变，明确PD-L1抗体的作用。研究发现，结核急性感染经过异烟肼单独治疗及PD-L1单抗协同异烟肼治疗后，均可以明显降低荷菌量和减轻病变，虽然两者组间无显著性差异，但经TNF-α抗体诱导复发之后，可以看到PD-L1单抗联合异烟肼治疗组相比较单用异烟肼治疗组，可以显著降低复发期的荷菌量和病变。这表明PD-1/PD-L1通路在体内可能发挥免疫抑制作用，PD-L1单抗阻断PD-1/PD-L1通路后，可能逆转该通路的免疫抑制作用，从而遏制复发期荷菌量上升而表现出免疫保护作用。

李良等[2]探讨了Notch1信号通路在结核菌脂阿拉伯甘露糖（LAM）诱导的结核免疫逃避中的作用，结果表明，经LAM刺激后的小鼠腹腔巨噬细胞Notch1受体的转录水平与表达水平均升高。IL-1β、IL-12、炎症介质分泌水平显著下降，LAM+Notch通路抑制剂（GSI）干预能减弱IL-1β、IL-12的下降趋势；而IFN-γ分泌水平不受LAM以及GSI干预的影响。这些结果表明，Notch1信号通路在LAM诱导的结核分枝杆菌免疫逃避中有着重要的作用，而基于Notch信号通路的治疗方法可能为潜伏结核感染（LTBI）患者或者难治性结核病患者提供新的治疗思路。

机体感染MTB后，外周血中的中性粒细胞可在1～3小时内迅速迁移至感染部位，吞噬结核分枝杆菌并发生自身活化，还能招募其他免疫细胞迅速向感染部位聚集。虽然中性粒细胞在机体抗结核免疫反应中的作用尚未完全明了，但越来越多的研究证实中性粒细胞及其相关细胞因子在此过程中不可或缺，不仅帮助机体控制结核分枝杆菌，还参与宿主病理损伤过程。结核分枝杆菌入侵后是否会被限制而使机体处于潜伏结核感染状态，取决于入侵的结核分枝杆菌与机体免疫反应之间复杂的相互作用。结核分枝杆菌感染机体后，中性粒细胞数量是否与结核病发病时间及疾病状态有关，目前尚未明确。因此，有必要对包括中性粒细胞在内的抗结核免疫反应中各免疫细胞和细胞因子的功能、变化及相关免疫机制进行深入系统的研究[3]。机体感染MTB后，巨噬细胞作为第一道防线在抗结核感染的过程中起着十分关键的作用，巨噬细胞通过吞噬MTB后，既可激活天然免疫信号通路参与杀伤病原菌，又可通过加工提呈抗原启动获得性免疫。MTB在一定条件下会发生免疫逃逸，避免被杀伤而滞留在巨噬细胞内。巨噬细胞与MTB的相互作用机制十分复杂，直接影响着结核病的发生、发展、预后及转归。近年来，关于结核病免疫治疗的研究有增多的趋势，进一步研究巨噬细胞在抗结核感染中的防御机制及同MTB之间的复杂关系，有助于新型抗结核免疫制剂的研发，为结核病的预防和治疗奠定重要理论基础[4]。

中性粒细胞作为固有免疫系统的重要组成细胞，在宿主抗结核免疫应答过程中是一把双刃剑。机体感染结核分枝杆菌后早期，中性粒细胞向感染部位聚集，进而活化并分泌大量趋化因子，通过多种方式对抗感染：中性粒细胞吞噬结核分枝杆菌后迅速凋亡并被巨噬细胞吞噬，中性粒细胞凋亡有利于机体控制感染，也有利于免疫细胞新陈代谢迅速完成，避免死亡细胞产生的毒性物质对宿主组织的持续损伤；中性粒细胞抗结核分枝杆菌感染的另一个机制是形成中性粒细胞胞外陷阱（NET），NET是区别于坏死和凋亡的另一种中性粒细胞死亡方式，其以死亡中性粒细胞释放的DNA为骨架，同时结合组蛋白、嗜天青颗粒、髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G等，形成网状结构，可捕捉入侵的结核分枝杆菌，限制其扩散和传播，并能增加其中抗菌物质的有效浓度以促进机体杀菌。结核分枝杆菌感染诱导产生的NET还可有效隔绝结核分枝杆菌毒性成分与周围宿主组织直接接触，保护宿主组织不受侵害。此外，中性粒细胞分泌TNF-α、IL-10、IFN-γ等细胞因子参与形成肉芽肿，从而限制结核分枝杆菌的生长和传播；产生功能性细胞因子，调控宿主的抗结核免疫反应。另一方面，中性粒细胞还参与机体的病理损伤过程，甚至促进体内结核分枝杆菌的生长[5]。

成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins，CRISPR-Cas）系统是在结核分枝杆菌中发现的一种新型获得性免疫系统，在调控结核毒力基因表达、基因定向编辑以及基因组进化方面表现出显著作用，结核分枝杆菌的CRISPR-Cas系统属于Ⅲ-A型。Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统作为获得性免疫系统，通过抵御外援干扰入侵使得结核分枝杆菌的生存能力增强。同时，其组成成分CRISPR基因位点以及cas基因在一定程度上有助于结核分枝杆菌的基因网络调控以及调节菌体毒力。虽然结核北京家族株中存在不完整的CRISPR-Cas系统，使人推测CRISPRCas防御系统会随着进化而消亡，但就目前的研究结果来看，这种基因组的进化是增强了CRISPR-Cas系统的作用，对CRISPR-Cas系统的某种基因功能或者基因之间相互作用进行深入研究，可能会找到治疗靶点或者寻找到免疫原性极高的诊断指标[6]。

张娟娟等[7]研究了调控巨噬细胞中miR-20a对结核菌诱导的细胞凋亡以及细菌清除的影响，发现结核菌感染巨噬细胞后，宿主通过下调miR-20a诱发细胞凋亡进而清除结核菌。

王姣等[8]研究了CD277+/-备选抗原递呈细胞（APC）在γδT细胞识别抗原中的限制性递呈作用，结果发现，磷酸化抗原HMBPP或结核特异性多肽E7的体外刺激作用下，结核患者胸腔积液和脐带血中的CD277+/-备选抗原递呈细胞都可引起γδT细胞不同程度的活化增殖，且CD277+细胞的活化作用强于CD277-细胞，提示CD277分子对γδT细胞识别不同抗原有一定限制性递呈作用，但还需进一步研究相关分子机制。毛玲等[9]研究了外周血中CD14+单核-巨噬细胞在γδT细胞识别磷酸化抗原中的作用及其与治疗转归的关系。在结核患者外周血和脐带血中同时与CD277抗体、γδTCR四聚体结合比例最大且结合力最强的细胞是CD14+单核-巨噬细胞，且在抗结核治疗1个月时达到最高峰值，该时段患者病情明显好转。CD14+单核-巨噬细胞是γδT细胞识别磷酸化抗原的主要各类抗原呈递细胞。这为深入探讨γδT细胞限制性识别磷酸化抗原机制及同时参与固有免疫与适应性免疫提供了实验依据。

Toll样受体（TLRs）是固有免疫中一种重要的模式识别受体，是激活固有免疫的一个开关，在识别病原体相关成分的过程中发挥关键作用。TLR1、TLR2、TLR4、TLR9在结核分枝杆菌感染过程中对菌体相关成分进行识别从而促进固有免疫应答，其中TLR1基因的单核苷酸多态性位点rs4833095、rs5743618、rs3923647，TLR2基因的rs57473708、rs3804099位点，以及TLR9基因的rs352139、rs5743836等位点的变异在某些人群中与结核易感性密切相关，而TLR3、TLR6、TLR7、TLR8、TLR10基因多态性与结核易感性存在一定关系。TLRs功能的正常发挥保证了机体对结核分枝杆菌正常免疫反应。TLRs基因的多样性使不同个体应对相同的病原体产生不同的反应，对TLRs单核苷酸多态性位点与结核易感性关系的研究，可以预测某些人群的结核病易感倾向，提供药物新靶点[10]。

刘婷等[11]检测了耐多药肺结核患者外周血中性粒细胞（PMN）表达Toll样受体（TLR）2的水平，发现药物干预前耐药组肺结核（PTB）患者外周血PMN培养上清液中TLR2的平均浓度低于非耐药组PTB患者外周血PMN培养上清液中TLR2的平均浓度；耐药组TLR2水平也低于正常对照组；药物干预前后，耐药组TLR2水平差异无统计学意义，而非耐药组患者外周血PMN上TLR2的水平与干预前相比有降低。因此，TLR2可能在耐多药结核分枝杆菌对宿主产生免疫逃避上发挥了关键作用，但其具体机制仍需进一步研究。

结核性胸膜炎即使经过规范抗结核治疗，仍有20%～50%的结核性胸膜炎发生胸膜增厚，皮质类固醇效果也并不理想。目前有关结核性胸膜炎胸膜增厚粘连的机制尚未明确，一般认为，结核性胸膜炎局部以CD4+T淋巴细胞介导的免疫反应为主，许多研究认为胸膜局部Th1细胞免疫增强可能导致免疫损伤而发生胸膜粘连。刘凌等[12]研究结合内科胸腔镜下具体的胸膜表现，测定了不同胸膜粘连程度的Th1、Th2细胞比例及相关细胞因子的水平，结果发现，结核性胸膜炎胸腔积液中Th1细胞比例及INF-γ、TNF-α含量越高，胸膜的粘连程度越明显，提示过度强烈的Th1型细胞免疫反应能够对胸膜组织造成病理性免疫损伤，与胸膜粘连严重程度相关，为结核性胸膜炎患者的免疫干预治疗提供了思路。

调节性T细胞（Tregs）是一群在体内外可发挥免疫调节作用的细胞亚群，与肿瘤、自身免疫性疾病、慢性感染性疾病的发生发展等都有显著相关。有关Tregs在结核感染中的作用，已有文献报道。何军兰等[13]通过对不同结核感或发病组别进行相关免疫指标对比发现，结核分枝杆菌感染者不同疾病阶段或病理状态下Tregs的比例发生变化，从而为临床结核病情提供判断。

朱春玲等[14]研究了肺结核患者外周血免疫细胞的表达及其临床意义，结果发现，肺结核患者免疫细胞CD4+、CD8+、B细胞和NK细胞数量均显著低于健康对照者，痰菌阳性的肺结核患者免疫细胞CD4+、CD8+、B细胞和NK细胞数量低于痰菌阴性的肺结核患者，老年肺结核患者免疫细胞CD4+、CD8+、B细胞数量低于年轻患者初治肺结核患者。因此，肺结核患者免疫细胞的水平下降，痰菌阳性以及老年肺结核患者降低尤为明显。

杨宜等[15]通过阻断小鼠体内T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim3）/Galectin9通路，研究Tim3/Galectin9通路在结核菌感染中的调控作用。结果发现，小鼠感染后，经Tim3、Galectin9功能性单抗阻断Tim3/Galectin9通路的小鼠肺部肉芽肿病变明显减轻，脾脏和肺脏的荷菌量均较对照组低，CD4+T细胞的IFN-γ表达量相比对照感染对照组显著性增加，提示结核分枝杆菌感染中，通过功能性单抗阻断Tim3/Galectin9通路可缓解结核病理状态，有效提高机体免疫水平，抑制结核的发生发展。

章志华等[16]对比研究结核性胸膜炎患者、非结核性胸膜炎患者血清及胸腔积液中细胞因子INF-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-10的含量，结果发现，结核性胸膜炎患者胸腔积液中细胞因子INF-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-10的含量显著高于非结核性胸膜炎患者，而结核性胸膜炎患者和非结核性胸膜炎患者血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-10的含量无显著差别。张艳丽等[17]利用GM-CSF和IL-6培养促进外周血单核细胞（PBMC）分化成功能性CD33+HLA-DRlowMDSC样细胞，发现CD33+HLA-DRlowMDSC的抑制功能依赖于程序性死亡-1/程序性死亡-1配体-2（PD-1/PD-L2）途径并且需要直接的细胞接触。IFN-γ通过抑制PD-1/PD-L2途径抑制CD33+HLA-DRlowMDSCs的免疫抑制活性，表明IFN-γ与功能性MDSC扩增之间存在负反馈环，提示IFN-γ拮抗MDSCs抑制功能可增强对结核感染的免疫应答。

结核性胸膜炎是肺外结核常见病种，但目前临床上对于其诊断和鉴别诊断还存在很多问题。结核抗体、IFN-γ、IL-6等在临床中的应用都非常广泛；Th17细胞、Treg细胞参与结核性胸膜炎的发病机制，与病程发展和治疗效果判断等都有关。IL-27、IL-31、Ag85A抗体IgG表型、IP-10、MCP-1等都有一定的临床应用价值，可一定程度上辅助诊断。不同标志物的优势还可联合应用，使优势与劣势互补，增强特异度和灵敏度，提高临床应用价值；对sCD163、IL-1β、IL-1、IL-33还需进一步研究，观察其诊断准确率，进一步评价其作为诊断结核性胸膜炎的价值[18]。安晓颖等[19]研究了MTB分泌蛋白抗原85B（Ag85B）-早期分泌靶抗原6（ESAT6）融合蛋白在结核性胸膜炎辅助诊断中的价值。结果发现，结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激外周血和胸腔积液后均明显提高结核特异性IFN-γ的含量，对结核性胸膜炎的辅助诊断有一定价值。蔡孝桢等[20]研究了共刺激分子B7-H4在结核性渗出性胸膜炎患者血清和胸腔积液的表达及其与调节性T细胞的相关性。结果表明，结核性渗出性胸膜炎患者外周血中表达B7-H4的mDC比例显著高于健康对照组，并且结核渗出性胸膜炎患者胸腔积液中的比例则显著高于其外周血（经过治疗后结核渗出性胸膜炎患者外周血B7-H4的mDC比例较治疗前下降明显，但仍高于对照组外周血的比例）。结核性渗出性胸膜炎患者中B7-H4的表达与Treg细胞数量呈正相关，治疗后B7-H4在患者外周血来源的mDC中的表达水平显著降低。因此，B7-H4在结核渗出性胸膜炎患者胸腔积液及外周血中高表达，而且与Treg细胞数量呈正相关，可反映机体受MTB感染后的免疫功能状态，其比例变化亦可影响结核渗出性胸膜炎的发展进程，可能成为结核性胸膜炎诊断的辅助指标。

IL-18最初被称为干扰素诱导因子，是IL-1配体族群中的一个成员，也是调节先天性与获得性免疫应答的一个重要细胞因子。梅亮亮等研究发现[21]，结核性胸膜炎患者的胸腔积液IL-18的平均水平显著高于非结核性胸膜炎患者，且结核性胸膜炎患者胸腔积液中IL-18水平在经抗结核治疗后逐渐下降。IL-18可能与结核性胸膜炎发生及病程相关，可能作为早期诊断炎性胸腔积液及观察治疗效果的免疫指标。

陈思达等[22]研究了IL-37、IFN-γ和IL-10在活动性肺结核患者中的表达水平。结果表明，活动性肺结核患者治疗前血清IL-37、IL-10水平较对照组升高，IFN-γ水平下降；活动性肺结核患者治疗后，IL-37、IL-10水平显著下降，IFN-γ水平显著上升，IL-37与IFN-γ呈负相关。血清IL-37、IFN-γ和IL-10水平呈现与活动性肺结核病情相关的动态变化，IL-37对抗结核免疫的负性调节可能与抑制IFN-γ分泌有关。

IL-7与IL-15是IL-2家族细胞因子，可调控T细胞分化与增殖及并在免疫记忆形成与维持过程中发挥重要作用。与IL-2相比，IL-7和IL-15在维持机体T淋巴细胞抗结核感染中可持续发挥作用，且在结核病发生、发展过程中发生动态变化，提高机体免疫记忆水平，可能在结核病的鉴别诊断及结核预防和治疗性疫苗研发中有一定价值。但正是由于IL-7和IL-15在结核病发生、发展过程中的表达水平变化不一，具体调节机制并未完全清楚。此外，虽然目前IL-7或IL-15作为免疫佐剂在预防性疫苗研发中已有应用，但机体免疫记忆水平的准确评估存在难度，一定程度上影响了其在疫苗上的应用[23]。

刘浩然等[24]分析了肺结核患者（TB）和肺癌患者胸腔积液中巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）、孤核受体α（RORα）和孤核受体γ（RORγ）水平的差异，探讨其在肺结核与肺癌鉴别诊断中的价值。结果表明，肺结核患者胸腔积液中MIF水平高于肺癌患者，检测胸腔积液中MIF水平对肺结核与肺癌的鉴别有一定诊断价值；而胸腔积液中RORα及RORγ水平检测的价值仍有待进一步验证。

结核病是以T细胞免疫为主的细胞免疫，已有较多研究表明维生素D（VD）可以调节结核免疫。VD在肺结核发病及预后过程中均起着重要作用，参与结核患者细胞免疫，但临床研究结果不尽一致，可能由于研究过程中干扰因素较多，且维生素D水平在人体中的动态变化。既往研究对VD水平没有动态监测或者监测窗太长，不能真实反映VD水平，从而对研究结果产生影响；同时，没有一个明确的、公认的标志物能够准确反映VD在肺结核预后中的免疫功能，还需要进一步的研究证实[25]。

杨盛娅等[26]研究了肺结核合并医院感染患者外周血miR-29a-3p水平与巨噬细胞相关因子的相关性。LTBI组患者外周血miR-29a-3p表达量高于TBI患者表达水平；LTBI组患者IL-6及TNF-α水平低于TBI组患者，IL-10水平高于TBI组患者；pearson相关性分析表明，LTBI组与TBI组患者外周血中miR-29a-3p与IL-6及TNF-α均呈负相关，与IL-10呈正相关。因此，miR-29a-3p可能参与巨噬细胞抗结核免疫反应，与结核病发病有一定关系。

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