第二节 苹果酸-乳酸发酵
苹果酸-乳酸发酵对不同类型的果酒的作用是不同的。酸度高且苹果酸含量高的果酒进行苹果酸-乳酸发酵可降低酸度，改善风味；酸度低的果酒进行苹果酸-乳酸发酵会使酒变得过于淡薄，应避免此种情形的发生。酿造果香突出的果酒一般不进行苹果酸-乳酸发酵，以免影响酒的清新感。苹果酸-乳酸发酵将果酒中具有尖酸口味特征的苹果酸降解为酸味温和的乳酸并释放出CO2。
一、苹果酸-乳酸发酵的机理
苹果酸是大多数果酒中的固定酸之一，其生理代谢活跃，极易被乳酸菌分解利用。MLF就是苹果酸-乳酸细菌分解酒中L-苹果酸产生L-乳酸并释放出CO2的过程。通常菌体密度达106CFU/mL时，苹果酸开始被分解，细菌数达107～108CFU/mL时，苹果酸被大量分解。根据对微生物体内酶的认识及酶所催化的反应机制研究，参与MLF过程中苹果酸向乳酸的转变的酶可能有：苹果酸-乳酸酶(MLE)、苹果酸酶(ME)、苹果酸脱氢酶(MDH)、草酰乙酸脱羧酶(OADC)、乳酸脱氢酶(LDH)、烟酰胺核苷酸转氢酶(NNTH)等。
在细胞体内，所有构成代谢的生化反应只有在具有必需的酶类条件下才可能进行。酶的最基本的特性之一，就是对反应底物和所催化的反应种类的特异性。所以，如果知道某一转化的特性，就可能确定这一转化机理，根据对生物(包括微生物、植物和动物)酶的认识，MLF的转化途径曾被认为是按以下2种方式进行的。
途径1：苹果酸→草酰乙酸→丙酮酸→乳酸。在这一反应链中，需要3种酶，即苹果酸脱氢酶(MDH)、草酰乙酸脱羧酶(OADC)和乳酸脱氢酶(LDH)。
途径2：苹果酸→丙酮酸→乳酸。这一途径中需要在多数生物中发现的苹果酸酶的作用，它可将苹果酸直接脱羧转化为丙酮酸；丙酮酸在LDH作用下被还原为乳酸。
已经证明，苹果酸-乳酸菌(MLB)具有2种乳酸脱氢酶：L-乳酸脱氢酶(L-LDH)和D-乳酸脱氢酶(D-LDH)，按以上的转化途径，丙酮酸将生成L-乳酸和D-乳酸2种产物。事实上，MLB在己糖发酵中，D-LDH、L-LDH的确能够将丙酮酸还原，生成D-乳酸、L-乳酸。而MLF过程中L-苹果酸只被转化成L-乳酸，甚至一些没有L-LDH只有D-LDH的突变MLB菌株进行MLF时也只产生L-乳酸。因此。LDH可能与MLF过程中L-苹果酸向L-乳酸的转化无关。这也表明MLF不可能经过丙酮酸途径。目前的观点认为，MLF是L-苹果酸在MLE催化下直接转变成L-乳酸的过程。这一途径可以表示如下：L-苹果酸→L-乳酸＋CO2。
从肠膜明串珠菌中分离纯化MLE，该酶为诱导酶，只有当苹果酸和可发酵糖存在时，细菌才能在胞内合成。MLE为多酶复合体，并与乳酸脱氢酶紧密结合；NAD＋为辅酶，Mn2＋为激活剂。MLE只能将L-苹果酸转变成L-乳酸而不生成D-乳酸。草酸铵盐、1，6-二磷酸果糖、L-乳酸为MLE的非竞争性抑制剂；琥珀酸、柠檬酸和酒石酸为该酶的竞争性抑制剂。
经过MLF，酸味尖刻的二元酸L-苹果酸转变为酸味柔和的一元酸L-乳酸，果酒酸度降低，果酒酸涩、粗糙等特点消失，果香、醇香增加，口感改善，质量提高。另外，苹果酸的生理代谢活跃，易被微生物分解利用，经过MLF还能增加果酒的生物稳定性，并生成双乙酰和乙偶姻而增加果酒的风味复杂性。
二、影响苹果酸-乳酸发酵的因素
MLF对环境条件的要求与乙醇发酵相比要苛刻得多，影响MLF的因素包括乳酸菌的营养条件、酒精浓度、二氧化硫浓度、发酵温度、pH值等，这些因素不同程度地影响MLF的进程。
1．营养条件
MLB比酵母对营养的要求高，要求许多微量元素和生长因子，这就是酵母的降解可以刺激苹果酸乳酸转化的原因。和酵母相比，细菌要求一些氨基酸的出现，即它们不能利用氨合成所有20种氨基酸。不同菌株对氨基酸的要求不同。酵母在发酵的后期释放氨基酸，所以氨基酸的限制不再是一个问题。有观察到在酵母发酵之前或发酵之后更易发生苹果酸乳酸转化，但如果在乙醇发酵活跃期接种，这种转化很少发生。
除了氨基酸外，乳酸细菌还需要烟酸和泛酸，有时还需要核黄素和吡哆醇；碳水化合物主要是果糖和葡萄糖；Mn2＋、Co2＋、Zn2＋、Mg2＋等是乳酸菌代谢所必需的矿物质；精氨酸对于乳酸菌的生长具有促进作用。
2．酒精浓度
酒精浓度过高会对乳酸菌的新陈代谢产生抑制作用，尤其当酒精度超过了10%(体积分数)，酒精就会变成阻碍乳酸菌生长的重要因子，不同的菌株对酒精浓度的抗性不同。研究表明，12.5%的酒精不仅抑制乳酸菌的生长，还造成乳酸菌的大量死亡。在酿造果酒时，人们常常考虑在发酵醪酒精度较低时尽早进行苹果酸-乳酸发酵。酒精度越高，诱导期就越长，酒中的乳酸菌数目也越稀少，苹果酸分解速度就越慢。
3．二氧化硫浓度
二氧化硫(SO2)对乳酸菌是一个强烈的抑制因子，SO2能够强烈抑制ATP酶的活性。果酒中的二氧化硫有结合二氧化硫、游离二氧化硫等存在形式，游离二氧化硫比结合二氧化硫对乳酸菌作用强，二氧化硫对苹果酸-乳酸发酵的抑制作用取决于使用的乳酸菌种、果酒的pH值以及酒中存在的可溶性固形物含量。
一般情况下，总二氧化硫在100mg/L以上，或结合二氧化硫在50mg/L以上，或游离二氧化硫在10mg/L以上，就可抑制果酒中乳酸菌繁殖。
MLB对SO2非常敏感，比酵母敏感得多。所有MLB具有相同的敏感性，酒类酒球菌中没有耐受性菌株。酵母产生一定量的SO2，产生的亚硫酸盐量在20mg/L以上，如果pH条件合适，足以抑制MLB的生长。酒类酒球菌对亚硫酸盐的耐受性达30mg/L，对低pH耐受的菌比不耐受的菌生存得更好。在酸性培养基(pH3.5)中的适应性阶段加入亚致死浓度的亚硫酸盐(15mg/L)，以增加MLB对亚硫酸盐的适应性。
4．发酵温度
温度是影响苹果酸-乳酸发酵的重要因子。当温度低于18℃时，苹果酸-乳酸发酵的速度开始下降；当温度在5～10℃可阻止苹果酸-乳酸发酵；而当温度高于30℃时，苹果酸-乳酸发酵也将减弱。在实际应用中，苹果酸-乳酸发酵的温度多在18～20℃。
5. pH值
pH值作用主要表现在：①影响乳酸菌成活率，从而决定进入苹果酸-乳酸发酵前迟滞期的长短；②影响乳酸菌的生长速率，从而影响苹果酸-乳酸发酵速度；③影响果酒中乳酸菌的生长种类。苹果酸-乳酸发酵在酸度较低的酒中很容易发生。通常需要进行MLF的酒的pH值为2.8～3.5之间，乳酸菌最适生长pH为4.2～4.5。当pH值为3.0或更低时，几乎所有的乳酸菌都受到抑制，在pH值3.0～4.5之间，pH值越高，苹果酸-乳酸发酵就越容易。pH也影响微生物的代谢，在pH3.2以下时许多MLB分解苹果酸，在pH3.5时则进行糖的分解。在pH3.8时MLF的速率高于pH3.8以下时的速率，在pH3.2时比在pH3.8时慢10倍。有的菌株对酸有高的耐受性。在pH3.5以下的酒中，酒类酒球菌是优势菌群，在较高的pH条件下乳杆菌和片球菌可以生存和生长。
6．有机酸含量
MLB通过3个不同的酶促途径转化苹果酸为乳酸和CO2。一些MLB拥有苹果酸-乳酸酶，使L-苹果酸脱羧基直接产生L-乳酸，而不经历游离的中间产物。一些MLB拥有苹果酸酶，如干酪乳杆菌和粪肠球菌，可以转化L-苹果酸为丙酮酸，后者一部分还原为L-乳酸，使其在以苹果酸为唯一碳源的培养基中生长。第3种途径见于发酵乳杆菌，L-苹果酸被苹果酸脱氢酶还原为草酰乙酸，之后脱羧基形成丙酮酸，再还原为乳酸。一些研究表明，L-苹果酸促进酒类酒球菌生物量的增加，在较低的pH，L-苹果酸代谢速率很高，而碳水化合物代谢进行得非常慢。
在MLF过程中，酒类酒球菌在乙醇发酵后代谢柠檬酸和残留的碳水化合物。酒类酒球菌不能在以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长，然而，在葡萄糖出现的情况下生长速率和生物量增加。在有葡萄糖时丙酮酸的代谢流向主要是2，3-丁二醇和乳酸的产生，而乙偶姻是柠檬酸代谢的主要产物。柠檬酸诱导生长增强，部分原因是它与葡萄糖共代谢时ATP产生增加。
酒石酸只有在氧条件下才被MLB代谢，这意味着只有将果酒暴露于空气下才能代谢。琥珀酸在乙醇发酵过程中由酵母产生，不能被MLB代谢。醋酸是在糖和柠檬酸代谢中由细菌产生。葡萄糖酸盐和丙酮酸或许被MLB经己糖-磷酸途径代谢为乳酸、乙酸和CO2，由于丙酮酸结合SO2，所以MLB的生长导致SO2释放，或许可以降低为阻止氧化和微生物腐败所加入的SO2的量。
癸酸和月桂酸作为生长因子刺激苹果酸-乳酸发酵，但浓度更高时这些酸对MLF有抑制作用。当培养基pH从6降低到3时，这些脂肪酸的毒性作用增加，表明未解离分子是其毒性形式，这些脂肪酸在膜脂中高度可溶，经被动扩散进入细胞。一小部分这些脂肪酸或许整合到细胞膜，修饰其成分和改变通透性。低浓度脂肪酸增加L-苹果酸的通透性，因而促进L-苹果酸降解。高癸酸(20mg/L)和月桂酸(5mg/L)浓度时，ATP酶的活性分别减少约5%和42%，因为长链脂肪酸脂溶性更高，毒性也更强。
7．酿造工艺
澄清过度会降低发酵醪中天然乳酸菌的菌群数，降低乳酸菌生长所需的营养物质含量，减少了自然启动苹-乳发酵的可能性。另外，采用热浸渍方法酿造的果酒，较难触发苹-乳发酵。发酵容器(橡木桶、不锈钢罐、罐的形状等)、浸提出的单宁含量、外源添加单宁的含量、溶解氧的含量、营养物的补充以及延长酒脚接触时间，都会影响乳酸菌的生长。果酒接触氧气后会促进双乙酰的产生，因为氧气会促进乙酰乳酸氧化成双乙酰。在半好氧环境中双乙酰的积累量是完全厌氧环境中双乙酰含量的6倍。双乙酰还原成3-羟基-2-丁酮的程度取决于酒的氧化还原电位，若电位较低，酒中双乙酰则较少。苹-乳发酵结束后，采用延迟分酒、酒脚陈酿工艺或过滤操作都会影响酒的感官品质。酵母酒脚会分解双乙酰，Batonnage操作(搅桶，使酵母菌残体与酒液增加接触)会降低甚至消除黄油味。
8．酚类物质
有些酚类化合物会抑制乳酸菌的生存和生长，而另一些酚类化合物又易于触发苹-乳发酵。Knoll等评估了3种酚酸(咖啡酸、香豆酸、阿魏酸)在模拟酒液(pH3.8，酒精度12%)中对不同乳酸菌成活率、生长速率和活性的影响。当咖啡酸的浓度为50～100mg/L时，对乳酸菌的生长有积极作用，能够促进苹果酸的代谢分解。阿魏酸对乳酸菌的生长及代谢苹果酸的负面影响与酒精发酵接种的酵母菌特性有关。对苹-乳发酵抑制作用最强的是香豆酸，且抑制作用随浓度增强而增强。关于酚酸抑制或促进乳酸菌生长的作用机理有待深入研究。另有实验指出，在模拟酒液(pH3.5，酒精度13.3%)中优质花青素(浓度为250mg/L)能够刺激乳酸菌的生长，而来自果梗和果籽的粗涩劣质单宁有可能抑制乳酸菌生长。
9．乙醛
乙醛具高挥发性，感官阈值为100～125mg/L。在低水平，乙醛有愉快的果香味，但过量时出现不良的风味，如绿色、草绿色或苹果样风味。加SO2可掩盖其风味，但SO2和乙醛结合失去其抗菌作用和抗氧化作用。乙醛和酚类化合物结合产生了稳定的聚合色素，对SO2的漂白作用有耐受性，但它可能引起浑浊和沉淀。
游离乙醛对MLB的影响尚不清楚，因为低水平的乙醛(≤100mg/L)刺激异型发酵型奶源MLB(如肠膜明串珠菌)的生长，一般认为乙醛作为异型乳酸发酵的电子受体，使形成额外的能量，然而，高水平的乙醛(>100mg/L)抑制MLB的生长。酒球菌和乳杆菌可以代谢游离和SO2结合的乙醛，主要形成乙醇和乙酸。
10．其他微生物
酒类酒球菌生长使pH提高到一定的水平时，使其他MLB生长可能会促进MLF，但如果其他MLB竞争营养并产生细菌素则抑制MLF，用MLB生产发酵乳制品和发酵蔬菜时噬菌体引起的MLB裂解是一个重要的问题，但在果酒酿造中是否引起同样问题尚不清楚，曾有在葡萄酒发酵过程中MLB感染噬菌体的报道。
11．通气
通入空气常常有利于乳酸菌的生长。饱和空气的新果酒提前几天出现苹果酸-乳酸发酵，相反，如果用纯氧饱和反而延迟，但不完全阻碍。总的说来，对果酒发酵过程通风有利于进行苹果酸-乳酸发酵。
12．酒脚
处于发酵罐底的酒脚(尤其是大型发酵罐)紧密压实，不易活动，因此严重影响酵母、乳酸菌和营养物之间进行物质交换。这可解释为什么大型发酵罐较难启动苹-乳发酵。然而，这一问题可以通过在乳酸菌接种数小时后对整个罐体加强搅拌作用来解决，保障顺利启动苹-乳发酵。发酵过程中，建议每周对酒脚搅动一次，确保乳酸菌和营养物悬浮。
13．农药残留
农药及残留物会延滞或中止苹-乳发酵，甚至阻碍发酵的启动。农药及其残留物质对苹-乳发酵存在重大负面影响。因此，控制农药用量、注意原料卫生质量对保障苹-乳发酵意义重大。
三、苹果酸-乳酸发酵的作用
MLF对果酒的影响很多，但主要表现为降酸、提高细菌稳定性、风味的改善和改变酒色。
1．降酸
苹果酸-乳酸发酵将氢离子固定在乳酸上可以使滴定酸度下降到0.03g/L(以酒石酸酸度计)，pH增加0.3，从而使果酒的酸度降低，改善果酒的口感。
2．提高细菌稳定性
经过MLF的葡萄酒比没经过MLF的葡萄酒稳定得多。苹果酸和酒石酸是果酒中的固定酸。与酒石酸相比，苹果酸为生理代谢活跃物质，易被微生物分解利用，通常的化学降酸只能去除酒石酸，而果酒经过MLF可使苹果酸分解，提高果酒中细菌的稳定性。另外苹果酸-乳酸发酵发生时由于营养物质的消耗或细菌素的产生使其他微生物的生长受到抑制。苹果酸-乳酸发酵发生的时间也很重要，如果发生在果酒装瓶之前，就可预防其在瓶中的生长。乳酸菌在瓶中的生长或可引起果酒浑浊、CO2产生，产生多糖导致酒体变黏，或pH提高促使其他腐败微生物生长等。
3．风味的改善
果酒经苹果酸-乳酸发酵之后，不仅产生乳酸，也产生其他代谢产物，对果酒的风味产生影响。在有限通风条件下，酒类酒球菌倾向于产生乳酸和乙醇，欲产生更多乳酸则要求更多的通风。然而，其他乳酸菌在此条件下可能产生醋酸，醋酸本身有刺激性，所产生的醋酸的量非常重要，应避免超出感官检测的阈值。乳酸菌产生的另一个重要的化合物是双乙酰，双乙酰有特征性的奶油风味。双乙酰的形成取决于前体物质的出现，可由乙醛和乙酰CoA反应形成，或由丙酮酸和乙醛反应产生五碳的乙酰乳酸，后者进而再形成双乙酰分子和一分子CO2。乳酸菌发酵过程中产生的2，3-丁二醇来自乙偶姻，具有淡淡的苦啤酒的风味，通常在检测阈值以下。乳酸菌发酵过程中还产生乳酸乙酯、丙烯醛等，对果酒的风味产生影响。
在含氮丰富的果汁发酵时，酒中会出现奶酪的风味。赖氨酸是酵母的重要营养，但过量添加会导致出现所谓的鼠臭味。一些植物乳杆菌和短乳杆菌代谢酒石酸为醋酸，产生所谓的败坏病。这些是果酒酿造中不希望看到的。
进行MLF的酒类酒球菌可以分解酒中的柠檬酸生成乙酸、双乙酰及其衍生物(乙偶姻、2，3-丁二醇)等风味物质。其代谢活动也改变了果酒中的醛类、酯类、氨基酸、维生素等微量成分的浓度和含量，增加了风味的复杂性，对酒的风味有修饰作用。此外，MLF可以增加单宁缩合度和增加单宁胶体层，使酒的口感更为柔和。并且在MLF过程中，植物性味道减少，能使酒的水果风味更好地展现出来。
4．改变酒色
在MLF过程中，果酒总酸下降、pH上升，从而导致酒的色调由紫红向蓝色转变。此外，酒类酒球菌利用了与SO2结合的物质如丙酮酸、α-酮戊二酸等，释放出SO2，游离的SO2会与花色苷结合而降低果酒的色度。在有些情况下，经过MLF后，色度可下降30%左右，从而使酒颜色变得老熟。
四、苹果酸-乳酸发酵的抑制
苹果酸-乳酸发酵并不总是对改进果酒的品质有益处，有时即使用理想的乳酸菌发酵，也难免会产生一些不愉快的气味。一般来说，如果希望获得口味清爽、果香味浓、尽早上市的酒，则应防止这一发酵的进行。为此，可以采取以下抑制措施：保持酒的pH值在3.2以下；使酒精度达14%以上；低温贮存；把总二氧化硫浓度调至50mg/L以上，尽早倒酒和澄清；减少果皮的浸渍时间；巴斯德杀菌和滤菌板过滤；添加化学抑制剂；添加细菌素，如乳酸链球菌素、植物乳杆菌素和片球菌素等；添加溶菌酶。
五、苹果酸-乳酸发酵的促进
通过添加人工培养的乳酸菌或依靠野生乳酸菌来启动苹果酸-乳酸发酵。主发酵结束后，不能使大量酵母在酒液中存在太久，因为死酵母会发生自溶现象，往往给酒体带来不良的风味。然而在后发酵阶段，少量的酵母自溶对酒体是有益的，因为少量酵母自溶释放出的营养物质可以促进苹果酸-乳酸发酵细菌的增殖。如果在生产中欲进行苹果酸-乳酸发酵，须注意以下要求：
① 倒酒的时间不要太早，使酒泥中存在的酵母自溶物质促进乳酸菌的生长繁殖。
② 倒酒时不要添加二氧化硫，因为二氧化硫会抑制乳酸菌的生长，倒酒后新鲜果酒中游离态二氧化硫的量不宜超过20mg/L。
③ 果酒的贮存温度不宜低于10℃，低于10℃会对乳酸菌的生长和苹果酸-乳酸发酵的进行有所抑制。
④ pH宜控制在3.6～3.8，低于pH3.5一般要采取诱发措施使苹果酸-乳酸发酵启动。
⑤ 因为苹果酸-乳酸发酵在厌氧条件下进行，因此充分隔绝氧气有利于苹果酸-乳酸发酵的进行。
六、苹果酸-乳酸发酵的消除
通过以下措施可彻底抑制苹果酸-乳酸发酵：过滤除菌、加热杀菌、使用防腐剂。
1．过滤除菌
过滤除菌后再进行无菌灌装，可以彻底清除进行苹果酸-乳酸发酵的可能。这种方法可以保证商品酒的货架稳定性，并且对酒的感官质量不造成影响。过滤膜的标准孔径不能大于0.45μm。可以先用粗滤方法除去大部分沉淀物，再进行膜过滤或错流过滤除去酵母和细菌。另外，过滤器后的所有下游设备包括输送管道、灌装设备和包装材料都必须保证无菌状态，产品的质量控制十分重要，一般从灌装生产线上按批次取样，用无菌膜过滤，将膜放在营养培养基上保温培养，然后用肉眼检查是否长出菌落。这些细菌对营养要求苛刻，可以选用添加20%果汁或番茄汁的MRS培养基，它们一般是嗜中温菌，而且生长缓慢，在大约25℃温度下需培养至少10天。
2．加热杀菌
加热杀菌可以有效防止果酒中的酵母重新发酵，该方法同样适用于杀死苹果酸-乳酸发酵细菌，高温短时巴氏杀菌(82℃，15～25s)可以在酒的风味受影响较小的情况下有效地杀死细菌。与过滤除菌相似，杀菌后的整个下游系统(灌装线、灌装设备、酒瓶、瓶塞)也必须进行灭菌并保证无菌状态，当然小规模的果酒酿酒厂可采用瓶内灭菌的方式，即灌装后连瓶子一起进行低温长时巴氏杀菌(63℃，30min)，但是因为包装后进行杀菌所需的升温时间和降温时间均较长，所以会对果酒的风味有所影响。
3．使用防腐剂
经常用于限制苹果酸-乳酸发酵的防腐剂为二氧化硫。一般情况下，总二氧化硫在100mg/L以上，或结合二氧化硫在50mg/L以上，或游离二氧化硫在10mg/L以上，就可抑制果酒中乳酸菌繁殖。