第二节　酵母菌的发酵机理

酵母是兼性微生物，有氧条件下主要进行生长，无氧条件下主要进行发酵。在不同的细胞状态下，或启动发酵途径，或启动呼吸途径，产生不同的终产物。

一、糖酵解

糖酵解包括生物细胞将己糖转化为丙酮酸的一系列反应。这些反应有的可在厌氧条件下进行(酒精发酵和乳酸发酵)，有的也可在有氧条件下进行(呼吸)，它们构成了糖的各种生化转化的起点。糖酵解的特点是，葡萄糖分子经转化成1，6-二磷酸果糖后，在醛缩酶的催化下，裂解成2个三碳化合物分子，由此再转变成2分子的丙酮酸。在糖酵解中，由于葡萄糖被转化为1，6-二磷酸果糖后开始裂解，故又称之为磷酸己糖途径。在糖分子的裂解过程中，1分子葡萄糖降解成2分子丙酮酸，消耗2分子ATP，产生4分子ATP，因此净得2分子ATP，葡萄糖酵解的总反应式为：

葡萄糖＋2Pi＋2ATP＋ 2ADP＋2NAD^＋

2CH₃COCOOH＋4ATP＋2NADH＋2H^＋＋2H₂O

这里需要说明的是，果糖进入酵解的途径是果糖在己糖激酶的催化下形成6-磷酸果糖，接着进入酵解途径。酵母对蔗糖吸收利用以前，先把蔗糖水解为葡萄糖和果糖，水解得到的己糖再经过磷酸化进入酵解途径。

二、有氧呼吸

在有氧条件下，丙酮酸进入三羧酸(TCA)循环。开始丙酮酸羧化生成草酰乙酸或生成乙酰CoA，后两种物质合成TCA循环的第一个物质柠檬酸。循环一次，进入的碳以CO₂形式释放，产生NADH＋H^＋、FADH₂ 与GTP，由糖酵解与TCA循环产生的NADH＋H^＋与FADH₂经氧化磷酸化氧化成NAD^＋与FAD，电子经细胞色素传递给受体氧而生成水，在膜联ATP酶的作用下1分子NADH＋H^＋氧化产生3分子ATP，1分子FADH₂氧化产生2分子ATP，因此有氧条件下细胞代谢1分子葡萄糖净获得36或38个分子ATP。在此需要说明的是，1分子葡萄糖完全氧化产生多少个分子ATP的真实数据因具体的代谢条件而异。20世纪90年代中期以后，许多生物化学教科书改为最可能是30或32，原因在于P/O比的测定值。P/O比是被磷酸化的ADP分子数和消耗的O原子数之比，以前认为NADH＋H^＋被氧化的P/O比是3，FADH₂被氧化的P/O比是2，20世纪90年代以后的测定值分别是2.5和1.5。

三、酒精发酵

酒精发酵是在无氧条件下酵母菌分解葡萄糖等有机物，产生酒精、二氧化碳等不彻底氧化产物，同时释放出少量能量的过程。酒精发酵是相当复杂的生物化学现象，有许多连续的反应和不少中间产物，而且需要一系列酶的作用。事实上，在厌氧条件下，酵母可通过酒精发酵和呼吸两条途径对糖进行分解，而且这两条途径的起点都是糖酵解。从发酵工艺来讲，既有发酵醪中的淀粉、糊精被糖化酶作用，水解生成糖类物质的反应；又有发酵醪中的蛋白质在蛋白酶的作用下，水解生成小分子的蛋白胨、肽和各种氨基酸的反应。这些水解产物，一部分被酵母细胞吸收合成菌体，另一部分则发酵生成了酒精和二氧化碳，还要产生副产物杂醇油、甘油等。

在糖的厌氧发酵中，经EMP途径生成的丙酮酸，通过乙醛途径被分解，形成乙醇。在乙醛途径中，经EMP途径生成的丙酮酸，经丙酮酸脱羧酶(PDC)催化生成乙醛，释放出CO₂，乙醛在乙醇脱氢酶(ADH)作用下最终生成乙醇。该过程消耗了EMP途径产生的NADH₂。丙酮酸在厌氧条件下，经过异化作用生成酒精和二氧化碳。而酵母在发酵作用中，糖酵解是生成ATP的唯一途径，该过程的中间产物是乙醛。因此在酵母菌的酒精发酵中，乙醛是最终的电子受体。综上所述，葡萄糖进行酒精发酵的总反应式为：

葡萄糖＋2Pi＋2ADP＋2H^＋

2CH₃CH₂OH＋2CO₂＋2ATP＋2H₂O

在发酵的初始阶段，酵母首先积累甘油、丙酮酸和乙醛，由3-磷酸甘油醛氧化产生的NADH＋H^＋将磷酸二羟丙酮还原成甘油，在发酵条件下，当细胞内缺少NAD^＋时，该反应就显得特别重要。当基质中积累了足够的乙醛和甘油时，酒精发酵才能进行。此时，与由磷酸二羟丙酮生成甘油相比，NADH＋H^＋更易于将H释放给乙醛生成乙醇。因此乙醇不断积累，甘油生成减少。酒精发酵时，甘油的生成量约为初始糖浓度的3%～10%，具体受酵母菌株、发酵温度、是否搅拌及基质初始pH值与SO₂含量的影响。TCA循环中某些酶在厌氧条件下仍然具有活性，这些额外的途径对发酵中的酵母来说非常重要，因为NADH＋H^＋能够重新氧化，而且能够合成对细胞功能有重要作用的前体物质。

四、酒精发酵的副产物

酵母在酒精发酵过程中，由于发酵作用和其他代谢活动同时存在，酵母除了将果汁或果醪中90%以上的糖发酵生成酒精、二氧化碳和热量外，酵母还能够利用另外10%以下的糖产生一系列的其他化合物，称为酒精发酵副产物。酵母菌的代谢副产物不仅影响果酒的风味和口感，而且有些副产物，如辛酸和癸酸等，同时还对酵母的生长具有抑制作用。

1．甘油

甘油，即丙三醇，无色、无臭、味甜，外观呈澄明黏稠液态，是一种有机物。甘油是除水和乙醇外在果酒中含量最高的化合物，主要在发酵初期形成。甘油的呈味阈值一般为3～4.4g/L，味甜，像油一般浓厚，增加酒的挂杯性与醇厚度，口感圆润，一定含量的甘油可以提高果酒的质量，能使果酒口感圆润，并增加口感复杂性。在佐餐酒中甘油含量为5～15g/L，平均值为7g/L，在葡萄酒中，其含量为6～10g/L。

在酒精发酵过程中，甘油的生成量，除受代谢条件影响外，还主要取决于菌株间产甘油能力的差异和基质。酵母菌株之间甘油生成能力差别很大，嗜冷酵母菌株产甘油多。高温、长时间发酵、添加SO₂、高pH值、通气、搅拌均有利于甘油生成，初始糖浓度等也影响甘油的合成量，如红葡萄酒发酵温度较白葡萄酒高，其中含甘油也较多。在贮存期间，葡萄酒甘油含量提高0.04～0.12g/L。

2．乙酸

乙酸，也叫醋酸、冰醋酸，化学式CH₃COOH，是一种有机一元酸，是构成果酒挥发酸的主要物质，是酵母发酵的副产物，在正常发酵情况下，乙酸在果酒中的正常含量不超过0.4～0.6g/L。当酒中乙酸含量高于1.0g/L时，大多数消费者都会尝出醋味，所以绝大多数葡萄酒生产国将果酒中的乙酸含量限制在1.0～1.5g/L，我国为1.2g/L。

乙酸主要在发酵初期产生，它是由乙醛经氧化还原作用而形成的。发酵期间部分乙酸被还原成乙醇。在正常范围内时，乙酸是果酒良好的风味物质，赋予果酒气味和滋味。乙酸与醇反应生成数种具有水果香的、对果酒酒香有重要意义的乙酸酯。乙酸含量过高时说明原料或酒被某些细菌如醋酸菌、乳酸菌污染。被污染的酒暴露于空气中时乙酸大量生成。果酒的醋味主要是由乙酸引起的。因为测定乙酸的方法简单，所以果酒厂通过测定乙酸来监测果酒的挥发酸情况。

3．乙醛

乙醛是无色易流动液体，有刺激性气味，可与水和乙醇等一些有机物质互溶。乙醛可由丙酮酸脱羧产生，也可在发酵以外由乙醇氧化而产生。乙醛是果酒中最重要的醛类物质，其含量可占到总醛的90%以上。葡萄酒中乙醛的含量为20～60mg/L，有时可达300mg/L。乙醛给酒带来苦味和氧化味，乙醛可与SO₂结合形成稳定的亚硫酸乙醛，这种物质不影响果酒的质量和味道，故可用SO₂处理，使乙醛的氧化味消失。乙醛在水中的气味阈值为1.3～1.5mg/L。酒中有SO₂存在时，气味阈值上升至100mg/L，佐餐酒中乙醛含量超过50mg/L时表明酒已被氧化了。乙醛是氧化型葡萄酒的风味物质，一般希望其含量在300mg/L以上，此时酒具有坚果的风味。乙醛是正常的酒精发酵副产物，其生成量受pH、SO₂、好氧程度、澄清剂使用、酵母菌种、种龄及其接种量大小有关。发酵要结束时，乙醛重新进入酵母细胞被还原成乙醇。在某些菌株中，乙醛的生成与乙酸生成量成反比。

4．乳酸

乳酸，学名2-羟基丙酸，分子式是C₃H₆O₃，在多种生物化学过程中起作用。发酵期间，酵母产生少量的乳酸(0.04～0.75g/L)，在葡萄酒中，乳酸含量一般低于1 g/L。果酒中的乳酸主要来自于细菌的代谢活动和酒精发酵。最常见的细菌是乳酸菌。这些细菌产生的酶将苹果酸脱羧生成乳酸，该过程称为苹果酸-乳酸发酵(malolatic fermentation，MLF)，MLF的最大益处是将口味粗糙的苹果酸转化为口味柔和的乳酸。由MLF生成的乳酸是L型的，而酵母和某些细菌生成等量的L-乳酸和D-乳酸。

5．琥珀酸

琥珀酸是酵母代谢正常副产物，发酵初期生成较多，其生成量为乙醇生成量的0.5%～1.5%。果酒中琥珀酸的含量约为1g/L, 在所有的葡萄酒中都存在琥珀酸，一般为0.6～1.5 g/L。果酒中的琥珀酸主要来自糖代谢，琥珀酸在果酒中非常稳定，无氧条件下抑制微生物的代谢活动，其乙酯是某些葡萄酒的重要芳香成分，但琥珀酸有盐苦味，因此限制了在葡萄酒或果酒中的应用。

6．双乙酰与乙偶姻

双乙酰、乙偶姻是参与果酒风味形成的一类重要的4C羰基化合物，它们对果酒风味影响较为复杂。乙偶姻不是强风味活性物质，在果酒中的嗅觉阈值很高，比如在葡萄酒中的嗅觉阈值达150mg/L以上；双乙酰能够使酒精饮料产生不良风味，在葡萄酒中其阈值只有8mg/L。正常情况下双乙酰在酒中含量低，对酒的风味影响较小，含量超过 0.9mg/L时，会出现黄油味而影响酒质。酵母在发酵初期生成较多的双乙酰，发酵温度高生成量多，发酵后期双乙酰被还原成2，3-丁二醇，酵母能够迅速降解细菌或酵母生成的双乙酰、乙偶姻与α-乙酰乳酸。双乙酰和乙偶姻在酵母代谢下，能够借助酶促反应和非酶反应相互转变，二者都能够被最终还原为2，3-丁二醇。2，3-丁二醇在果酒中的含量为0.4～0.9g/L，无气味，略带甜苦味，其味可被甘油掩盖，一般不影响酒质。双乙酰有甜珠、黄油味和奶油味，在雪莉酒中含量相当高。乙偶姻具有甜味、黄油味，在佐餐酒中含量很低，对酒风味的影响还有待于进一步探讨。目前，酿酒工艺师大多关注双乙酰对果酒风味影响，而有关乙偶姻的研究较少。实际上，乙偶姻对果酒风味的潜在影响已经超出它的风味本身。

7．杂醇油

杂醇油是碳原子数大于2的脂肪族醇类的统称。在所有酵母进行的发酵中，都会产生一定量的杂醇油，比较重要的有正丙醇、异丁醇、异戊醇等。其中，异戊醇又是杂醇油中最重要的挥发性物质，其含量在90～300mg/L之间，有时能占杂醇油总量的50%以上。正丙醇具有甜味和成熟水果味。通常白葡萄酒中的杂醇油在160～270mg/之间，红葡萄酒中在140～420mg/L之间。　

一般地认为，果酒中正常产生的杂醇油来自果实中氨基酸的还原脱氨与糖代谢。另一些杂醇油来自野生酵母与细菌的污染。在某个酿造阶段被有害微生物污染时，果酒中会出现杂醇油味。但某些污染微生物产生的杂醇油具有令人愉快的香味。在陈酿过程中，杂醇油与酒中的有机酸反应生成酯，但反应速度要比发酵过程中酵母的酶促酯化慢得多。发酵过程中杂醇油的生成量受酿造工艺的影响。高温发酵、发酵醪中存在悬浮颗粒、加糖发酵、带皮发酵、加压发酵、搅拌、通风等均有助于杂醇油的形成；添加SO₂、加压发酵、清汁发酵、低温发酵能减少杂醇油的生成量。酵母菌种之间产杂醇油的能力也不同。

8．酯类

果酒中含有有机酸和醇类，而有机酸和醇可以发生酯化反应，生成各种酯类化合物。影响酯合成的因素包括果实成熟度、糖含量、发酵温度、果汁澄清度等。酯具有风味，如乙酸乙酯具有“溶剂味”“指甲油味”；乙酸异戊酯具有“水果味”“梨味”或“香蕉味”；丁酸乙酯具有“花香味”或“水果味”；己酸乙酯和辛酸乙酯具有“酸苹果味”，而乙酸苯乙酯具有“花香”“玫瑰香”与“蜂蜜香”等。由此可见，酯类影响着果酒的香气。

在所有酯中，乙酸乙酯研究得最多。健康葡萄酒内乙酸乙酯含量一般为50～100mg/L，低含量(<50mg/L)时具有令人愉快的香气，增加果香的复杂性；高于150mg/L时则有酸醋味。乙酸乙酯含量过高通常是因为果实、果浆或酒污染了醋酸菌的缘故。醋酸菌不仅能直接合成乙酸乙酯，而且由其生成的乙酸在非酶条件下与乙醇反应生成乙酸乙酯。

9．丙酮酸、苹果酸

在酒精发酵过程中，生成20～30mg/L丙酮酸。丙酮酸具有鼠味、乙酸味与马德拉酒的氧化味。在发酵过程中应尽量减少形成丙酮酸，因其与SO₂具有很强的结合能力(每毫克丙酮酸结合0.72mg SO₂)。添加维生素B₁可以将丙酮酸的生成量减小到最少。

酵母代谢L-苹果酸的能力与菌株的最适生长温度有关，耐冷酵母(贝酵母、巴斯德酵母和葡萄汁酵母)可以合成L-苹果酸，适温的酿酒酵母在发酵过程中降解中等水平的L-苹果酸，而耐热的酿酒酵母和奇异酵母能够降解40%～48% L-苹果酸。适宜条件下酵母可以生成1g/L苹果酸，且可以生成D(＋)-苹果酸。酵母细胞内苹果酸降解有两种可能途径，即苹果酸酶途径和富马酸途径，在发酵开始时，琥珀酸生成活跃，在发酵后期，大部分L-苹果酸转化成乙醇。不同的酵母菌株产琥珀酸能力不同，且增加苹果酸的浓度会使琥珀酸产量增加。酵母属酵母之间降解苹果酸的能力差别显著(0～3g/L苹果酸之间)。

10．含硫化合物

含硫化合物主要是SO₂与硫化氢。果酒酵母中，在辅因子3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸存在条件下，催化形成H₂S的酶复合体是合成含硫氨基酸(蛋氨酸与半胱氨酸)必需的。过多SO₂生成是因酶亚硫酸复合体突变缺陷造成的。该缺陷使得酶亚硫酸复合体过早水解而产生SO₂，而不是还原成H₂S。高产SO₂的菌株H₂S产量低，反之亦然。产H₂S是果酒酵母的特性，产量由每升几微克到几毫克不等。果浆中的元素硫会促进H₂S产生。另外，不产H₂S的菌株正丙醇产生多。H₂S有挥发性，为臭鸡蛋味，接近阈值时，是刚发酵完新酒酵母味的一部分。在常用的果酒酵母中，贝酵母产SO₂比酿酒酵母多。发酵过程中SO₂积累量在12～64mg/L之间。影响SO₂合成的主要因素是酵母菌种、发酵温度及果实含硫量。SO₂> 30mg/L时，通常是在果酒发酵前后添加的结果。

果酒中还有一些其他硫化物。这些物质可能来自含硫氨基酸、多肽和蛋白质的代谢。有机硫的异味与酵母自溶有关。结构最简单的含硫化合物是硫醇，其中最重要的是乙硫醇，达到阈值时产生腐烂圆葱味、燃烧橡胶味，浓度高时具有臭鼬味、粪便味，另一种物质是2-巯基乙醇，与酒的谷仓味有关。硫醚是另一类含硫化合物。二甲硫在葡萄酒中高于阈值时有熟卷心菜味、虾味，低于阈值时为芦笋味、玉米味和糖蜜味。二甲基二硫和二乙基硫醚有时也存在于葡萄酒中。

11．多糖、糖苷酶与甘露糖蛋白

果酒酵母还能产生多糖胶体物质，特别是甘露聚糖与葡聚糖，有时为半乳糖与鼠李糖的聚合物。这些聚合物会阻塞膜滤器通道，防止酒石酸盐沉淀，有利于酒中芳香物质的挥发。除酵母菌株特性外，促进细胞繁殖的因素如温度、氧、铵离子等也会促进胶体物质的生成，低pH与高酒精含量有利于胶体物质从细胞膜释放。

某些果实中存在单萜类物质，如香叶醇、橙花醇、里哪醇、香茅醇与α-萜品醇，赋予果实特有的芳香。当这些物质以糖苷形式存在时，无挥发性，也就没有香气。若采用酶切断其中的糖苷键，使萜烯游离，萜烯的香气就会体现出来。但用高β-葡萄糖苷酶活性酵母酿造葡萄酒时，发现酒中的萜烯含量与酒的感官质量并没有显著变化。

甘露糖蛋白是自溶时酵母细胞壁释放的亲水胶体，这些蛋白质有助于蛋白质与酒石酸盐的稳定性，与香气物质发生反应，降低单宁的苦涩味。甘露糖蛋白是高度分支的杂蛋白，分子量变化很大。陈酿时搅拌会增加这些物质的含量，而微氧处理作用甚微。有学者建议使用发酵结束时自溶迅速且产生大量蛋白质的酵母菌株或使用β-1，3-葡聚糖酶以从酵母细胞壁释放更多的甘露糖蛋白。

五、影响酒精发酵的因素

1．温度

尽管酵母菌在低于10℃的温度条件下很难生长繁殖，但它的孢子可以抵抗－200℃的低温。液态酵母的活动最适温度为20～30℃，当温度达到20℃时，酵母菌的繁殖速度加快，在30℃时达到最大值；而当温度继续升高达到35℃时，其繁殖速度迅速下降，酵母菌呈疲劳状态，酒精发酵有停止的危险。只要在40～45℃保持1～1.5h或在60～65℃保持10～15min就可杀死酵母。但干态酵母抗高温的能力很强，可忍受5min 115～120℃的高温。在20～30℃的温度范围内，每升高1℃，发酵速度就可提高10%。因此发酵速度随着温度的提高而加快。但是，发酵速度越快，停止发酵越早，因为在这种情况下，酵母菌的疲劳现象出现较早。在一定范围内，温度越高，酵母菌的发酵速度越快，产酒精效率越低，而生成的酒度就越低。因此，如果要获得高酒度的果酒，必须将发酵温度控制在足够低的水平上。

当发酵温度达到一定值时，酵母菌不再繁殖，并且死亡，这一温度就称为发酵临界温度。如果超过临界温度，发酵速度就大大下降，并引起发酵停止。由于发酵临界温度受许多因素如通风、基质的含糖量、酵母菌的种类及其营养条件等的影响，所以很难将某一特定的温度确定为发酵临界温度。在实践中主要利用“危险温区”这一概念。在一般情况下，发酵危险温区为32～35℃。但这并不是表明每当发酵温度进入危险区，发酵就一定会受到影响，并且停止，而只表明，在这一情况下，有停止发酵的危险。需要强调指出的是，在控制和调节发酵温度时，应尽量避免温度进入危险区而不能在温度进入危险区以后才开始降温。因为这时，酵母菌的活动能力和繁殖能力已经降低。浸渍发酵最佳温度25～30℃；而清汁发酵的最佳温度为18～20℃。

2．通风

酵母是兼性微生物，发酵过程中需要氧。在完全的无氧条件下，酵母菌只能繁殖几代，然后就停止。这时，只要给予少量的空气，它们又能出芽繁殖。但如果缺氧时间过长，多数酵母菌细胞就会死亡。酵母细胞的合成及膜功能的调节需要甾醇与不饱和脂肪酸，微量的氧有利于不饱和脂肪酸和甾醇的合成。另外烟酸的合成也需要分子氧。

在果实前处理时果汁吸收的氧(约9mg/L)能够满足酵母的生长需求。深色果浆发酵期间通过果汁循环吸入氧有利于发酵进程。在对数生长期末通氧效果特别明显。通氧后酵母细胞数增加，平均细胞活力增强。通风还有利于乙醛的生成，乙醛对花色苷与单宁聚合物的早期聚合有利，因而有利于颜色稳定性。发酵后，限制通氧(40mg/L)有利于红葡萄酒的成熟。与之相反，大多数白葡萄酒与浅色果酒在发酵后应避免与氧接触。而在某些白葡萄酒酿造过程中，酒液与酒脚搅拌混合时应限制性通氧。发酵停滞的果酒经过通风可使发酵能力恢复。生产起泡果酒时，二次发酵前轻微通风有利于发酵的进行。

发酵白葡萄汁或酿造果香突出的果酒时应避免接触过多的氧。通风有利于高级醇和乙醛的生成，抑制酯合成，但在发酵开始或发酵最初几天短期通风可使情况逆转。通风可除去H₂S，延长通风时间促进尿素的合成，增加氨基甲酸乙酯合成的可能性。氧的吸收受许多因素的影响，如澄清情况、皮汁接触情况、多酚含量、SO₂含量、多酚氧化酶、糖浓度、温度、泵循环及发酵速度等。在发酵过程中，氧越多，发酵就越快、越彻底。因此，在生产中常用倒罐的方式来保证酵母菌对氧的需要。

3. pH值

酵母菌在中性或微酸性条件下，发酵能力最强。如在pH4.0的条件下，其发酵能力比在pH3.0时更强。低pH值有利于某些氨基酸的吸收，有助于SO₂的杀菌作用，可抑制果汁中多种杂菌的生长。低pH值会引起乙基酯和乙酸酯的降解。pH值高时有利于甘油与高级醇的生成。在pH很低的条件下，酵母菌生成挥发酸或停止活动。因此，酸度高并不利于酵母菌的活动，但却能抑制其他微生物(如细菌)的繁殖。葡萄酒发酵适宜pH值为3.3～3.5，其他果酒的发酵pH值不低于3为宜。若pH值过低，酵母很难将某些果浆(汁)发酵彻底。

4．糖

葡萄糖和果糖是酵母的主要碳源和能源，葡萄糖利用速度比果糖快。蔗糖先被位于酵母细胞膜和细胞壁之间的转化酶在膜外水解成葡萄糖和果糖，然后再进入细胞，参与代谢活动。果酒酵母能利用的碳源还有醋酸、乙醇、甘油等，但这些物质在果浆中含量较低。水果中的其他糖如戊糖则不能被酵母利用。糖度高，发酵生成的甘油较多，生成的乙醇及其酯类也多。果汁加糖发酵时，高级醇和乙醛的生成量增加。当果汁含糖量过高时，适当添加氮源有利于酒精发酵且减少高级醇的形成。糖浓度影响酵母的生长和发酵。糖度为1～2°Bx时生长发酵速度最快；5°Bx开始抑制酒精发酵，单位糖的酒精产率开始下降；高于25°Bx出现发酵延滞；高于30°Bx时单位糖酒精产率显著降低；而高于70°Bx时大部分果酒酵母不能发酵。

5. SO₂

在大多数情况下，添加SO₂主要是为了抑制有害菌的生长。SO₂是理想的抑菌剂，果酒酵母对其不敏感，处于生长旺盛期的酵母甚至比休眠细胞更耐SO₂。在正常使用浓度范围内(健康果实<50mg/L)，SO₂不会影响酒精发酵速度，但会推迟发酵的开始。15～20mg/L的SO₂可使酵母活细胞数由10⁶CFU/mL降至10⁴CFU/mL以下，1.2～1.5 g/L的SO₂能够杀死酵母菌。SO₂还有利于甘油的生成，减少乙酸生成量。SO₂与果汁中某些物质结合而失去杀菌、抑菌作用。SO₂还可以影响酵母的代谢活动，SO₂容易和乙醛、丙酮酸、α-酮戊二酸等羰基化合物结合，增加这些物质的生成量。因此成品酒中这些物质的浓度随SO₂添加浓度的增加而升高。被固定的SO₂量与糖含量、pH值、温度等因素有关。只有游离SO₂才具有杀菌作用，果汁pH值低，SO₂杀菌活性高。

6．含氮化合物

果实中的含氮化合物含量差别很大。在某些情况下，果实中的可同化氮达不到酵母生长繁殖的最低要求(140～150mg/L)。含氮少会造成起发困难或发酵缓慢，因为氮饥饿会不可逆转地造成糖运输系统钝化。澄清、过滤或离心的果汁中含氮量低。氮用来合成蛋白质、嘧啶核苷酸与核酸。酵母可由糖和无机氮合成这些物质。由此，大多数酵母不需要存在于果汁中的这些物质。但当基质中存在这些含氮物时，酵母能够同化。高糖果汁中添加无机氮可获得高的酒精得率，减少高级醇的生成，增加发酵醪中的酵母细胞数，加快发酵速度。

含氮化合物在酵母对数生长期需要量最多，吸收最快。酵母最容易吸收的无机氮是氨。氧化态的氮可直接参与有机物的合成。酿酒酵母有数个氨基酸运输系统。一个是非专一性的，可输送除脯氨酸外的所有氨基酸。其他系统有较强的专一性，只输送某些特定的氨基酸。某些氨基酸特别容易被同化，如苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸与色氨酸，而另外一些如丝氨酸、精氨酸、脯氨酸难于被同化。胺和多肽也可以作为可同化氮源。果酒酵母不能利用蛋白质，因其既不能将蛋白质送入细胞内，也不能将蛋白质在胞外酶解成氨基酸。

果汁中含氮不足时常用的无机氮源是(NH₄)₂HPO₄。在美国，最高允许(NH₄)₂HPO₄添加量为960mg/L，相当于提供氮203mg/L；欧洲国际葡萄与葡萄酒组织(OIV)最多只允许添加300mg/L(NH₄)₂HPO₄，澳大利亚控制葡萄酒中的最高磷酸盐含量为400mg/L。一些酿酒师提倡添加含有氨基酸、矿物质、维生素及其他酵母生长因子的营养促进剂。在具体选用时应确定是否符合我国的相关规定，根据待发酵果浆或果汁的营养组成与使用的果酒酵母的需求而定。

7．脂质

组成植物细胞的脂质可分为两组，第一组主要是以异戊二烯的聚合物及其衍生物和环戊烷多氢菲衍生物组成，第二组由脂肪酸与醇(如甘油)发生酯化反应生成的酸及其衍生物组成。第一组包括萜类物质和甾醇等，第二组包括磷脂、脂肪、蜡、糖脂等。所有脂质对植物细胞和酵母细胞的结构和功能都非常重要，然而只有脂肪、蜡和甾醇直接影响果酒的质量。在发酵中和发酵后，两种脂质都有助于维持细胞膜功能、提高酵母的耐乙醇能力。

脂质的功能很多，如为酵母细胞膜的基本组成成分(磷脂与甾醇)、色素(类胡萝卜素)、能量贮备物(脂肪)、与蛋白质生成脂蛋白成为调节因子等。无氧时果酒酵母不能合成甾醇和不饱和脂肪酸，也就无法合成脂质。厌氧条件下脂合成的抑制，使高度澄清的果汁发酵滞缓，澄清可除去90%的脂肪酸，特别是不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸、亚麻酸)。此外，甾醇如麦角固醇也有可能从葡萄汁中除去。但甾醇和不饱和脂肪酸贮存量的减少会加剧乙醇诱导的葡萄糖吸收减弱与发酵终止。有氧条件下酵母合成某些中间代谢产物如羊毛甾醇、麦角甾醇以及不饱和脂肪酰辅酶A等，这些物质通称为“存活因子”。甾醇是保持膜渗透性的必需物，能够增加酵母活力并延长它们的发酵活性。甾醇还影响挥发性气味与风味物质的合成。

果酒酵母对中链羧酸如辛酸、癸酸特别敏感。这些酸是发酵期间酵母发酵正常副产物，它们的存在加剧了乙醇诱导的营养成分如氨基酸的泄漏。添加甾醇、不饱和长链脂肪酸或各种吸附性物质如酵母菌皮、活性炭、膨润土、硅胶等都能使这些症状得到缓解或逆转。酵母菌皮是酵母细胞壁的残留物，能提供部分可同化氮、不饱和脂肪酸和甾醇，但氧化变质的酵母菌皮不能再使用。

8．酵母菌皮

在对酒精发酵停止原因的研究中发现，在发酵过程中，酵母菌本身可以分泌一些抑制自身活性的物质。这些抑制发酵的物质是酒精发酵的中间产物，主要是脂肪酸。所以除去这些脂肪酸可以促进酒精发酵，防止发酵中止。在酒精发酵过程，活性炭可以吸附这些脂肪酸，从而促进酒精发酵。但是，在果酒中加入活性炭后很难将之除去，而且很多国家限制活性炭的使用。所以，活性炭的这一特性难以实际应用。酵母菌皮同样具有这种吸附特性，酵母菌皮一般用高温杀死酵母菌而获得。发酵前加入0.2～1.0g/L酵母菌皮，可大大加速发酵，而且使发酵更为彻底。

酵母菌皮除可用于防止发酵中止外，还可用于发酵停止的果酒重新发酵。第一次发酵由于各种原因自然中止，含有大量残糖。这时加入酵母菌皮，可除去脂肪酸，使发酵重新触发，而且发酵更为彻底。大量实验结果还表明，酵母菌皮不仅能有效地防止发酵的中止和触发发酵中止的果酒的再发酵，而且不影响果酒的感官特征。因此，OIV(2006)已将酵母菌皮的使用，列入允许使用的工艺处理名单。

9．维生素

维生素是酶或辅酶的前体，对酵母代谢有重要的调节作用。因菌种与生长环境不同，酵母还需要各种维生素如维生素B₁、核黄素、泛酸、维生素B₆、烟酸、生物素等。一般地，在生产实践中酵母属的所有菌株都需要生物素与泛酸。缺乏泛酸可导致H₂S生成。维生素B₁与酮酸的脱羧作用有关，有的酵母具有维生素B₁合成能力，有的则没有，SO₂会破坏果汁中的维生素B₁，因此在接酵母发酵果浆(汁)之前，一般添加适量的维生素B₁。烟酸用于合成NAD^＋与NADP^＋。真菌污染的葡萄中维生素含量低，此时添加维生素有利于缩短发酵延滞期。适量的维生素会减少能与SO₂结合的羧基化合物的生成量，由此可减少酿造过程中SO₂的用量。此外，维生素还可以减少高级醇的形成。

10. CO₂与压力

CO₂为正常发酵副产物，每克葡萄糖约产260mL CO₂，发酵期间CO₂的溢出带走约20%的发酵热。挥发性化合物也随CO₂一起释出。乙醇的挥发损失为其产量的1%～1.5%，具体随糖浓度与发酵液温度而变。芳香物质大约损失25%，损失量与水果品种与发酵温度有关，一般乙酸酯的损失比乙基酯的损失多。增大发酵罐体积，减少发酵果汁与空气的接触面积，降低发酵温度，使CO₂缓慢溢出，都有利于香气成分的保留。

当压力上升至0.7MPa时酵母生长停止。低pH值、高乙醇含量增加了酵母对压力的敏感性。CO₂对酵母的作用是改变了膜的组成与透性。另外CO₂会影响羧化反应与脱羧反应间的平衡。加压发酵时，用于酵母繁殖的糖显著减少，单位糖产酒增多，发酵结束时，新酒中也往往残留较多糖分。德国、澳大利亚、南非等国就采用加压发酵生产半干葡萄酒。

11．矿物质

以干重计时，酵母含有3%～5%的磷、2.5%的钾、0.3%～0.4%的镁、0.5%的硫与微量的钙、氯、铜、铁、锌和锰等。铜、铁、铝含量高抑制酒精发酵，酵母生长需要供给磷源，用于合成核酸、磷脂、ATP及其他化合物。钾对磷吸收是必要的，缺钾可能会导到酒精发酵滞缓。无机离子是酵母许多酶活性部位的重要组成成分，并且能调节细胞代谢，维持细胞质pH值及离子平衡。

K^＋的作用是抗有毒离子，控制胞内pH，分泌钾以平衡主要离子如Zn^2＋、CO₂的吸收，稳定发酵最适pH；Mg^2＋的作用促进糖吸收，减轻不利环境因素对细胞的影响；Ca^2＋在生长过程中被细胞主动吸收，与细胞壁蛋白结合；减轻不良环境对细胞的影响；抵消亚适量Mg^2＋的抑制与促进；Zn^2＋是糖酵解及某些维生素合成必需的无机离子，pH<5时吸收减慢，吸收一个Zn^2＋，释放2个K^＋；Mn^2＋与调节Zn^2＋的作用有关，促进蛋白质的合成；Fe^2＋、Fe^3＋位于许多酵母蛋白的活性部位；Na^＋靠被动扩散进入细胞，促进某些糖的吸收；Mo^2＋、Co^2＋在低浓度时促进生长。

六、酵母抑制机理及酒精发酵中止

1．酵母抑制机理

糖和乙醇都是抑制酵母活动的因素。高浓度的糖限制酵母的生长量；乙醇在酵母细胞中的积累也使酵母停止生长。在酒精发酵的条件下，酵母细胞内的乙醇浓度变化相对较小；如果基质中含有类固醇，则酵母细胞内乙醇浓度比对照(不含类固醇)高出两倍，且被发酵的糖量更多；与酵母细胞内的乙醇浓度相反，在繁殖阶段，酵母细胞内己糖浓度不停地降低。在衰减阶段后期，果汁中糖继续被转化为乙醇。这表明酵母细胞的酶仍保持高度的活性，此时发酵速度的降低，主要是由于糖通过酵母细胞壁渗入细胞内出现障碍造成的。类固醇，特别是麦角甾醇，在酒精发酵过程中作为生存素而起作用。它通过影响磷脂的性质，从而调节细胞膜的生理状态和渗透性。

酵母生长停止和发酵速度减缓，与细胞中甾醇的消失相一致。如果在果汁加入甾醇，则可增加酵母细胞中甾醇的浓度，从而提高酵母群体的生活力和发酵速度。酵母细胞中甾醇的缺乏，引起细胞膜生理状态和透性的改变，从而影响酵母细胞与基质之间的物质交换，导致发酵速度减缓或中止。

2．酒精发酵的中止

大多数浆果中含有酵母菌生长繁殖所需的所有物质。一般而言，只要浆果的含糖量不过高，在入罐时接种10⁶CFU/L的酿酒酵母，酒精发酵就会很容易启动，并且顺利完成。但是，有很多因素可以影响酵母的生长和酒精发酵进程。这些因素包括微生物因素、物理化学因素等。如果酒精发酵出现困难，一些不需要的微生物，即致病性微生物就会活动，从而抑制酿酒酵母。物理化学因素包括营养的缺乏、发酵抑制剂、给氧、温度和果汁澄清等。多数情况下，是由于多种因素的共同作用，导致酒精发酵的困难和中止。

由原料的入罐温度和含糖量、发酵容器的种类(大小和材质等)引起的温度低或过高，会导致发酵中止。入罐温度过低，会限制酵母的生长，导致酵母群体数量过低，而且在温度较低的情况下，酵母对温度突变的适应性很差；所有加速发酵进程的处理，如加糖、通气等，都会引起温度的升高；发酵温度一般不能超过30℃，而且升温越早，其抑制作用越大，发酵起始温度应较低，为20℃。果汁或果醪中的高含糖量本身就对酵母菌有抑制作用，在酒精发酵过程中形成的酒精，更加重了它的抑制。如果在发酵过程中加糖(提高酒度)太迟，已经受酒精影响的酵母，就很难继续其代谢活动。严格的厌氧条件不利于酵母菌的活动，在酒精发酵过程中的通气，可加快其速度，而且在发酵开始时，即在酵母的繁殖阶段，就应通气。此外，固醇和长链脂肪酸也可加快发酵速度。营养的缺乏，包括氮素、脂类、生长素和矿物营养的缺乏，会影响酵母的活动。在一些特殊情况下，给氧结合添加铵态氮，可取得良好的效果。含有农药的浆果原料以及霉变原料中由一些灰霉菌产生的物质，可抑制酵母的活动。此外，还有其他一些因素影响酒精发酵的进程，如酵母的代谢副产物、果汁的澄清处理、pH过高、酵母接种量不够、接种太迟、CO₂排除不良等。

3．预防发酵中止

除环境、设备应保持良好的卫生状况外，应及时对原料进行二氧化硫处理，以防止致病性微生物的活动。为了防止野生酵母的活动，必须及时添加酵母，对于清汁发酵的果酒，应在澄清后立即添加；对于带皮发酵的果酒，在二氧化硫处理12h后添加。在入罐时适量加NH₄HSO₃，不仅可产生SO₂，还可为酵母菌提供可同化氮。对于缺氮原料，氮素的补充在发酵开始(相对密度为1.050～1.060)时，最为有效，可结合开放式倒罐和加糖(如果需要)添加。对于清汁发酵的果酒，对果汁的澄清处理不能过度，在澄清时加入适量的果胶酶可获得澄清度适当的果汁，如果澄清过度加入适量的纤维素，有利于果汁的发酵。在发酵过程中每天1.5～2倍(原料的量)的开放式倒罐有利于酵母菌的活动，在此期间由于CO₂的释放，没有氧化的危险，也可通过微量喷氧的方式(10mg/L果汁)对发酵汁给氧。研究结果还表明，当这些果汁发酵进行到一半时，加氧(7mg/L)结合加磷酸氢二铵[300mg/L(NH₄)₂HPO₄]，能有效地防止发酵中止。添加酵母菌皮或死酵母，也有利于发酵的完成。

4．发酵中止时的处理

在发酵过程中，很容易观察到发酵中止，如果24～48h发酵汁的密度不再下降，就表示有发酵中止的危险。在这种情况下，可有多种措施促使发酵重新启动，防止致病性微生物的活动。在发酵中止时，必须尽快将果汁封闭分离到干净的发酵罐。即使浸渍不够，也要分离。分离有利于防止细菌的侵染及对发酵汁通气和降低发酵汁温度。在分离时进行30～50mg/L SO₂处理，以防细菌的活动。这样处理后，有时会自动再发酵。

如果再发酵不能自然启动，就必须添加酒母。同时将发酵中止的果汁添满、密封。必须强调的是，如果发酵汁中已有8%～9%(体积分数)的酒度，直接添加活性酵干母是没有用的。

制备酒母的方法如下：取5%～10%发酵中止的果汁，将其酒度调整为9%(体积分数)、含糖量调整为15g/L，并添加30mg/L SO₂，然后加入200mg/L抗酒精能力强的活性干酵母，在20～25℃进行发酵。当糖接近耗尽(相对密度低于1.000)时，按5%～10%的比例加入发酵中止果汁中，以启动再发酵。也可以1∶1的比例将发酵中止的果汁加到酒母中，使混合汁进行发酵。当其相对密度降至低于1.000时，再将发酵中止果汁按1∶1的比例混合。直至所有果汁发酵结束。

对发酵中止果汁进行瞬间巴氏杀菌，即在20s内将果汁的温度升至72～76℃，可以改善果汁的可发酵性。在杀菌后，待温度降低到20～25℃，再加酵母进行再发酵。在再发酵过程中，加入0.5mg/L泛酸，既可防止挥发酸的升高，又能使已经过高的挥发酸消失。当然，加入低于50mg/L硫酸铵也有利于再发酵的进行。

需要强调的是，发酵中止后，即使是最好的再发酵，也会严重影响果酒的质量。所以，必须采取适当的措施，预防酒精发酵的中止。

七、发酵的酒精产率

计算果汁中发酵时来自糖的酒精产量的基础是酒精(乙醇)和二氧化碳是两个主要的产物，但不是全部的产物。在发酵期间，糖被分解成为酒精和二氧化碳，并有一系列有利于酵母生长的其他次生物质的生成。在完全发酵的情况下，1000g转化糖(葡萄糖和果糖)大约产生480g酒精，这与温度、通气和酵母种类有关。所依据的乙醇产量公式是由盖-吕萨克在1810年提出的，如下所示：

例如，1L含20.0%糖(以化学分析方法测得，以还原糖计)的果汁可以通过发酵产生96.3g或12.20%体积分数的酒精，后面的数字是通过质量百分比除以酒精相对密度(0.7893)得到的。这个数值是在假设酒精最小蒸发量，酵母没有产生多余的其他副产物，不通气及低温发酵的情况下测出的平均值。然而，果醪中的糖经常用液体比重计，如波美度计、白利度计。例如：22.0°Bx为12.2°Bé，这种液体比重计测量的是总的可溶性固形物的读数，果汁或果醪中的糖是其主要部分。但是实际还原糖大约比白利度读数要平均低2%或20g/L，比波美计读数低1.1。波美度和酒精产量的关系因不同的波美度高低而不同，在10～12°Bé范围内，将产生与波美度几乎相同数量体积分数的酒精。这就是为什么酿酒师的速算方法是调节1°Bé来增产1%体积的酒精。但是由于果醪中还原糖并不能由液体比重计准确地测得，任何用液体比重计得到的果汁中的酒精产量都是近似数值。因此，准确的测量方法是用化学法检测果汁中的糖含量，然后由以上列出的数据与公式进行计算。