2.4　污水生物指标测定

2.4.1　如何测定污水的大肠菌群数？

（1）稀释

①以无菌操作将检样25g （mL）放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。

②用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1∶100的稀释液。

③另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释1次，换用1支1mL灭菌吸管。

④根据对检样污染情况的估计，一般选择3个稀释度，每个稀释度接种3管。

⑤乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3管，置36℃±1℃培养箱内，培养24h±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告大肠菌群阴性，如有产气者则继续做以下实验。

（2）分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃培养箱内培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰染色和证实试验。

（3）证实试验

在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰染色，同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃培养箱内培养24h±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

（4）报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL （g）大肠菌群的MPN值。

2.4.2　如何测定污水的病毒数？

有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度：VP （病毒颗粒）或OPV （光学颗粒单位）；GTU （基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）；PFU （空斑形成单位）；TCID50 （50%组织培养感染剂量）。

不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。

①测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×10¹²个病毒颗粒。用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。

② GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。

③ PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。一般来说，这种方法得到的结果很少能在其他实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。

④ TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。

所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。

2.4.3　如何测定污水的菌落总数？

菌落总数计数的研究已有很多，目前国标规定的方法为平板计数法，其检验方法是：在玻璃平皿内，接种1mL水样或稀释水样于加热液化的培养基中，冷却凝固后在37℃培养24h，培养基上的菌落数或乘以水样的稀释倍数即为菌落总数。有的国家把培养温度定为35℃或其他温度，也有把培养时间定为48h的。这种方法精度高，但耗时长，难以满足实际工作需要。为了简化检测程序、缩短检测时间，国内外学者进行了大量的快速检测方法的研究，提出了阻抗检测法、Simplate TM全平器计数法、微菌落技术、纸片法等检测方法，取得了一定的成果，但检测时间仍在4h以上。

2.4.4　城镇污水处理厂生物指标排放标准是多少？

表2-5为城镇污水处理厂污染物排放标准（GB 18918—2002）规定的三级排放标准的生物指标。