一、离心技术

离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。颗粒的沉降速度取决于离心机的转速及其自身与中心轴的距离。不同大小、形状和密度的颗粒会以不同的速度沉降。

悬浮在液体中的固相颗粒的运动速度取决于重力。液体中的颗粒处在重力场内时，如在一支平稳的试管内，将会受到地球的重力作用而运动。离心的效果主要受以下因素的影响。

（1）固液相对密度的差别。相对密度小于液相的颗粒悬浮在上面，相对密度大于液相的颗粒则沉淀下来。

（2）颗粒的大小与形状。

（3）沉降介质的黏滞力。

（一）离心力的计算

离心机的加速度通常以重力加速度（g=9.80m/s2）的倍数来表示，称为相对离心力RCF（或“g值”）。RCF取决于转子的转速n（单位为r/min）和旋转半径r（单位为cm），可用如下公式表示：

RCF=1.119×10-5n2r

上式变形后，在已知r和RCF值时可以用来计算转速：

一般情况下，低速离心时常以转速“r/min”来表示，高速离心时则以“g”表示。计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与旋转轴中心的距离“r”不同，即沉降颗粒在离心管中所处位置不同，则所受离心力也不同。因此在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“×g”代替每分钟转数“r/min”，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。

（二）离心分离的方法

1.差速沉降（沉淀）法

将一混合悬浮液以一定的RCF离心一定的时间后，混合物将会被分为沉淀和上清液两部分（见图2-1）。①离心前盛在离心管内的是含有大、中、小三种颗粒的悬浮液；②低速离心后，沉淀主要由最大的颗粒组成；③进一步用高速离心上清液，得到主要由中等大小颗粒组成的第二种沉淀；④最后一步离心把余下的小颗粒沉淀下来。

差速沉降法主要用于分离细胞器和病毒，在各类分子生物学实验中还被应用于基因组DNA、质粒DNA以及RNA等遗传物质的初级分离。其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；③颗粒会被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。这些效应在实验中往往会导致细胞器的破裂、基因组DNA的断裂等。所以在应用差速沉降离心法分离时必须严格控制离心的速度与时间，以期在最大程度上防止负效应的产生。

进行差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其他成分，需经过2～3次的再悬浮和再离心，才能得到较纯的颗粒。

2.密度梯度离心法

密度梯度离心法简称区带离心法，是样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法（见图2-2）。其原理是利用离心力使样品混合物中具有不同密度的组分沿着介质的梯度移动，最终停留在与其密度相等的介质区域。

该法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适用范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。其缺点是：①离心时间较长；②需要制备梯度；③操作严格，不易掌握，且在离心完成后，样品往往需要用穿刺法吸出，操作较为复杂。在生物化学实验中，密度梯度离心法主要用于分离那些由于密度或沉降系数相似从而用差速离心法难以分离的物质，例如，同一组分中DNA与RNA的分离、同一组分中线性DNA与超螺旋DNA的分离。

下列技术使用了密度梯度，即离心试管中的溶液从管顶到管底密度逐渐增加。

（1）差速区带离心法 将样品置于平缓的预先制好密度梯度的介质上进行离心，较大的颗粒将比较小的颗粒更快地沉降通过梯度介质，形成几个明显的区带（条带）。这种方法有时间限制，在任一区带到达管底之前必须停止离心。差速区带离心法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒，与密度无关。大小相同、密度不同的颗粒（如溶酶体、线粒体和过氧化物酶体）不能用本法分离。离开原样品层，按不同沉降速率沿管底沉降。离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带。沉降系数越大，往下沉降得越快，所呈现的区带也越低。沉降系数较小的颗粒，则在较上部分依次出现。从颗粒的沉降情况来看，离心必须在沉降最快的颗粒（大颗粒）到达管底前或刚到达管底时结束，使颗粒处于不完全的沉降状态而出现在某一些特定的区带内。

在离心过程中，区带的位置和形式（或带宽）随时间而改变。因此，区带的宽度不仅取决于样品组分的数量、梯度的斜率、颗粒的扩散作用和均一性，也与离心时间有关。时间越长，区带越宽。适当增加离心力可缩减离心时间，并可减少扩散导致的区带加宽现象，增加区带界面的稳定性。

（2）等密度离心法 当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移动到与它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）形成区带，称为等密度离心法。等密度离心的有效分离取决于颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒的大小和形状无关。但后两者决定着达到平衡的速度、时间和区带的宽度。颗粒的浮力密度不是恒定不变的，还与其原来密度、水化程度及梯度溶质的通透性或溶质与颗粒的结合等因素有关。例如某些颗粒容易发生水化使密度降低。

这种技术根据浮力密度的不同分离物质。其分辨率受颗粒性质（密度、均一性、含量）、梯度性质（形状、黏度、斜率）、转子类型、离心速率和时间的影响。颗粒区带宽度与梯度斜率、离心力、颗粒相对分子质量成正比。几种物质可通过离心法形成密度梯度（如蔗糖、葡萄糖等）。将样品与适合的介质混合后离心——各种颗粒在与其等密度的介质带处形成沉淀区带。这种方法要求介质梯度应有一定的陡度，要有足够的离心时间形成梯度颗粒的再分配，进一步离心对其不会有影响。

可以使用一根细的巴氏滴管或带有细长针头的注射器来收集某个密度梯度内的条带。另一种方法可将试管刺穿，将内容物分段逐滴收集到几个管中。

3.分析性超速离心

分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组分，因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。

（1）分析性超速离心的工作原理 分析性超速离心机主要由一个椭圆形的转子、一套真空系统和一套光学系统所组成（见图2-3）。该转子通过一个柔性的轴连接成一个高速的驱动装置，此轴可使转子在旋转时形成自己的轴。转子在一个冷冻的真空腔中旋转，可容纳两个小室：分析室和配衡室。配衡室是一个经过精密加工的金属块，作为分析室的平衡用。分析室的容量一般为1mL，呈扇形排列在转子中，其工作原理与一个普通水平转子相同。分析室有上下两个平面的石英窗，离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察到小室中正在沉降的物质，可以通过对紫外线的吸收（如对蛋白质和DNA）或折射率的不同对沉降物进行监视。后一方法的原理是：当光线通过一个具有不同密度区的透明液，在这些区带的界面上产生光的折射。在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就像一个折射的透镜，结果在检测系统的照相底板上产出一“峰”。由于沉降不断进行，界面向前推进，故“峰”也在移动，从峰移动的速度可以得到物质沉降速度的指标。

（2）分析性超速离心的应用

①测定生物大分子的相对分子质量。测定相对分子质量主要有三种方法：沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。其中应用最广的是沉降速度。超速离心在高速中进行，这个速度使得任意分布的粒子通过溶剂从旋转的中心辐射地向外移动，在清除了粒子的那部分溶剂和尚含有沉降物的那部分溶剂之间形成一个明显的界面，该界面随时间的移动而移动，这就是粒子沉降速度的一个指标，然后用照相记录，即可求出粒子的沉降系数。

②生物大分子的纯度估计。分析性超速离心已广泛地应用于研究DNA制剂，病毒和蛋白质的纯度。用沉降速度的技术来分析沉降界面是测定制剂均质性的最常用方法之一，出现单一清晰的界面一般认为是均质的，如有杂质则在主峰的一侧或两侧出现小峰。

③分析生物大分子中的构象变化。分析性超高速离心已成功地用于检测大分子构象的变化，例如DNA可能以单股或双股出现，其中每一股在本质上可能是线性的，也可能是环状的，如果遇到某种因素（温度或有机溶剂）DNA分子可能发生一些构象上的变化，这些变化也许可逆、也许不可逆，这些构象上的变化可以通过检查样品在沉降速度上的差异来证实。

（三）离心机的类型

离心机的类型如表2-1所示。

（四）转子

许多离心机可以配用不同大小的离心管，只需要改变转子或使用一个与不同的吊桶/适配器相配的转子。

（1）水平转子 盛样品的离心管放在吊桶内，以转子的加速度运转［见图2-4（a）］。水平转子用于低速离心机，其主要缺陷是延长了沉淀的路径。同时，减速过程中产生的对流会引起沉淀物的重新悬浮。

（2）角式转子 许多高速离心机及微量离心机安装有角式转子［见图2-4（b）］。由于沉降路径短，沉淀颗粒时角式转子比水平转子的效率更高。

（3）垂直管转子 用于高速及超高速离心机进行等密度梯度离心时［见图2-4（c）］。这种转子在沉淀没有形成之前不能用来收集悬浮液中的颗粒。

（五）离心管

离心管有各种大小（1.5～1000mL），所用材料也不一，下面是选择离心管时应考虑的一些性能：

（1）大小 由样品的体积决定。注意在有些应用中（如高速离心）离心管必须装满。

（2）形状 收集沉淀时，用圆锥形管底的离心管较好，而进行密度梯度离心时常用圆底试管。

（3）最大离心力 详细信息由厂家提供。在进行分子生物学实验中尤其要注意离心管的最大离心力，以免在高速离心时离心管破裂造成实验失败。

（4）耐腐蚀性 玻璃管是惰性物质，聚碳酸酯管对有机溶剂（如乙醇、丙酮）敏感，而聚丙烯具有更好的耐腐蚀性。详细信息可参考厂家的说明书。

（5）灭菌 一次性塑料离心管出厂时通常是消过毒的。玻璃管及聚丙烯管可重复灭菌使用。多次高压灭菌可能会导致聚碳酸酯崩裂或变形。

（6）透明度 玻璃管和聚碳酸酯是透明的，而聚丙烯管为半透明的。

（7）能否刺穿 若想用刺穿管壁的方法收集样品，通常聚丙烯管易于用注射管针头刺穿。

（8）密封性 离心管一般利用管帽保持系统的密封性。大多数角式及垂直管式转子要求离心管有管帽，用以防止使用过程中样品漏出并在离心过程中支撑离心管，防止其离心时变形。对于放射性样品，即使是低速离心也一定要盖管帽，并且要使用与所用离心管配套的管帽。

（六）平衡转子

为确保离心机的安全运转，使用时必须平衡转子，否则转轴及转子组件可能会损坏，严重时转子可能会停转，造成事故。当离心转速达5×104r/min时，如对称管相差1g，转头半径5cm，则根据离心力公式：F=m·RCF，离心机两边产生的不平衡将达到1470N（150kgf）。使用前平衡离心管至关重要，通常的原则是用托盘天平平衡所有样品管，差值控制在1%以内或更少。把平衡好的试管成对放在相对位置上。绝不可以用目测来平衡离心管。

在差速离心实验中向离心管中添加样品时，样品的容量不得超过离心管容量的2/3，这是为了防止离心管内的液体在高速离心过程中产生外溢，导致离心系统失去平衡并产生污染。

（七）安全措施

高速与超速离心机是生化实验教学和生化科研的重要精密设备，因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时必须严格遵守操作规程。

（1）使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心试管和其内容物，平衡时质量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。

（2）装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管。有的离心管无盖，液体不能装得太多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干。转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤害。转头长时间不用时，要涂上一层上光蜡保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。

（3）若要在低于室温的温度下离心时，转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。

（4）离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。

（5）如果在离心中出现由诸如离心管破裂等原因导致的不平衡现象，必须首先立即关闭离心机的开关，使离心机停止转动，等待转子完全停止后方可取出样品。切忌在离心机尚在工作时切断电源，这将导致离心机瞬间停转，可能会导致严重的事故。

（6）每个转头各有其最高允许转速和使用累计限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。每一个转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。