第二节　大肠杆菌DNA的复制合成

原核生物基因组DNA呈共价闭合环状，复制过程比真核生物简单。我们以大肠杆菌K-12株为例介绍原核生物DNA的复制。

一、参与DNA复制的酶和其他蛋白质

大肠杆菌DNA的复制是由30多种酶和其他蛋白质共同完成的，主要有DNA聚合酶、DNA解旋酶、DNA拓扑异构酶、引物酶和DNA连接酶等。

（一）DNA聚合酶

DNA聚合酶（DNA polymerase，POL）全称DNA依赖的DNA聚合酶（DNA-dependent DNA polymerase，DDDP），又称DNA复制酶，作用是催化以dNTP为原料合成DNA。

1.DNA聚合酶催化特点　DNA聚合酶催化的合成反应有以下特点。

（1）需要模板　DNA聚合酶催化的反应是DNA复制，即合成单链DNA的互补链，该单链DNA称为模板。

在中心法则中，模板（template）是指可以指导合成互补链的单链核酸。模板可以是DNA 或RNA，其指导合成的单链核酸可以是DNA或RNA。DNA模板指导DNA合成称为DNA复制，DNA模板指导RNA合成称为转录，RNA模板指导RNA合成称为RNA复制，RNA模板指导DNA合成称为逆转录。

（2）需要引物　DNA聚合酶不能催化两个dNTP形成3′，5′-磷酸二酯键，只能催化一个dNTP的5′-α-磷酸基与一段（或一股）核酸的3′-羟基形成3′，5′-磷酸二酯键，并且这段核酸必须与模板DNA互补结合。这段核酸称为引物（primer）。引物可以是DNA，也可以是RNA。引导大肠杆菌DNA复制的引物都是RNA。

（3）以5′→3′方向催化合成DNA　这是由DNA聚合酶的催化机制决定的。DNA合成的基本反应是由引物或新生链的3′-羟基对dNTP的α-磷酸基发动亲核攻击，形成3′，5′-磷酸二酯键，并释放出焦磷酸（图2-6）。

2.大肠杆菌DNA聚合酶种类　大肠杆菌DNA聚合酶有五种，分别用罗马数字编号，其中DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的结构和功能研究得比较明确（表2-1）。

（1）DNA聚合酶Ⅰ（POLⅠ）　由Kornberg（1959年诺贝尔生理学或医学奖获得者）于1956年发现，由一条928AA的肽链构成，是一种多功能酶，有三个不同的活性中心：5′→3′外切酶活性中心（Met1～Thr323）、3′→5′外切酶活性中心（Val324～Gln517）和5′→3′聚合酶活性中心（Gly521～His928）。Klenow用枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）水解DNA聚合酶ⅠThr323 和Val324之间的肽键，得到两个片段。其中大片段（Val324～His928）称为Klenow片段、克列诺片段、克列诺酶，含3′→5′外切酶活性中心和5′→3′聚合酶活性中心；小片段（Met1～Thr323）含5′→3′外切酶活性中心（图2-7）。DNA聚合酶Ⅰ活性低，延伸能力弱，主要功能不是催化DNA复制合成，而是在复制过程中切除RNA引物，合成DNA填补缺口（gap）。此外，DNA聚合酶Ⅰ还参与DNA修复。

（2）DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）　有5′→3′聚合酶活性中心和3′→5′外切酶活性中心，但没有5′→3′外切酶活性中心。DNA聚合酶Ⅱ的功能可能是参与DNA修复。

（3）DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）　是一种多酶复合体，全酶由两个核心酶（αεθβ2）和一个γ复合物（γτ2δδ′χψ）构成（图2-8）。①在核心酶中，α亚基含5′→3′聚合酶活性中心；ε亚基含3′→5′外切酶活性中心；β2称为β夹子（clamp），赋予DNA聚合酶Ⅲ最强的延伸能力；θ亚基可能起组装作用。②在γ复合物中，γτ2δδ′复合物称为β夹子装置器（clamp loader），可以控制β夹子开合以夹住或释放DNA。χψ作用于单链DNA结合蛋白（37页）。DNA聚合酶Ⅲ活性最高，是催化DNA复制合成的主要酶。

（4）DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ（PolⅣ、Ⅴ）　发现于1999年，主要参与DNA修复（跨损伤合成）。

3.大肠杆菌DNA聚合酶功能　大肠杆菌DNA聚合酶各个活性中心有不同的功能。

（1）5′→3′聚合酶活性中心与延伸能力　评价一种DNA聚合酶的活性通常要看它每秒钟催化连接的核苷酸数和它的延伸能力。DNA聚合酶在催化连接核苷酸时一直结合在新生链的3′端，一旦有dNTP进入活性中心并与模板碱基配对，便催化连接，这一特点称为DNA聚合酶的延伸能力（processivity），它通常定义为DNA聚合酶结合在新生链3′端可以连续催化连接的核苷酸数。不同DNA聚合酶的延伸能力有很大差别，有的结合一次只能连接几个核苷酸，而有的结合一次可以连接上万个核苷酸。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ的延伸能力最强。

（2）3′→5′外切酶活性中心与校对功能　DNA聚合酶的3′→5′外切酶（exonuclease）活性中心与5′→3′聚合酶活性中心相距约3nm，可以切除新生链3′端不能与模板形成Watson-Crick碱基配对的核苷酸。因此，在DNA合成过程中，一旦连接了错配核苷酸，聚合反应就会中止，错配核苷酸进入3′→5′外切酶活性中心并被切除，然后聚合反应继续进行，这就是DNA聚合酶的校对（proofreading）功能。

（3）5′→3′外切酶活性中心与切口平移　仅DNA聚合酶Ⅰ有5′→3′外切酶活性中心，而且只作用于双链核酸。因此，如果双链DNA中存在切口（nick），DNA聚合酶Ⅰ可在切口处催化两个反应：一个是水解反应，从5′端切除核苷酸，每次可连续切除约10个核苷酸；另一个是聚合反应，在3′端延伸合成DNA。结果反应过程像是切口在移动，故称切口平移（nick translation，图2-9）。在切口平移过程中被水解的可以是RNA引物，也可以是损伤DNA。

DNA聚合酶Ⅰ的切口平移作用有两个意义：①在DNA复制过程中切除后随链冈崎片段5′端的RNA引物，并合成DNA填补，即切除较早合成的冈崎片段1的RNA引物，延伸合成较晚合成的冈崎片段2（图2-15）。②参与DNA修复。此外，在核酸杂交技术中，DNA聚合酶Ⅰ常用于通过切口平移标记探针（第十一章，275页）。

（二）解链、解旋酶类

DNA有超螺旋、双螺旋等结构，在复制时，作为模板的亲代DNA需要松解螺旋，解开双链，暴露碱基，才能作为模板，按照碱基配对原则指导合成子代DNA。参与亲代DNA解链，并将其维持在解链状态的酶和其他蛋白质主要有DNA解旋酶、DNA拓扑异构酶和单链DNA结合蛋白。

1.DNA解旋酶（DNA helicase）　作用是解开DNA双链。解链过程需要通过水解ATP提供能量，每解开一个碱基对消耗一个ATP。目前在大肠杆菌中已经鉴定到解旋酶DnaB、Rep、Ⅱ、Ⅳ和RecB等至少13种DNA解旋酶，其中解旋酶DnaB沿结合股5′→3′方向移动解链，参与DNA复制；解旋酶Rep、Ⅱ、Ⅳ沿结合股3′→5′方向移动解链，参与错配修复；解旋酶RecB既可沿结合股3′→5′方向移动解链，又可沿5′→3′方向移动解链，且有核酸外切酶活性，参与重组修复。

解旋酶DnaB是dnaB基因产物（471AA），形成同六聚体环结构，有依赖DNA的ATP酶（ATPase）活性。在DNA复制过程中，解旋酶DnaB同六聚体环套在复制叉的后随链模板上（图2-14），沿5′→3′方向移动解链，解链过程中会在前方形成正超螺旋结构，由DNA拓扑异构酶松解。

DNA复制始于复制起点。解旋酶DnaB与后随链模板的结合依赖染色体复制起始蛋白DnaA（467AA）、细菌组蛋白HU（αβ二聚体）和DNA复制蛋白DnaC（245AA）（表2-3）。

2.DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase） 在共价闭合环状DNA双螺旋中，两股链相互缠绕的次数称为连环数（linking number，Lk）。有相同一级结构、不同连环数的DNA分子称为拓扑异构体（topoisomer）。DNA拓扑异构酶简称拓扑酶，由Wang和Gellert发现，它们可以催化DNA双螺旋3′，5′-磷酸二酯键的断裂和形成，改变其连环数，形成拓扑异构体。

例如，一个只有B-DNA结构的1100bp环状DNA有110个螺旋，即连环数为110；如果由DNA拓扑异构酶松解10个螺旋，即连环数减至100，则可能成为A-DNA。改变前后的两种结构互为拓扑异构体。

大肠杆菌有四种DNA拓扑异构酶，分为两类，均参与DNA的复制、转录和重组及染色质重塑（表2-2）。

（1）Ⅰ型DNA拓扑异构酶　又称转轴酶（swivelase），有DNA拓扑异构酶1和DNA拓扑异构酶3两种，能消除超螺旋，即在双链DNA的某一部位将其中一股切断（不是水解），在消除超螺旋（改变连环数）之后再连接起来，使DNA呈松弛状态，反应过程不消耗ATP。

Ⅰ型DNA拓扑异构酶的催化机制——磷酸二酯键转移反应：①Ⅰ型DNA拓扑异构酶活性中心含酪氨酸残基（大肠杆菌DNA拓扑异构酶1为Tyr319，人为Tyr722）其羟基通过亲核攻击断开一股DNA特定的3′，5′-磷酸二酯键，形成切口。酪氨酸羟基以酯键与切口的5′-磷酸基结合。②另一股DNA穿过切口，使双链DNA改变一个连环数。③切口的3′-羟基通过亲核攻击取代酪氨酸羟基，重新与5′-磷酸基结合，形成3′，5′-磷酸二酯键（图2-10）。

（2）Ⅱ型DNA拓扑异构酶　有DNA拓扑异构酶2（又称DNA促旋酶，DNA gyrase）和DNA拓扑异构酶4两种，能在双链DNA的某一部位将两股链同时切断（不是水解），在消除超螺旋或使连环体解离（或形成，41页）之后再连接起来，反应过程消耗ATP。此外，DNA促旋酶还可以在DNA中引入负超螺旋。

Ⅱ型DNA拓扑异构酶的催化机制：Ⅱ型DNA拓扑异构酶是A2　B2四聚体，其中A亚基含切接活性中心，通过酪氨酸羟基（DNA促旋酶为Tyr122）催化反应，酪氨酸羟基的作用与Ⅰ型DNA拓扑异构酶基本一致。B亚基含ATPase活性中心，并负责引入负超螺旋。①钳住G片段。②结合ATP，钳住T片段。③切割G片段。④使T片段通过并进入DNA拓扑异构酶的中心孔。⑤G片段重新连接，ATP水解，T片段释放（图2-11）。

3.单链DNA结合蛋白（SSB） 又称单链结合蛋白、松弛蛋白。大肠杆菌DNA解链时，两股单链DNA会被SSB结合。SSB是ssb基因产物（177AA），活性形式是四聚体，其功能是，①稳定解开的DNA单链（覆盖约32nt），防止其重新形成双链结构。②抗核酸内切酶降解。

原核生物SSB与DNA的结合具有协同效应，当第一个SSB结合之后，其后SSB的结合能力可以提高103倍。因此，一旦结合开始，便快速扩展，直至结合全部单链DNA。此外，SSB并不是在DNA链上移动，而是通过不断的结合与解离来改变结合位点（滑行与步行）。

（三）引物酶

DNA复制需要RNA引物。RNA引物由引物酶催化合成。引物酶（primase）又称引发酶，属于RNA聚合酶，但对利福平不敏感。大肠杆菌的引物酶是DnaG，是dnaG基因产物（581AA）。游离的引物酶DnaG没有活性。当解旋酶DnaB联合其他复制因子识别复制起点并启动解链形成复制叉时，引物酶DnaG被解旋酶DnaB等募集，组装成引发体（primosome），并被激活，在后随链模板的一定部位（CT　G序列）合成RNA引物（ppp AG……），合成方向与DNA一样，也是5′→3′。RNA引物合成后可提供3′-羟基引发DNA合成。

（四）DNA连接酶

DNA聚合酶催化合成冈崎片段或环状DNA时会形成切口，需要DNA连接酶（DNA ligase）催化切口处的5′-磷酸基和3′-羟基缩合，形成磷酸二酯键。

DNA连接酶发现于1967年。大肠杆菌DNA连接酶是ligA基因产物（671AA）。它不能连接游离的单链DNA，只能连接双链DNA中的切口。连接反应由NAD+供能（真核生物和古细菌由ATP供能）。

大肠杆菌DNA连接酶的催化机制：①DNA连接酶先与NAD+反应，形成DNA连接酶-AMP（并释放烟酰胺单核苷酸NMN+，其中AMP的磷酸基与活性中心Lys115的ε-氨基结合）再将AMP转移给切口处的5′-磷酸基，形成5′-AMP-DNA，将5′-磷酸基活化。②切口处的3′-羟基对活化的5′-磷酸基进行亲核攻击，形成3′，5′-磷酸二酯键，同时释放AMP（图2-12）。

除DNA复制外，DNA连接酶也参与DNA重组、DNA修复等，还是重组DNA技术重要的工具酶。

二、复制过程

在大肠杆菌DNA的复制过程中，各种与复制有关的酶和其他蛋白因子结合在复制叉上，形成多酶复合体，称为复制体（replisome），催化DNA的复制合成。复制过程可分为起始、延伸和终止三个阶段。三个阶段的复制体有不同的组成和结构。

（一）复制起始

在复制起始阶段，一组酶和其他蛋白质从亲代DNA复制起点解链、解旋，形成复制叉，组装引发体。

1.复制起点　大肠杆菌染色体DNA的复制起点称为oriC，位于天冬酰胺合成酶和ATP合成酶操纵子之间，长度为245bp，包含两种保守序列（conserved sequence，DNA、RNA或蛋白质一级结构中的一些在进化过程中变化极小的序列）：①五段重复排列的9bp序列，是DnaA蛋白识别和结合区，故又称dnaA盒，共有序列（consensus sequence，一组DNA、RNA或蛋白质的同源序列所含的共有核苷酸序列或氨基酸序列）为TTA/TTNCACC（N为任意碱基）（图2-13），可以结合DnaA·ATP和DnaA·ADP。此外，9bp序列之间还存在三段DnaA蛋白识别和结合区，但不含上述9bp共有序列，也可以结合DnaA·ATP。②三段串联重复排列的13bp序列，是起始解链区，故又称DNA解旋元件（DNA unwinding element，DUE），富含AT，共有序列为GATCTNTTNTTTT。

大肠杆菌还有一种备用复制起点，称为oriH，仅在oriC不能启动复制时启用。

2.有关的酶和其他蛋白质　复制起始阶段至少需要9种酶和其他蛋白质（表2-3），它们的作用是从复制起点解开DNA双链，组装引发体前体（preprimosome），又称前引发复合物（prepriming complex）。

3.起始过程　①DnaA蛋白N端为ATPase结构域，C端为DNA结合域，与ATP形成复合物，6～8个DnaA·ATP结合于复制起点oriC的DnaA蛋白识别和结合区，并通过ATPase结构域相互结合，被DNA缠绕形成复合物。②HU蛋白与DNA结合，协助DnaA蛋白使起始解链区解链（消耗ATP），成为开放复合物。③两个解旋酶DnaB六聚体在十二个DnaC单体（有ATPase活性）的协助下与开放复合物结合，组装两个引发体前体（含1个PriC单体、1个DnaT单体、2个PriA单体、2个PriB二聚体、1个DnaB六聚体），沿着后随链模板5′→3′方向移动解链（消耗ATP），形成两个复制叉（图2-14）。

随着解链进行，引物酶DnaG被引发体前体的解旋酶DnaB等募集，组装成引发体，合成RNA引物。RNA引物使DnaC水解ATP并释放。解旋酶DnaB移动解链并使DnaA蛋白释放。单链DNA结合蛋白与单链DNA模板结合，DNA促旋酶则负责松解DNA双链因解链而形成的正超螺旋结构，或引入负超螺旋，以协助解链。

（二）复制延伸

DNA复制的延伸阶段合成前导链和后随链。两股链的合成反应都由DNA聚合酶Ⅲ催化，但合成过程有显著区别，参与DNA合成的蛋白质也不尽相同（表2-4）。

1.前导链的合成　复制启动之后，前导链的合成通常是一个连续过程。先由一个复制叉的引发体在复制起点处催化合成一段10～12nt的RNA引物，随后DNA聚合酶Ⅲ通过τ亚基与解旋酶DnaB结合，以dNTP为原料在引物3′端合成另一个复制叉的前导链。前导链的合成与其模板的解链保持同步。

2.后随链的合成　后随链的合成是分段进行的。当亲代DNA解开1000～2000nt时，先由引发体催化合成RNA引物，再由DNA聚合酶Ⅲ在引物3′端催化合成冈崎片段。当冈崎片段合成遇到前方引物时，DNA聚合酶Ⅰ替换DNA聚合酶Ⅲ，通过切口平移切除引物（RNase H参与降解RNA引物），合成DNA填补。最后，DNA连接酶催化连接DNA切口。如图2-15所示，DNA聚合酶Ⅰ通过切口平移切除引物1，同时延伸合成冈崎片段2填补，由DNA连接酶催化连接。

后随链合成的长号模型　DNA双链是反向互补的，而前导链和后随链是由一个DNA聚合酶Ⅲ复合体催化同时合成的，称为DNA的并行合成、协同合成。为此，后随链的模板必须形成一个突环（looping out），使后随链的合成方向与前导链一致，这样它们就可以由同一个DNA聚合酶Ⅲ复合体催化合成。DNA聚合酶Ⅲ不断地与后随链的模板结合、合成1000～2000nt冈崎片段、释放，再结合、合成、释放……（图2-16）。这一机制称为长号模型（trombonemodel）。

3.DNA复制过程中的保真机制　①5′→3′聚合酶活性中心对核苷酸的选择使其错配率仅为10-4～10-5。②3′→5′外切酶活性中心的校对进一步将错配率降至10-6～10-8（错配修复系统进一步将错配率降至10-9～10-10，53页）。

（三）复制终止

大肠杆菌环状DNA的两个复制叉向前推进，最后到达终止区（terminus region），形成连环体（catenane），又称DNA连环，在细胞分裂前由DNA拓扑异构酶4催化解离。

终止区包括两个复制叉的交会点和位于交会点两侧的10段终止序列（terminus sequence，Ter），其中逆时针复制叉的5段终止序列TerA～TerH位于交会点的顺时针复制叉一侧，而顺时针复制叉的5段终止序列TerC～TerJ位于交会点的逆时针复制叉一侧。显然，一个复制叉必须通过另一个复制叉的终止序列之后才能停止推进。这样，在oriC处解链形成的两个复制叉将在交会点会合（图2-17）。

使复制叉停止推进需要DNA复制终止区结合蛋白Tus（terminator utilization substance）的参与。Tus蛋白是tus基因产物（309AA），特异地识别并结合终止序列Ter的共有序列GTGTGGTGT，形成Tus-Ter复合物，阻止DNA解旋酶继续解链，从而使复制叉停止推进。Tus-Ter复合物只能阻止一个复制叉的推进，而每个复制周期也只需有一个Tus-Ter复合物起作用。因此，Tus-Ter复合物的作用是让先到达终止区的复制叉停止推进，等待与另一个复制叉会合。

两个复制叉在交会点相遇而结束复制，复制体解体，两股亲代链解开，但有50～100nt尚未复制，将通过修复方式完成。结果，两个闭环染色体DNA互相套成连环体，由DNA拓扑异构酶4催化解离（图2-18）。

DNA的复制速度相当快，在营养充足、生长条件适宜时，大肠杆菌DNA不到40分钟即可完成一次复制。大肠杆菌基因组DNA全长约4.6×106　bp，依此计算，每秒钟能掺入2000个核苷酸（事实并非如此，机制见42页）。

某些细菌、噬菌体、病毒线性DNA的末端后随链以蛋白质为引物，由其酪氨酸的羟基引发DNA合成。

三、原核生物DNA合成的抑制剂

一些抗生素通过抑制DNA合成杀死原核病原体。

1.喹诺酮类（quinolone） 例如环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星，通过作用于革兰氏阴性菌的DNA解旋酶和革兰氏阳性菌的DNA拓扑异构酶4而抑制DNA合成，对真核生物染色体DNA合成也有影响。

2.硝基呋喃类（nitrofuran） 例如呋喃妥因，被细菌摄取之后，由硝基呋喃还原酶还原成多种中间产物，攻击DNA、核糖体蛋白、呼吸链复合物、丙酮酸脱氢酶复合体等。

3.硝基咪唑类（nitroimidazole） 例如甲硝唑，被厌氧菌摄取并还原，还原产物与厌氧菌DNA结合，抑制其复制和转录。