第八节 自然水体中藻类的监测方法[1]

蓝藻暴发作为水体富营养化的一个直观表现，已经引起全世界的普遍关注。因此，对蓝藻在湖泊、水库和沿海地区的分布及数量进行检测，对于蓝藻暴发的预警预报、水资源保护、水环境治理、公共健康和安全，以及社会经济的发展有相当重要的作用。

目前，常用的蓝藻检测方法有显微镜细胞计数法、Chl a含量测定法、活体荧光分析法。

一、显微镜细胞计数法

显微镜细胞计数法是常用的藻类定量方法。利用显微镜进行藻类细胞计数时，将样品充分摇匀，然后吸取0.1ml样品注入0.1ml藻类计数框，在10×40倍或8×40倍显微镜下计数，计数100个视野或采用长条计数法进行计数，从而计算出1L水样中所含藻类的个数。显微镜细胞计数法所用的藻类计数框为特制的载玻片，上面有一个特定的体积为0.1ml的计数区，计数区细分为100个小格。但显微镜细胞计数法耗时费力，效率低，重现性差，精度较低，对分析人员经验要求较高，而且受分析人员的人为影响较大。

二、Chl a含量测定法

蓝藻细胞中含Chl a，无Chl b。Chl a是一类与光合作用有关的最重要的色素，Chl a吸收大部分的红光和紫光，在光合作用的光吸收中起核心作用，是表征浮游植物生物量的最常用指标。《太湖水环境综合治理总体方案》认为当水体中Chl a的含量超过40μg//L时即为蓝藻暴发（也有专家认为Chl a含量超过10μg/L）。目前，Chl a含量测定法主要有高效液相色谱法（HPLC法）、分光光度法、荧光光度法等。

这几种方法的使用建立在藻类中Chl a已被提取的基础上，目前，行业内所使用Chl a提取方法为国家环境保护总局《水和废水监测分析方法（第四版）》推荐的丙酮提取法。首先将采集到的水样进行过滤，然后将过滤后的滤膜低温干燥6～8h后，放入组织研磨器中与90%丙酮一起进行充分研磨，最后，用离心机进行离心，上层清液即为Chl a提取液。

（一）高效液相色谱法（HPLC法）

高效液相色谱法可对绿色植物提取液中的色素进行较全面的分离，并直接测定Chl a、Chl b和β-胡萝卜素的含量。MANTOURA等于1983年建立了分析海洋浮游植物光合色素组成的HPLC法；袁建平等研究发现在0～50mg/L范围内，Chl a浓度与峰面积呈良好的线性关系；刘仁沿等利用HPLC法分析了表层海水中Chl a含量，结果表明HPLC法灵敏度高，检测限为10μg/m³。HPLC法能够精确地测定各种光合色素的含量，但由于仪器昂贵，分析操作步骤繁琐，一般不能用于野外大量样品的快速分析。

（二）分光光度法

根据叶绿素提取液对可见光波段的吸收光谱，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，然后根据经验公式即可计算出提取液中各色素的含量。彭文彬等利用两种分光光度法分别测定水体中的Chl a含量，结果表明单色法更具有较好的稳定性和理论的符合性；余文永等研究发现在利用分光光度法测定Chl a含量时，为了确保分析结果的准确可靠，样品采集后应及时抽滤、分析，Chl a提取时应充分研磨，离心。分光光度法所需仪器设备简单、操作简单、应用广泛，但存在Chl a提取不完全、耗时长、步骤繁琐、室验结果平行性不好等缺点。

（三）荧光光度法

Chl a是一种在紫外光照射下可发射出红色荧光的物质，其荧光强度与Chl a浓度呈正比，因此可采用荧光光度法对Chl a进行定量分析。荧光光度法分为直接荧光法和同步荧光法。直接荧光法就是用分光光度法对Chl a提取液进行标定，然后取标定后的Chl a提取液，逐级稀释，配成浓度梯度的一系列Chl a溶液，采用荧光光度计测定一系列Chl a溶液的荧光强度，绘制Chl a浓度与荧光强度的标准曲线，根据测试样品的荧光强度，查阅绘制的标准曲线得到样品的Chl a浓度。由于Chl a的荧光激发和发射光谱与其他色素的光谱严重重叠，从而对Chl a的荧光测定产生干扰。同步荧光法是一种新型荧光分析技术，该方法同时扫描荧光光度计的激发和发射两个单色器波长，由测得的荧光强度信号对相应的激发波长（或发射波长）构成光谱图。唐尧基等建立了同步荧光法测定海水中Chl a含量的新方法，其线性范围为0～200μg/L，检出限为1.5μg/L。荧光光度法能够精确的测定Chl a的含量，特别是能够测定Chl a含量较低的样品，但分析过程中容易受其他色素衍生物的干扰。

三、活体荧光分析法

自20世纪70年代始，活体荧光分析法开始被海洋学家和湖泊学家广泛采用。活体荧光分析分为活体Chl a荧光分析、藻蓝蛋白和藻红蛋白活体荧光分析。活体Chl a荧光分析是利用荧光光度计发出的激发光通过不经任何处理的水样，从而引起活体藻细胞内的Chl a发出荧光，在根据活体Chl a荧光强度与Chl a浓度（萃取值）之间的正比关系确定水体中的Chl a浓度（萃取值）或根据活体Chl a荧光强度与藻类生物量之间的正比关系确定水体中的藻类生物量。水样的浮游植物中，不但蓝藻含有Chl a，其他藻类如绿藻、硅藻、褐藻等均含有Chl a，所以活体Chl a荧光分析技术虽然可以用于藻类的检测，但无法选择性的检测蓝藻的生物量，存在局限性。藻蓝蛋白和藻红蛋白分别主要存在于淡水的蓝藻中和海水的蓝藻中，是蓝藻特有的色素，由于其有特征性的光吸收谱及荧光光谱，常用来作为检测蓝藻的指标，因此藻蓝蛋白及藻红蛋白的数量在一定程度上可以反映蓝藻的生物量。活体荧光分析法相对于显微镜细胞计数法、Chl a含量测定法，不需对水样进行复杂处理，能够快速简便对水体进行检测，收集大量的数据，从而为水华的监测和预警提供有价值的信息（表3-3）。

上述方法各有利弊，有各自的适用场合，在藻类种类和数量测定中都是有意义的。其中，活体荧光分析无需前处理，可直接测定水体样品，实现现场智能监测藻类种类和数量，是唯一能同时实现藻类在线、快速、原位测量的方法。

四、国内外主要藻类检测仪器产品

我国的传统藻类监测方法还是以显微镜为主，在环境监测及生态研究的实际应用中，显微镜法费时费力、重现性差的问题严重制约了监测的质量与规模。目前能快速且在线测量藻的技术，主要是基于荧光光谱法的测量设备。活体荧光检测方法已经成为发展趋势，显示出越来越重要的地位，是未来发展的方向。

国外在藻类新型监测技术方面已经有几十年的历史，也形成了多家有实力的企业向科研和监测机构提供高可靠性的产品。其中，也有多家国外厂家的产品已经在太湖、滇池等主要蓝藻暴发地得到了应用，见表3-4。国内技术界也有多个重大科技专项项目对此展开了技术攻关和产品开发，并取得初步成绩。

作为国外产品的代表，德国BBE荧光藻类分析仪使用方便，不仅能实时测量Chl a，还能区分绿藻、蓝藻、棕藻（硅藻和腰鞭毛藻）及隐藻等五大主要种群的密度，但尚不能将甲藻和硅藻分开。基于同样的检测核心技术，BBE开发了实验室、在线和便携三大类实际产品，满足不同的应用场合。应用YSI等产品，一般认为荧光检测方法与显微镜法有很强的相关性。

国内藻类的新型监测技术的研发起步较晚，2000年后才开始提上日程，并在2007年太湖供水危机事件后大大加快。

中国科学院安徽光学精密机械研究所环境光学与技术重点实验室承担了国家高技术研究发展计划（“863”计划）项目（2007AA061502），也同时是国家重大科技专项。其研究成果为在线藻类监测技术，并成功地实现了不同藻类的区分。形成了相关专利：① CN102539394A 基于荧光法的水体藻类光合作用活性原位检测装置及方法；②CN101957320B便携式水下原位荧光仪光机系统。

环境监测部门利用该仪器可实现野外水体藻类的现场快速检测；自来水厂可将该仪器安装在入水口，在线监测水源地水体藻类浓度；藻类研究部门还可将其安装于浮标或者自动监测站上，对固定监测点水体藻类进行长期连续监测。

由常州罗盘星检测科技有限公司研制的手持式荧光比色仪，可用于藻类的活体监测，检测项目包括活体Chl a荧光分析及藻蓝蛋白、藻红蛋白活体荧光分析。针对自然水体中存在浊度、色度干扰等问题，开发了融合检测技术，很好地消除了干扰，使得现场测量的可靠大大提高。

更有意义的是操作人员利用同一台仪器，无需进行复杂的前处理，即可对水体中的氨氮（NH³—N）、总氮（TN）、总磷（TP）和化学需氧量（COD）等指标进行分析，同时可对藻类“水华”本身及其他形成的原因进行同步监测。此设备采用电池供电，小巧方便，操作简单快速，适用于基层监测人员在湖泊水库和水产养殖等场合的应用。

[1]：*本节由顾毅康编写，朱喜统稿。