真核细胞维持生命活动所需的正常物质代谢平衡主要有两条途径：泛素蛋白酶体途径和自噬（autophagy）溶酶体途径 ^［1］。前者以待降解蛋白质的泛素化为标志，通过蛋白酶体将其分解，主要是选择性地降解细胞内的短效蛋白质。细胞内的长寿命蛋白及受损的细胞器则主要通过后者降解。细胞自噬是进化过程中高度保守的自我保护机制，清除未折叠及错误折叠的蛋白质，保护细胞免受有害蛋白的毒性，并在清除蛋白质过程中产生脂肪酸和游离氨基酸给细胞提供能量。自噬现象最早是1956年Clark等观察到的，他们用电镜观察新生小鼠肾组织时发现细胞中含有大量具有膜性结构的致密体，而且其中常含有类似于线粒体等的胞质结构。Ashford和Porten于1962年也在人的肝细胞用电子显微镜观察到这一现象。自噬这一概念则首先由比利时科学家Christian de duve于1963年提出。但直到1993年酵母自噬相关基因的发现和酵母突变株模型的建立才使得自噬的机制研究有了极大进展。

在哺乳动物，根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，自噬可分为3种主要方式：巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperonemediated autophagy，CMA）。巨自噬中，胞浆中可溶性蛋白和坏死的细胞器被双侧囊泡膜所包裹形成自噬体（autophagosome），之后被溶酶体所降解。目前，巨自噬是研究比较深入的自噬形式，一般情况下没有特殊注明的自噬都是指巨自噬。微自噬是指溶酶体自身变形，进而包裹并逐渐吞噬胞浆中的底物，其过程与巨自噬类似，只不过包含底物的是自身内陷的溶酶体膜。CMA仅存在于哺乳动物细胞，由胞浆的分子伴侣如热休克蛋白（heat shock protein of 70kd，HSP70）识别底物蛋白分子的特定氨基酸序列（如KFERQ模序）并与之结合，形成分子伴侣-底物复合物，在溶酶体相关膜蛋白（lysosome-associated membrane protein type，LAMP）2A的协助下，转位至溶酶体腔内，经水解酶分解后被细胞再利用，不需要形成自噬体 ^［2］。

人为的分为四个阶段 ^［3，4］：①诱导（nucleation）：细胞在不同的自噬诱导因素刺激下，隔离膜在待降解的细胞器或蛋白质的周围形成；②自噬体形成（elongation）：随着隔离膜不断延伸，隔离膜完全包绕待降解的胞质成分，自噬体直径一般为300～900nm，平均500nm；③自噬溶酶体形成（fusion）：自噬小体与溶酶体结合形成自噬溶酶体（autopholysome）；④自噬体内容物降解（degradation）：溶酶体中的多种水解酶降解自噬体内膜及其包裹的内容物。

截至目前，已经克隆出36种自噬相关基因（autophagy related genes，Atgs）。其命名也从最初的Atg/Apg/Aut/Cvt，统一命名为Atgs。这些自噬基因在酵母和哺乳动物中有很好的保守性，是自噬发生必不可少的分子。几乎任何一种自噬基因的缺失或突变都会导致自噬异常。部分哺乳动物自噬相关基因见表34-1。

自噬在细胞中受到严密调控，使其能正常发挥稳定内环境的作用，并能对各种刺激应对自如。自噬调控是一个多信号通路、多步骤的调节过程，目前人们尚未完全掌握。现有研究结果提示以下通路发挥重要作用：

　mTOR是自噬调控的中心效应分子，能感受各种细胞信号的刺激，升高或降低自噬的水平。它是一类非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由哺乳动物单基因编码。mTOR稳定状态下主要存在于细胞质中，激活后进入胞核调控下游靶分子，包括真核细胞翻译起始因子（eIF-4E）结合蛋白1（4E-BP1）和核糖体40S小亚基S6蛋白激酶（p70 ^S6K） ^［5］。mTOR磷酸化抑制自噬的起始分子ULK1的功能，从而抑制自噬的发生 ^［6］。mTOR可形成mTORC1和mTORC2两种复合物。mTORC1包括mTOR、mLST8、PRAS40和Raptor（regulatory-associated protein of mTOR）。Raptor是西罗莫司药物敏感的组成成分，西罗莫司能够通过抑制mTOR而成为有效的自噬刺激物。mTORC2包括mTOR、mSin1、Rictor（rapamycin insensitive companion of mTOR）和Protor。mTORC1主要调控细胞生长、凋亡、自噬和能量代谢，mTORC2则主要参与细胞骨架的形成。mTORC1的上游通路包括：①单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（adenosine-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）/mTORC1信号通路。AMPK是细胞中一个能感受能量状态并调节代谢的一个蛋白激酶，在自噬调控中发挥重要作用 ^［7］。在饥饿或缺氧等ATP水平低下时，AMP的水平能被AMPK感受，从而活化AMPK，进而磷酸化TSC2（tuberous sclerosis proteins，一种肿瘤抑制蛋白，可以和Rheb GTP酶结合，避免后者对mTOR的活化），加剧TSC1/2对Rheb的抑制，最终使mTOR的活性被抑制，诱导细胞自噬水平的提高 ^［8］。TSC1/2复合物是二聚体，TSC1起稳定作用，TSC2能抑制mTORC1激活所必需的小GTP酶Rheb （Ras homolog enriched in brain），实现对mTORC1的抑制作用 ^［9］。AMPK还可直接磷酸化Raptor，抑制mTORC1，上调细胞自噬。②磷酸肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路。Ⅰ型PI3K激活使细胞内产生第二信使3-磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），在磷脂酰肌醇脂依赖性蛋白激酶1（PDK1）的协助下，激活Akt，抑制TSC1/2复合物，从而激活mTORC1，抑制细胞自噬。PI3K抑制剂3-甲基腺苷（3-MA）、渥曼青霉素（Wortmannin）和LY294002等能阻断或者干扰自噬体形成，被广泛用于自噬的研究。③Ras/丝裂原蛋白激酶的激酶（MEK）/细胞外信号调节激酶（ERK）。ERK能通过抑制TSC1/2的活性调节细胞自噬水平 ^［10］，但具体机制还不清楚。

　Beclin-1是酵母自噬基因Atg6/ Vps30的同源基因，是一个重要的候选抑癌基因，在自噬调节和肿瘤发生中起重要作用。Beclin-1蛋白含有BH3（Bcl-2-homology3）、中央螺旋区（CCD）和进化保守区（ECD）三个结构域。Bcl-2/Bcl-XL含有BH3受体，与Beclin-1竞争性结合，抑制Beclin-1诱导的细胞自噬。Beclin-1通过CCD 和ECD结构域与Ⅲ型PI3K结合，形成Beclin-1/Ⅲ型PI3K/ Vps15复合体，上调细胞自噬水平 ^［11］。

　P53是主要的抑癌基因之一，在细胞自噬过程中也发挥重要作用。细胞核内的P53能通过sestrin1/2蛋白激活AMPK-mTORC1信号通路，抑制mTORC1，上调自噬水平 ^［12］；P53还能通过激活抗凋亡蛋白Bcl家族（Bad、Bax、PUMA、BNIP3），解除其对Beclin-1的抑制作用上调自噬水平 ^［13］。并且P53可在细胞质和细胞核之间穿梭，双向调节自噬水平 ^［14］。

以往人们对于自噬的检测主要是对自噬体形态的直接观察和检测自噬体表面蛋白的标记。现在人们更加注重通过对自噬通路的调控并将它放到整个机体水平来全面评价自噬功能对细胞行为或机体功能的影响，如采用自噬抑制或激活剂、自噬相关基因的沉默/敲除或高表达等。透射电镜观察自噬体依然被认为是自噬检测的金标准。但电镜观察仅能证明自噬性结构的存在，没有特殊标记是难以区分自噬体、自噬溶酶体等不同成熟阶段结构的，更加不能反映自噬活性的强弱 ^［15］。基于此，Swanlund等 ^［16］提出了一种免疫金电镜技术来对电镜结果进行分析。通过图像分析软件自动测量所有自噬泡的面积，在结合其他检测方法的基础上，如果胞浆中自噬泡所占总面积比增加，可以说明自噬上调。

微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）是目前所知唯一在自噬体膜上表达的蛋白，在自噬体形成过程中LC3发生转化，即胞浆内的LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺偶联移位到胞膜形成LC3-Ⅱ，并定位于自噬体内膜和外膜。与其他定位于自噬体膜上的Atg蛋白不同的是LC3-Ⅱ始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合，因此LC3-Ⅱ水平可在某种程度上反映自噬体的数量。通过Western-Blot检测LC3蛋白时由于抗体敏感度不同（LC3-Ⅱ敏感度高于LC3-Ⅰ），用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ或LC3-Ⅱ/（LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ）表示不如单纯比较LC3-Ⅱ更能反映实际的自噬体水平 ^［17］。需要指出的是LC3-Ⅱ表达的多少并不意味着自噬活性的强弱。因为自噬是一个高度动态变化的过程，自噬体只是其过程中的一个中间结构，自噬增多可能是促自噬体形成因素增加，也可能是其下游通路受阻所致，在一个特定时间点观察到的自噬体数量是自噬产生和转化为自噬溶酶体之间平衡的结果。当细胞自噬活性很强、自噬体降解速度很快时，可能检测不出LC3-Ⅱ蛋白的表达，或表达很弱，这时将结果解释为自噬活性减弱显然是不合适的。把自噬体增多或减少误认为自噬活性的增强或减弱是对自噬最常见的认识误区 ^［18］。

鉴于此，目前人们较为推崇自噬流（autophagic flux）分析。自噬流是指自噬的流程，是一个动态连续的概念，涵盖自噬体形成、自噬性底物向溶酶体运送及在溶酶体内降解的整个过程 ^［19］。自噬流检测可通过构建红色荧光蛋白（RFP）-绿色荧光蛋白（GFP）-LC3串联体，在自噬诱导后自噬体和自噬溶酶体分别显示为黄色和红色标记，如果自噬流增加，两种颜色的点状聚集均增加；如果自噬体向自噬溶酶体成熟步骤受阻，黄色点状聚集增加而红色不增加，从而实现对自噬体向溶酶体转化步骤的监控 ^［20］。另一方法是在LC3蛋白转化实验同时加入溶酶体抑制剂（氯喹、bafilomycin A1、E64d等），通过比较溶酶体抑制剂存在和不存在情况下LC3-Ⅱ表达的差异来反映自噬体的降解。如果加入溶酶体抑制剂后LC3-Ⅱ表达明显增加，说明整个自噬流过程正常，而表达增多的那部分LC3蛋白实际上反映的是被溶酶体降解的自噬体。加入处理因素前后的差别变化可反映自噬活性的强弱，处理因素加入后此差别变大表示自噬增强，反之亦然 ^［21］。

自噬流概念的引入和检测方法的改进使人们将注意力从干预自噬体形成过程转移到自噬体的清除阶段。如果将细胞内受损的细胞器比做是“垃圾”，自噬流则为“清洁系统”，自噬产生过程为“垃圾清扫”，自噬清除过程为“垃圾焚化”，那么“垃圾”的堆积既可能是清扫量增加，也可能是焚化不力所致。因此，在评价自噬在机体病理生理过程中的作用时，在尽量减少细胞器受损等的前提下，综合考虑其形成和清除能力是必要的。某种程度上，增强自噬清除功能可能更有利于机体的损伤修复。

1985年，Braunwald和Kloner明确提出了心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）的概念。MIRI是指再灌注在改善心肌血供的同时可加重原本单纯心肌缺血所造成的损伤，表现为心律失常、心肌梗死面积扩大、持久性心室收缩功能低下等。在心肌再血管化的治疗过程中，MIRI是影响疗效的重要因素之一。有关MIRI的机制先后提出了能量代谢障碍、自由基损伤、钙超载、炎症反应等多种损伤机制学说。近年又发现了线粒体分裂融合、内质网应激和微小RNA作用等新的机制及防治靶点 ^［22］。自噬在MIRI过程中的作用也逐渐引起关注。正常心脏中存在低水平的自噬活动，但在极端的环境条件下，细胞启动自噬机制来清除受损细胞器，提高细胞对恶劣环境的耐受力 ^［23］。早在30多年前，Sybers等就有关于MIRI后的自噬体诱导产生的报道，研究者发现自噬体内部包含受损的细胞器。Decker等 ^［24］也于1980年研究发现自噬在MIRI中被激活，而且既可以被急性缺血诱导，又可以被慢性缺血诱导，再灌注过程自噬体的形成进一步增加。但有关研究结果并不一致，主要争议表现在：①心肌缺血时自噬是否上调？②自噬上调在心肌缺血再灌注时是否有利？

大量基于电镜下自噬体观察和Western Blot检测LC-Ⅱ等的相关研究分别采用体外细胞培养、离体心脏灌注和在体心肌缺血等模型，发现心肌缺血后自噬上调 ^［25-27］。然而French等 ^［28］利用GFP-LC3转基因小鼠发现慢性（24h）和急性（1h）缺血，再灌注4h，均未见梗死区和其周围有自噬现象的激活，事实上，梗死区周围心肌的自噬体较对照组减少。Loos等 ^［29］观察或许可以部分解释这种区别。他们采用培养的H9c-2细胞观察缺血的严重程度和持续时间对细胞生存的影响，发现“轻度”缺血引起凋亡并且上调自噬，ATP浓度上升；“中、重度”缺血引起细胞坏死，不发生自噬。缺血程度根据模型和种属不同而异，缺血时间和程度可能是否发生自噬的决定因素。

多数研究认为心肌缺血时的自噬起保护作用，对心肌细胞抗缺血损伤是有益的 ^{［25，30，31］}。其机制可能为：①为细胞提供能量，长寿命的蛋白经过自噬的降解后，产生氨基酸，通过三羧酸循环生成ATP ^［32］；细胞经过自噬降解产生脂肪酸，而脂肪酸可以作为线粒体呼吸的燃料，在缺血阶段的ATP缺失是诱导自噬的发生关键因素之一；②清除胞内错误折叠的长寿命蛋白，从而维持内质网的稳定，这些错误折叠蛋白对细胞有害 ^［33］；③通过自噬，维持线粒体的功能完整，缺血引起线粒体呼吸受到抑制，氧化应激能使ROS生成增多，进而诱导线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放，使凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）和线粒体细胞色素C的释放增多。mPTP是线粒体膜上的非特异性孔道，mPTP的开放在线粒体和细胞损伤中发挥重要作用。而自噬能清除损伤的线粒体，进而阻止促凋亡因子，细胞色素C和AIF释放，抑制凋亡的发生 ^［34］。

自噬对心肌细胞保护作用还反映在自噬与心肌缺血预处理（IPC）的密切关系上。Huang等 ^［35］利用mCherry-LC3转基因小鼠，采用缺血5分钟/再灌注5分钟，反复3次的在体IPC模型，发现在缺血危险区迅速出现自噬体荧光强度的增加。他们还利用Langendorff离体心脏灌注模型，采用同样的IPC方式，10分钟内就发现自噬作用增强。用重组Tat-ATG5K130R沉默Atg5基因抑制自噬后，IPC的保护作用消失。此外，在培养的HL-1细胞，UTP（与嘌呤受体结合，与腺苷的下游信号通路一致）、二氮嗪（可直接开放mitoK _ATP）、雷诺嗪（钠通道阻滞剂，干扰脂肪酸氧化）等心肌保护物质均可诱发自噬 ^{［36，37］}，而自噬的抑制使上述物质的保护作用丧失。以上研究提示自噬作用对IPC的保护作用是必需的。

有关自噬在缺血再灌注损伤中的作用则普遍认为是有害的。Matsui等 ^［38］的研究发现在MIRI的不同阶段由不同的信号转导通路参与自噬的调节过程，在缺血阶段，AMPK、mTOR对自噬的调节发挥作用，敲除AMPK的小鼠在缺血阶段，自噬水平显著减低；在再灌注阶段，Beclin-1的表达比缺血时高，而AMPK的表达却比缺血时显著降低。在心肌的缺血/再灌注过程中，有两条不同的信号通路：缺血阶段通过AMPK/mTOR信号转导通路，而在再灌注阶段是通过PI3K/Beclin-1途径。采用RNA干扰手段抑制Beclin-1可增加心肌细胞存活 ^［26］。后处理发挥的心肌保护作用伴随着Beclin-1表达的下降 ^［39］。然而，Hamacher-Brady等 ^［25］采用缺血/再灌注HL-1细胞模型，发现Beclin-1基因敲除引起心肌细胞凋亡，而上调Beclin-1可保护受损心肌，并且Beclin-1上调的保护作用可被重组Tat-Atg5K130R消除。造成这种差异的原因可能与实验模型及检测方法和检测时机不同有关。Ma等 ^［40］从自噬流角度观察发现再灌注引起的氧化损伤加剧自噬，使溶酶体相关膜蛋白2 （LAMP2，促进自噬溶酶体融合）下降。再灌注所致的氧化应激使Beclin-1（促进自噬体形成）积聚，抑制自噬溶酶体转录调节，自噬体清除发生障碍而在细胞内积聚，导致受损细胞器不能有效移除，形成恶性循环，使心肌细胞死亡增加。

自噬是把双刃剑，一方面可以维持细胞内环境的稳定，另一方面也可能与某些疾病的发生发展相关。在心肌缺血再灌注损伤过程中，适当诱发自噬有利于保护心脏功能，而自噬清除功能障碍却可能加重损伤。在研究过程中要特别注意不要将自噬体数量的增多误以为是自噬水平的上调。加强对自噬流作用的研究，探索其发生、发展及其调控因素、调节通路；掌握自噬流与细胞凋亡、细胞坏死的相互关系，进一步阐明自噬流在心肌缺血再灌注损伤中的作用，可为发现新的干预靶点提供思路。可以预见，深入研究自噬流及其影响因素包括各种药物对自噬流的影响将是未来的主要研究方向。