检测嵌合的基因标记及实验室方法随着造血干细胞移植的进展而演化发展。大致可分为生化方法、细胞遗传学分析和分子生物学分析三大类方法。

迄今已发现20多个血型系统，共400多种红细胞血型，人类个体红细胞血型表型至少在1×10 ⁹种以上，因而红细胞血型表型可以作为植入证据，广泛的红细胞抗原检测可以识别80%以上的同胞供、受者，交叉凝集和流式细胞仪检测敏感性可达0.1%～0.5%。但检测红细胞抗原的方法有一定局限性，因为：①红细胞寿命较长，红细胞抗原系统的检测结果易受移植前和移植后输血的影响；②在髓系植入良好的ABO血型不合的HSCT中，因溶血导致供者红细胞在受者血液循环中延迟出现，此时不宜采用红细胞抗原作为植入证据；③为了发现供、受者之间红细胞抗原差异，常须进行多个系统的红细胞血型检测。

仅适用于HLA不合的HSCT，但受移植后抗原表达及实验方法的限制，本方法的灵敏度仅可为25%～50%，且不能用于HSCT早期的检测。

由于目前对免疫球蛋白同种异型认识有限，其个体识别率尚低，此外，它仅能反映B淋巴细胞的植活状态，受血浆及免疫球蛋白制品输注的影响。

对某一个个体而言，来源于同一干细胞的细胞内同工酶酶谱是稳定的，因此，多种酶谱的组合可用于个体识别，而且可用于检测各种细胞系的植活状态。同工酶检查具有快速、灵敏和重复性好等特点，但对个体识别率低，不能用于所有HSCT供、受者，而且也受输血的影响。

传统的细胞遗传学分析采用中期细胞分裂相检测标志染色体，可用于HSCT早期植入的监测和多个细胞系的监测，且不受输血的影响。这种方法用于植入检测有一定局限：①仅适用于患者具有肿瘤的遗传学标记（如Ph ⁺标记染色体）或供、受者之间存在性别差异时；②费时费力；③染色体分析需要分裂细胞，而HSCT早期常找不到细胞分裂相。染色体检查结果的可靠性及灵敏度在很大程度上取决于所检测的分裂细胞数，如要获得99%可信限，至少要查300个分裂细胞方能发现1%水平的嵌合状态，而在HSCT后，尤其在移植早期，这几乎是不可能的。常规检查20～30个分裂细胞，只可获得14%左右的灵敏度（95%可信限）。对于Y染色体的分析采用Q带技术分析可以不需要分裂细胞，但假阳性和假阴性率过高，影响检查结果的准确性。

20世纪80年代分子生物学技术更新了基因标记的应用。到今天广泛使用的两种嵌合检测方法为：一种是基于性别染色体特异探针的荧光原位杂交技术（FISH），另一种是基于可变数目重复序列（VNTR）及短串联重复序列（STR）多态性的DNA片段扩增技术（STR-PCR）。FISH检测可以精确到单个细胞水平，但只能用于供、受者性别不合或常染色体有特异标记的病例。VNTR/STR多态性可以鉴别几乎所有的异基因供-受者对，但不能精确到单个细胞水平。两种方法都有较高的灵敏性和特异性，都能提供定量的结果。两种方法都很适合临床实验室应用，都可以分析存档的标本。最近随着荧光定量PCR（RQ-PCR）技术的推广，出现了基于双等位基因多态性位点的荧光定量高敏嵌合检测的报道，该方法比STR-PCR及荧光原位杂交方法有更高的灵敏度，并且可以提供准确定量结果。近年来随着二代测序技术的发展，出现了二代测序嵌合分析的报道，选取多个SNP位点或HLA中的多态性位点应用二代测序技术分析嵌合度，具有较高的敏感性，但还未见大规模的临床应用数据报道。

采用Southern印迹杂交法检测RFLP：目前已发现并克隆出多种具有高识别率（90%～99%）的DNA片段。用这些片段做探针与经限制性内切酶消化并电泳分离的DNA杂交，可发现不同长度的DNA片段具有个体特异性。经常应用的多是单个位点特异性探针，灵敏度为1%～10%。由于HSCT供、受者常为同胞，同胞之间每个位点至少有25%的概率相同，因此各种单位点特异性探针用于HSCT，其识别率最多不超过75%，因此，为达到对几乎所有BMT受者能进行植活监测，常需使用一系列位点特异性探针。多位点特异性探针可同时识别多个位点，形成可用于个体识别的RFLP，这一技术用于HSCT植活状态监测，几乎可用于所有患者。与普通RFLP法相比，所形成图谱条带太多，分析比较困难，灵敏度也较前者为低。

基于性别染色体特异探针的FISH，相比较传统的染色体中期分裂象细胞遗传学分析有许多的优点。FISH简单并且高度节省时间，可以对中期细胞及间期细胞同时分析。可以同时分析基因标记，形态标记及单个细胞表面标记。可以同时分析大量细胞，有较高的准确性和灵敏性。最初用于嵌合检测的分子细胞遗传学技术报道了应用Y染色体特异的DNA重复序列探针进行FISH分析，男性出现假阴性的上限为5.6%，女性出现假阳性的上限为2.7%。

该方法也存在一定的局限性：老年男性可能存在与年龄有关的Y染色体丢失，可能存在与肿瘤细胞核型相关的Y染色体丢失，还可能存在Y染色体探针靶序列部分的结构性改变。由于以上缺陷，在检测样本前应该用传统的核型方法或荧光原位杂交法确定Y染色体的完整性。用Y染色体特异探针显示没有信号的细胞来自女性，由于技术错误影响杂交也可能造成Y染色体特异探针没有信号显示。这一问题可以通过混合应用X和Y染色体特异探针进行双色检测来解决。应用双色检测，男性出现XX细胞假阳性的上限为0.63%，女性出现XY假阳性的上限为0.30%。这种应用性染色体标记的分子遗传学方法主要缺点是只能用于性别不同的供-受者对。

人类基因的特定核心序列存在重复串联序列，在某一特定位点不同个体串联重复序列数目不同。VNTR序列的微卫星核心长度为8～50个碱基，STR序列的微卫星核心长度为2～8个碱基。某一位点串联重复序列数目多态性的遗传遵守孟德尔遗传法则。人类基因中存在着大量的微卫星位点，某些位点的等位基因大于25个。在少至6个位点时异基因同胞供-受者对就能找到有信息的供者及受者标记。

VNTR及STR的多态性通过PCR扩增特定的DNA片段可以很方便地确定。寡核苷酸引物设计在互补链的非多态性的两端，通过变性、退火及延伸的反复循环，供者及受者来源的DNA片段得到10 ⁶～10 ⁹的扩增，能够用溴化乙锭或银染来分析。当应用荧光引物时，反应产物可用毛细管电泳及荧光检测器来检测。通过在一管中同时扩增几个位点来提高检测效率。同时扩增几个位点的多重扩增有利于找到有信息位点，在解释结果时仍需要供者及移植前受者的标本。多重扩增反应设计时采用信息度高的位点，位点的信息度与其在人群中的杂合频率有关。

DNA扩增法使得极其少量的起始样本也能进行嵌合分析，可以克服由于植入失败或白细胞减少症时起始标本少的弊病。检测的灵敏度可达1%～5%，根据片段的长度及扩增效率有所不同，在某些病例可达到0.1%。DNA扩增法会因污染产生干扰，通过同时扩增移植后标本，供者及移植前患者标本，可以很清楚地确定供者特异或受者特异的扩增，避免背景条带引起的干扰。当加入标准物时，可以进行定量分析。当等位基因长度差别较大时会对结果有影响，因为短片段会优先扩增。技术本身的缺陷如重叠峰也会影响结果，重叠峰由于扩增产物含有比正常片段少一个重复序列的片段引起。可以通过平均几个有信息位点的结果来提高准确性，文献报道有专门描述结果的术语及相关的计算机软件。STR多重扩增的优点是可以用于所有的供-受者对，不受供、受者性别的限制。这也是该方法优越于性染色体荧光原位杂交法的地方。

当某些Y染色体特异的序列用于荧光定量扩增时，在女性受者中检测到男性细胞的灵敏度达到0.01%。一些VNTR/STR以外的双等位基因多态性位点也用于定量高敏嵌合检测。有两种类型的位点：第一种是针对单核苷酸多态性或几个碱基插入及缺失多态性设计特异寡核苷酸引物来区分供、受者，分析条件需要严格控制确保特异引物只与一个等位基因结合，从而选择性的扩增有信息的供者或受者位点。第二种是针对长片段的插入或缺失多态性或等位基因缺失设计特异引物来区分供、受者，文献报道应用7～11个第一种位点，90%的供-受者对能找到有信息位点；应用10个第二种位点，80%的供-受者对找到至少一个受者型位点。Willasch等报道应用29个双等位基因多态性位点，96%的受者型基因能够得到鉴别（ n=317），平均有信息点数为2.5（1～7），在83.3%的分析中敏感度可达0.1%。Qin等应用29个双等位基因多态性位点，97%的受者型基因能够得到鉴别（ n=101），平均有信息点数为2.5（1～7），敏感度可达0.1%。

应用荧光实时定量PCR扩增以上位点是在PCR扩增指数期对起始模板进行定量分析，而VNTR/STR位点扩增产物是在PCR扩增平台期分析，因此荧光实时定量法有极高灵敏度可达0.01%～0.1%，可信区间为+30%～-25%，当供者细胞超过50%时，用受者特异位点检测，当受者细胞超过50%时，用供者特异位点检测可以提高检测结果的准确性。

近年来二代测序技术快速发展，二代测序技术有着高通量、自动化程度高、速度快等优点，在医学检测的各个方面得到了广泛的应用。Debeljak等选择了HLA-A区域的18个多态性位点进行二代测序分析，方法的检出限可达0.01%。Aloisio等报道应用44个SNP位点组合进行二代测序分析，能鉴别供受者的特异位点数均值为16个，方法的检出限为1%，但目前还未见大规模的临床应用数据报道。